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Articolo metodologico

Un modello di topo a carenza di estrogeni in vivo per lo screening dei trattamenti estrogeni esogeni della disfunzione cardiovascolare dopo la menopausa

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DOI:

10.3791/59536

⸱

13 agosto 2019

 ,  , 
1Institute of Medicinal Plant Development (IMPLAD), Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2Shandong University of Traditional Chinese Medicine

In questo articolo

Sommario

Clinicamente, carenza di estrogeni nelle donne in menopausa può aggravare l'incidenza di perturbazione dei lipidi e aterosclerosi. Abbiamo stabilito un modello di carenza di estrogeni in vivo mediante ovariectomia bilaterale attraverso una doppia incisione dorsale-laterale nei topi apoe-/-. Il modello murino è applicabile per lo screening dei trattamenti estrogeni esogeni della disfunzione cardiovascolare dopo la menopausa.

Abstract

Le donne in postmenopausa sono più a rischio di sviluppare malattie cardiovascolari rispetto alle donne in premenopausa. I topi femminili ovarictomizzati (OVX) al display di svezzamento hanno aumentato le lesioni aterosclerotiche nell'aorta rispetto ai topi femminili con funzione ovarica intatta. Tuttavia, i modelli di laboratorio che coinvolgono topi estrogeno-carenti con status aterosclerosi-incline sono carenti. Questo deficit è cruciale perché la carenza di estrogeni clinici nelle donne in menopausa può aggravare l'incidenza di interruzione e aterosclerosi dei lipidi preesistenti o in corso. In questo studio, stabiliamo un modello murino estrogeno-carente in vivo con ovariectomia bilaterale tramite una doppia incisione dorsale laterale in apolipoproteina E (apoE)-/- topi. Confrontiamo quindi gli effetti di 17-estradiolo e pseudoprotodioscina (PPD) (un fitoestrogeno) somministrati peroralmente tramite diffusione di nocciole. Troviamo che anche se il PPD esercita un certo effetto sulla riduzione del peso corporeo finale e del plasma TG in ovulazione OVX-/- topi, ha capacità anti-aterosclerotiche e cardiache-protettive paragonabili alla sua controparte 17-estradiolo. PPD è un fitoestrogeno che è stato segnalato per esercitare proprietà anti-tumorali. Pertanto, il metodo proposto è applicabile per lo screening dei fitoestrogeni tramite somministrazione perorale per sostituire la terapia ormonale sostitutiva tradizionale nelle donne in postmenopausa, che è stato segnalato per avere tumorigenetica potenzialmente deleteria capienza. La somministrazione perorale tramite la diffusione della nocciola non è invasiva, rendendola ampiamente applicabile a molti pazienti. Questo articolo contiene dimostrazioni passo-passo di ovariectomia bilaterale attraverso la doppia incisione dorsale laterale in apoE-/- topi e perorali 17-estradiolo o la sostituzione dell'ormone fitoestrogeno tramite diffusione di nocciole. Seguono analisi dei lipidi al plasma e delle funzioni cardiovascolari che utilizzano l'ecocardiografia.

Introduzione

Studi epidemiologici e clinici hanno dimostrato che le donne in postmenopausa sono molto più a rischio di malattie cardiovascolari rispetto alle donne in premenopausa1,2. La terapia ormonale sostitutiva (HRT) può ridurre il rischio relativo di malattia cardiovascolare a 0.37-0.793. Tra le altre complicazioni, l'aterosclerosi causata da malattie cardiovascolari è la principale causa di morte in tutto il mondo4. Tuttavia, i modelli di laboratorio che coinvolgono topi estrogeno-carenti che presentano lo stato incline all'aterosclerosi sono carenti. Questo protocollo fornisce un modello murino di carenza di estrogeni in vivo per lo screening dei trattamenti estrogeni esogeni della disfunzione cardiovascolare dopo la menopausa.

Studi precedenti dimostrano che l'applicazione dell'OVX nei roditori aterosclerotici alimentati con una dieta ad alto colesterolo può imitare le donne in postmenopausa5,6,7,8. Un modello animale riproducibile e conveniente simile allo stato aterosclerotico nelle donne in menopausa è la base della ricerca sugli estrogeni esogeni. Qui, una doppia incisione dorsale-laterale dell'ovariectomia bilaterale è stata applicata nell'aerosclerosi-prona apolipoproteina E knockout (apoe-/-) topi9,10. Rispetto all'incisione addominale media o dorsale, la doppia incisione dorsale-laterale è un metodo più facile e meno dispendioso in termini di tempo che può evitare una grave adesione e infiammazione della cavità addominale. L'amministrazione perorale tramite diffusione di nocciole (vedi Tabella deimateriali) non è invasiva e conveniente, rendendola ampiamente applicabile come modalità di amministrazione a lungo termine11. L'impianto a pellet a rilascio lento è anche popolare6. Tuttavia, gli impianti possono aggravare l'incidenza dell'infezione soprattutto nei topi sottoposti a OVX. Anche altre modalità di amministrazione non invasiva, come la spiagazione orale e la somministrazione dell'acqua, presentano molti inconvenienti. Gavage orale in genere stress topi e può causare lesioni esofagee. Somministrare l'ormone tramite acqua potabile è altamente vantaggioso; tuttavia, l'aggiunta di DMSO come emulsionante è inevitabile come estrogeni esogeni sono insolubili in acqua. Qui, abbiamo scelto la sostituzione dell'ormone perorale 17-estradiolo o fitoestrogeno tramite la diffusione di nocciole per la somministrazione a lungo termine.

Recentemente, l'effetto benefico della HRT sul sistema cardiovascolare delle donne in postmenopausa èstato contestato negli studi 12 . Da un lato, estrogeni esogeni da solo esercita un effetto benefico sul sistema cardiovascolare; d'altra parte, può combinarsi con acetato metoidrossisprogesterone per aumentare il rischio di eventi cardiovascolari. Più seriamente, HRT può portare alla progressione del tumore del seno e dell'utero, e questo effetto ha notevolmente limitato il suo uso13,14. Più interesse si è concentrato sugli effetti cardiovascolare-protettivi degli estrogeni esogeni privi di attività mitotica nelle cellule tumorali15,16,17. Studi multipli su esseri umani e animali suggeriscono che i fitoestrogeni con strutture simili a quella degli estrogeni possono svolgere un ruolo benefico nella protezione cardiovascolare15,18.

Pertanto, gli obiettivi del presente lavoro sono (i) costruire un modello murino in vivo per carenza di estrogeni mediante ovariectomia bilaterale attraverso una doppia incisione dorsale-laterale in apoE-/- topi e (ii) per confrontare gli effetti protettivi cardiovascolari del perorali somministrato 17-estradiol e pseudoprotodioscin (PPD), tramite diffusione di nocciole. 17-estradiol è un tipo di estrogeno esogeno che appartiene agli ormoni sessuali femminili6,11,19. PPD, una saponina steroide e fitoestrogeno da piante Dioscorea, è stato precedentemente segnalato per esercitare proprietà anti-tumorali20.

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Protocollo

Tutti i protocolli di cura e sperimentale per gli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Accademia cinese delle scienze mediche e del Peking Union Medical College (Autorizzazione n.: SYXK (Pechino) 2013-0023). L'origine dei topi apoE-/- è C57BL/6J9,10.

1. Ovariectomia bilaterale tramite una doppia incisione dorsale-laterale in apoE-/- Topi

  1. Allo svezzamento (età 28 giorni), anestesizzare femmina apoE-/- C57BL/6J topi con risparmio (tribromoetanolo; 200 mg/kg; intraperitonealmente).
    NOTA: 32 topi apoE-/- sono stati suddivisi in modo casuale in 4 gruppi: SHAM, OVX, OVX/E2 e gruppo OVX/PPD (n - 8 per gruppo).
  2. Posizionare l'animale in posizione prona su un pad di riscaldamento. Applicare il lubrificante per gli occhi per la protezione degli occhi durante l'anestesia.
  3. Mantenere la temperatura corporea entro 36 : 0,5 gradi centigradi. Somministrare 5 mg/kg di peso corporeo del carprofen analgesico sottocutaneo all'aspetto laterale del collo del mouse.
  4. Rasare un'area del topo 3 x 5 cm2 dalla cresta iliaca. Prima di coprire l'animale con un foglio chirurgico 3 x 5 cm2 apertura, pulire accuratamente l'area rasata con iodio e poi 70% di etanolo. Utilizzare strumenti sterili e guanti durante l'esperimento.
  5. Utilizzare forbici e pinze per fare un'incisione 1 cm laterale alla linea mediana e 1 cm laterale alle costole costali.
  6. Contunta il tessuto sottocutaneo usando le pinze.
  7. Utilizzare occhiali dissetti (vedi Tabella deimateriali) per identificare il tessuto adiposo bianco nella cavità addominale.
  8. Utilizzare microscissori e microforzaci per fare un'incisione di 0,5-1 cm attraverso la fascia fino a raggiungere la cavità addominale.
    NOT: Per il gruppo operato con finta, chiudete direttamente le ferite. Suturare lo strato muscolare e la pelle separatamente utilizzando una sutura monofilamento.
  9. Quando il tessuto adiposo bianco nella cavità addominale può essere visto, afferrare il tessuto adiposo utilizzando microforzape e tirarlo delicatamente fuori. Si può vedere un'ovaia a forma di gelso rosa avvolta dal tessuto adiposo nella cavità addominale.
  10. Ligate il recipiente prossimale di 0,5-1 cm e il corno uterino utilizzando una sutura monofilamento. Rimuovere l'ovaio utilizzando microscissors e riporre il tessuto rimanente nella cavità addominale.
    NOT: I principali sintomi avversi dell'operazione OVX sono la legatura uretetale che porta ad un'elevata mortalità nei topi ovulati da OVX. Questo può essere evitato identificando i tessuti utilizzando una maschera dissetta.
  11. Chiudi le ferite. Suturare lo strato muscolare e la pelle separatamente utilizzando una sutura monofilamento.
  12. Utilizzare forbici e pinze per fare un'altra incisione 1 cm laterale alla linea mediana e 1 cm laterale alle costole costali sull'altro lato. Ripetere la procedura precedente (da 1,5 a 1,11).
  13. Lascia che l'animale si svegli dall'anestesia. Separatamente tenere il mouse il primo giorno dopo l'intervento chirurgico.
  14. Pulire o sostituire frequentemente la gabbia durante la fase di recupero.
  15. Circa 24 h dopo l'intervento chirurgico, somministrare altri 5 mg/kg di peso corporeo del carprofene analgesico sottocutaneo.

2. Amministrazione Perorale di 17-estradiolo o PPD tramite Diffusione Nocciola

  1. Sciogliere accuratamente 17-estradiol o PPD in olio di sesamo, quindi mescolare l'olio di sesamo con la diffusione di nocciole (vedere Tabella dei materiali). Una porzione giornaliera per ogni topo da 30 g contiene 3 g di 17 estradiolo o 15 g di PPD, 4 ll di olio di sesamo e 60 mg di diffusione di nocciole. Preparare un placebo per ogni topo da 30 g contiene 4 ll l di olio di sesamo e 60 mg di diffusione di nocciole.
    NOT: La porzione di somministrazione giornaliera di 17-estradiolo o PPD si basava su studi precedenti6,11 ed esperimenti preliminari.
  2. Una settimana dopo OVX, nutrire i topi con una dieta ad alto colesterolo (1.25% colesterolo, 0% cholate) per 12 settimane. Un tipico schema di trattamento sperimentale, come utilizzato in questo studio, è illustrato nella Figura 1.
  3. 5 giorni prima della somministrazione perorale della nocciola diffusa alla settimana 4, allenare i topi a mangiare il placebo contenente circa 30 mg di diffusione di nocciole per 2-5 topi per 5 giorni. Allena i topi in gruppi nelle gabbie di casa durante i primi 3 giorni. Posizionare i topi in gabbie separate il quarto e il quinto giorno di allenamento e servire la porzione quotidiana per assomigliare alla situazione sperimentale.
  4. Durante le ultime 9 settimane, mettere i topi in gabbie separate e poi servire una porzione giornaliera della porzione di diffusione della nocciola per ogni occasione di alimentazione.
    NOT: Servire una porzione giornaliera contenente 17 ,1 mg-kg-1)o PPD (0,5 mg-kg -1) tramite diffusione di nocciole nel gruppo OVX/E2 e OVX/PPD rispettivamente; servire una porzione giornaliera contenente diffusione di nocciole senza ormoni nel gruppo SHAM e OVX.

3. Determinazione dello spessore dell'intima-media e della disfunzione cardiaca utilizzando un sistema di microultrasuoni

  1. Biomicroscopia ultrasonografica
    1. Un giorno prima della terminazione, esaminare lo spessore dell'intima media e la disfunzione cardiaca utilizzando un sistema di microultrasuoni (vedi Tabella dei materiali) come descritto in precedenza21.
    2. Prima dell'esame, dare a ogni topo un'iniezione intraperitoneale di 200 mg/kg di eproprio (tribromoetanolo) come anestesia (n - 8 topi per gruppo).
    3. Rasare i capelli del collo di ogni topo con attenzione. Applicare gel di trasmissione a ultrasuoni caldo liberamente per garantire una qualità ottimale dell'immagine.
    4. Ottenere immagini ultrasonografiche di base della radice aortica e aorta ascendente con la testa di scansione di 30 MHz a un fuoco di 12,7 mm e una risoluzione di 40 m.
    5. Utilizzare l'elettrocardiografia con una configurazione di piombo II per il monitoraggio.
    6. Acquisire le immagini a lungo termine parasternal destra dell'aorta ascendente, dell'arco aortico e del ramo dell'arteria brachiocefalica in un piano in sistole (Figura 3).
  2. Misurazioni dell'intima-media e dello spessore massimo della placca
    1. Regolare facilmente la distanza tra il trasduttore e il sito arterioso per ottenere immagini chiare.
    2. Memorizza digitalmente un loop cine da 10 s per l'esame offline su un sistema di analisi delle immagini.
    3. Scegliere manualmente un'immagine ultrasonografica a liofilda ottimale per ulteriori misurazioni. Controllare le immagini nella curvatura minore dell'aorta ascendente. Se si vede la placca nell'aorta ascendente, misurare lo spessore massimo della placca. Se la placca nell'aorta ascendente non può essere vista, misurare l'IMT massimo.
    4. Misurare l'IMT (distanza tra l'interfaccia vascolare lumino-intimale e l'interfaccia mediale-avvenimento). Misurare lo spessore massimo della placca (la distanza più spessa tra il bordo del lume vascolare e lo strato avvenziale).
    5. Dati medi provenienti datre siti di lesioni (Figura 3).
  3. Determinazione della disfunzione cardiaca con ecocardiografia
    NOTA:     Esaminare la funzione cardiaca attraverso l'ecocardiografia utilizzando un sistema di microultrasuoni, come descritto in precedenza22.
    1. Dirigere un fascio di ultrasuoni verso il cuore, vicino ai muscoli papillari.
    2. Ottieni una visualizzazione bidimensionale di kilohertz basata sull'elettrocardiogramma.
    3. Eseguire l'ecocardiografia transtoracica in vivo del ventricolo sinistro utilizzando una testa di scansione a 30 MHz.
    4. Misura i parametri associati alla funzione cardiaca digitalmente dalle tracce M-mode.
    5. Calcolare la media dei dati da tre a cinque cicli cardiaci (Tabella 1).
  4. Variabilità intra e interosservatoria
    1. Per la convalida della variabilità intraobserver, analizzare i dati di un operatore in due diverse occasioni.
    2. Per valutare la variabilità dell'interosservato, analizzare i dati da un operatore diverso.

4. Misurazione settimanale del peso corporeo e colesterolo totale al plasma (TC) e determinazione del trigliceridi (TG)

  1. Misurazione settimanale del peso corporeo
    1. Misurare i pesi corporei una volta alla settimana dalla settimana -1 alla settimana 12.
      N.B.: n - 8 topi per gruppo.
  2. Preparazione del plasma
    1. Prima di raccogliere campioni di sangue attraverso la puntura intracardiaca, preparare siringhe e tubi. Utilizzare EDTA come anticoagulante. Aggiungete 10 di EDTA da 0,5 M a ogni siringa da 2 mL e aggiungete 8 M EDTA a ciascun tubo da 1,5 mL.
    2. Alla settimana 12, dopo un digiuno notturno, anestesizzare i topi con la frantina (tribromoetanolo; 200 mg/kg; intraperitonealmente).
      N: n - 3 topi per gruppo.
    3. Preparare la zona ventrale del torace con il 70% di etanolo.
    4. Utilizzare forbici e pinze per aprire la cavità toracica e tagliare le costole fino a quando il cuore battente è esposto.
    5. Inserire l'ago da 25 G nel ventricolo destro. Aspirare lentamente fino a quando il sangue inizia a fluire nella siringa.
      NOT: Usiamo siringhe usa e getta in condizioni sterili con aghi da 25 G (vedi Tabella deiMateriali).
    6. Continuare ad aspirare con pressione costante e uniforme. Se non si vede sangue, riposizionare l'ago e ripetere l'aspirazione.
    7. Tenere i topi profondamente anestesizzati prima di raccogliere il volume di sangue richiesto. Normalmente, fino a 1 mL di sangue può essere raccolto. Eutanasia i topi dalla lussazione cervicale in questa profonda condizione anestetica.
    8. Pipette campioni di sangue in tubi da 1,5 mL e invertire accuratamente il sangue per garantire la miscelazione EDTA nel sangue. Quindi mettere campioni di sangue sul ghiaccio immediatamente.
    9. Centrifuga per 20 min a 400 x g a 4 gradi centigradi entro 30 min di raccolta.
    10. Raccogliere il supernatante con attenzione. Aliquota e conservare campioni di plasma a -80 gradi centigradi.
  3. Costruire curve standard per la misurazione del contenuto TC o TG
    1. Per la curva standard TC, preparare varie concentrazioni di standard di colesterolo: 0 mmol/L, 0,52 mmol/L, 1,03 mmol/L, 2.07 mmol/L, 4.14 mmol/L, 6.20 mmol/L, 8.27l mmol/L e 10.34 mmol/L. Measure O.D. per ciascuno standard di colesterolo. Impostare l'OD media per ogni standard di colesterolo. Come valore dell'asse verticale (Y), impostare la concentrazione come valore dell'asse orizzontale (X). Creare una curva standard utilizzando un software statistico.
    2. Per la curva standard TG, preparare varie concentrazioni di standard TG: 0 mmol/L, 0,45 mmol/L, 0,90 mmol/L, 1.81 mmol/L, 3.62 mmol/L, 5.42 mmol/L, 7.23 mmol/L e 9.04 mmol/L. Measure O.D. per ogni standard TG. Impostare l'OD media per ogni standard TG come valore dell'asse verticale (Y); impostare la concentrazione come valore dell'asse orizzontale (X). Creare una curva standard utilizzando un software statistico.
      NOT: Per la costruzione di curve standard nel presente studio è stata utilizzata una curva logistica di quattro parametri (4-pl). Controllare la curva standard prima di misurare i campioni di plasma e assicurarsi che r2 sia maggiore di 0,995.
  4. Misurazione del contenuto TC
    1. Etichettare la bottiglia di reagente di colore (25 mL) dal kit di saggio TC come "TC Working Solution".
    2. Vortice i campioni refrigerati brevemente. Preparare le diluizioni: 20 l di plasma in 80 - L di acqua distillata. Diluizioni di vortice brevemente.
    3. Aggiungere 2,5 - L di standard di colesterolo (5,17 mmol/L) o 2,5 litri di plasma diluito o 2,5 litri di acqua distillata (vuota) ai pozzi appropriati di una piastra di 96 pozze. Si consiglia triplicazione.
    4. A tutti i pozze, aggiungere 250 l del reagente di colore.
    5. Incubare a 37 gradi centigradi per 10 min.
    6. Accendere il lettore di micropilla e lasciare un riscaldamento di 10 min.
    7. Togliere le placche dall'incubatrice e leggere il lettore di microplacino a 510 nm. Assicurarsi che non siano presenti bolle o polveri nei pozzi dei microtiteri o sul fondo della piastra, rispettivamente.
    8. Calcolare la concentrazione di TC come segue:
      TC cont. - standard di colesterolo cont. - (campione di plasma O.D.-vuoto O.D)/(standard di colesterolo O.D.-vuoto O.D)
  5. Misurazione del contenuto TG
    1. Etichettare la bottiglia di reagente di colore (25 mL) dal kit di saggio TG come "TG Working Solution".
    2. Vortice i campioni refrigerati brevemente.
    3. Aggiungete 2,5 l di standard TG (2,26 mmol/L) a o 2,5 l di plasma diluito o 2,5 l di acqua distillata (vuota) ai pozzi appropriati di una piastra di 96 pozzetti. Si consiglia triplicazione.
    4. A tutti i pozze, aggiungere 250 l del reagente di colore.
    5. Incubare a 37 gradi centigradi per 10 min.
    6. Accendere il lettore di micropilla e lasciare un riscaldamento di 10 min.
    7. Togliere le placche dall'incubatrice e leggere il lettore di microplacino a 510 nm.
      NOT: Assicurarsi che non siano presenti bolle o polvere nei pozzetti dei microtiteri o sul fondo della piastra.
    8. Calcolare la concentrazione di TG come segue:
      TG cont. - Standard TG cont. - (campione di plasma O.D.-blank O.D)/(standard TG O.D.-blank O.D)

5. En Face Analisi di Lesioni Aorrosclerotiche

  1. Isolamento ed escissione dell'Aorta
    1. Alla settimana 12, dopo un digiuno notturno, anestesizzare i topi con la frantina (tribromoetanolo; 200 mg/kg; intraperitonealmente). Eutanasia i topi dalla lussazione cervicale in questa profonda condizione anestetica.
      NOT: Abbiamo usato 3 topi per gruppo.
    2. Preparare la zona ventrale del torace con il 70% di etanolo. Utilizzare forbici e pinze per aprire la cavità toracica e tagliare le costole fino a quando il cuore battente è esposto.
    3. Riempire una siringa da 50 mL con salina tamponata di fosfato al pH 7.4 (vedere Tabella dei materiali). Inserire 25 G di ago nel ventricolo sinistro e tagliare l'atrio destro per evitare l'alta pressione della perfusione.
    4. Eseguire la perfusione in situ ad una portata di 0,05-0,08 mL/min. Assorbo fluido perfusione con tessuti.
    5. Rimuovere costole e polmoni nella cavità toracica con forbici e pinze. Quindi, aprire la cavità addominale e rimuovere gli organi all'interno per una migliore vista dell'aorta.
    6. Rimuovere l'aorta tenendo il cuore con le microforzape e separando l'aorta dalla colonna vertebrale dorsalmente con microscissors fino alla biforcazione iliaca.
      NOT: Quando si seziona vicino ai rami atriale renali, tagliare profondamente utilizzando microscissors per evitare danni all'aorta.
    7. Fissare il cuore e l'aorta per 48 h in 4% paraformaldeide. Conservare le aortas in salina a temperatura ambiente o a 2-8 gradi centigradi per alcune ore.
      NOT: Questa procedura faciliterà la pulizia.
  2. Preparazione di aorta
    1. Togliete il cuore. Rimuovere con attenzione i tessuti avventiziani dalle aortas utilizzando microforcep e microscissors sotto uno stereoscopio. Utilizzare salina per mantenere il tessuto umido durante la pulizia.
      NOT: Fare attenzione a non strappare o intasare l'aorta e alcuni rami importanti, come l'arteria innominata, sinistra arteria carotide comune, e sinistra arteria subclavia.
    2. Lasciare 1 mm dell'innomina e ha lasciato le comuni arterie carotidee e tagliare l'intera arteria subclaviane sinistra.
    3. Tagliare aprire la curvatura esterna attraverso l'arteria innominata, poi a sinistra comune carotide, e poi a sinistra arteria subclavia.
    4. Tagliare aperto lungo la curvatura interna della porzione ascendente sul fondo della porzione addominale.
    5. Pin l'aorta piatta su un foglio di plastica nera e applicare salina per evitare che le aortas si asciughino.
  3. Immagine della regione intima di aorta
    1. Scatta foto di aortas en face con un microscopio stereo. Includere un righello in scala millimetrico nelle immagini per calibrare le misure.
    2. Includere l'arco e le regioni toraciche nella stessa immagine e la regione addominale in un'altra. Salvare le immagini in formato JPEG o TIFF.
      NOT: La regione dell'arco è dalla giunzione del miocardio a 3 mm distale dall'arteria subclaviana sinistra, la regione toracica è di 3 mm distale all'arteria subclaviana sinistra all'ultima arteria intercostale, e la regione addominale è l'ultima arteria intercostale al iliaco Biforcazione.
  4. Quantificazione del metodo di lesione-faccia aterosclerotica
    1. Calibrazione
      1. Aprire l'immagine con il software di analisi delle immagini (vedere Tabella dei materiali), passare a Calibrazione spaziale e seguire le istruzioni.
      2. Modificare le unità di riferimento in mm posizionando il righello sulla linea.
    2. misura
      1. Impostare la calibrazione corretta per ogni immagine.
      2. Misurare 3 mm sul righello.
      3. Misurazione della regione ad arco e toracica: delineare la regione dell'arco dalla giunzione del miocardio a 3 mm distal dall'arteria subclaviana sinistra e la regione toracica da 3 mm dissarte all'arteria subclaviana sinistra all'ultima arteria intercostale. Tracciale nell'arco e nella regione toracica e guarda l'aorta attraverso il microscopio.
      4. Misurazione della regione addominale: Delineare la regione addominale dalla fine della regione toracica alla biforcazione iliaca. Traccia le lesioni nella regione addominale e guarda l'aorta attraverso il microscopio.
      5. Calcolare l'area di lesione rispetto alla superficie interna dell'aorta.
      6. Verificare la quantificazione attraverso un secondo osservatore che è cieco ai gruppi di studio.

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Risultati

Un tipico schema di trattamento sperimentale, come utilizzato in questo studio, è illustrato nella Figura 1. Allo svezzamento (età 28 giorni), i topi femminili apoE-/- C57BL/6J sono stati anestesizzati withavertin (tribromoethanolo; 200 mg/kg; intraperitonealmente). I topi erano omeno CON osorgi bilaterali da OVX o sham attraverso un'incisione dorsale di 1 cm. Una settimana dopo l'OVX bilaterale, i topi sono stati alimentati con una dieta ad alto c...

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Discussione

La metodologia qui descritta è un modello murino simile alla rottura dei lipidi e all'aterosclerosi osservata nelle donne in menopausa. È ben documentato che la carenza di estrogeni nelle donne in postmenopausa può aggravare l'incidenza di ipercolesterolemia preesistente o in corso con lesioni ateroscolistiche progressivamente complesse e diffuse1. Per imitare lo stato di aterosclerosi-incline in clinica, topi apoE-carenti, una fonte riproducibile e conveniente di animali con cui studiare l'aterog...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81202526 a J.X.), la National Natural Science Foundation of China (81302769 a B.S.), la Beijing Municipal Natural Science Foundation (47144226 a B.S.), la Chinese Postdoctoral Foundation Science Foundation (20110490325 a J.X.) e la Ph.D. Programs Foundation of Ministry of Education of China (20121106120031 a B.S.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
17β-estradiolo, >98%estrogeniSigma-AldrichE8875-250MG
(con aghi da 25 G)Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd0,5 * 19TWLBSanguinamento cardiaco
Dieta per topi ad alto colesteroloHuafukang Bio-TechnologyN / A1,25% colesterolo, 0% di colato
Sistema di micro-imagingin vivo ad alta risoluzioneVisualSonicsVevo 770Misurazioni dello spessore intima-media e della disfunzione cardiaca
2-metil-2-butanoloSigma-Aldrich152463-250MLPreparazione di avertin
Micro Pinze da dissezione, curve da 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdStrumenti chirurgici
pinze da dissezione, diritte da 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdStrumenti chirurgici
Forbici per micro dissezione, curve/affilate 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdStrumenti chirurgici
Forbici per micro dissezione, dritte/affilate 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdStrumenti chirurgici
Sutura monofilamento 4-0 1/2 5 x 12 19 mmShanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LtdR413Sutura e legatura dei tessuti
Crema di noci (Nutella)FerreroN/Abinoculare perorale 17β-estradiolo o PPD
OptiVisor in vetro otticoDohegan Optical Company Inc.N/AAssistente per l'identificazione dei tessuti durante l'ovariectomia
Soluzione salina tamponata con fosfato a pH 7,4SIGMAP3813Preparazione di 1 L di soluzione salina
Pro MultiLabel Lettore di micropiastreTecanInfinite M1000Determinazione del TC e del TG
al plasma PseudoprotodioscinaShanghai Winherb Medical S & T DevelopmentW-0427Registro CAS n. 102115-79-7
Rimadyl, 50 mg/mLPfizer Pharma GmbH462986Analgesia postoperatoria dopo ovariectomia
Olio di sesamoSigma-AldrichS3547-1LSciogliere il 17β-estradiolo o PPD
Solcoseryl Eye-GelMenarini, Solco Basle Ltd.Protezione degli occhi durante l'anestesia
StereomicroscopioMCALONMCL-6STVImmagine della regione intimale dell'aorta Modello da
tavolo centrifuga ad alta velocitàSIGMA1-14KPreparazione del plasma
Forbici, curva leggera (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdStrumenti chirurgici
Forbici, dritte piatte (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdStrumenti chirurgici
Pinze per tessuti, seghettate, leggermente curve (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdStrumenti chirurgici
Pinze per tessuti, seghettate, diritte Piatte (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdStrumenti chirurgici
TribromoetanoloSigma-AldrichT48402-5GKit per il
dosaggio dei trigliceridi (TG)Istituto di Nanchino Jiancheng Biologia IngegneriaA110-1Determinazione del TG
plasmatico Kit di dosaggio del colesterolo totale (TC)Istituto di Nanchino Jiancheng Biologia IngegneriaA111-1Determinazione del TC plasmatico
Siringhe monouso per Micro Medium per lente d'ingrandimento dell'avertina

Riferimenti

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