Questo metodo fornisce un quadro per studiare l'incorporazione di acidi grassi esogeni da sorgenti ospiti complesse in membrane batteriche, in particolare Staphylococcus aureus. Per raggiungere questo obiettivo, vengono descritti i protocolli per l'arricchimento delle particelle di lipoproteina dal tuorlo di uova di gallina e la successiva profilazione dell'acido grasso di fosfatidi batterici che utilizzano la spettrometria di massa.
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Articolo metodologico
Isolamento delle particelle di lipoproteina dal tuorlo di uovo di pollo per lo studio dell'incorporazione di acido acido grasso patogeno batterico in fosfolipidi di membrana
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo stafilococco aureus e altri patogeni positivi al Gram incorporano acidi grassi dall'ambiente nei fosfolipidi della membrana. Durante l'infezione, la maggior parte degli acidi grassi esogeni sono presenti all'interno delle particelle di lipoproteina dell'ospite. Permangono incertezze per quanto riguarda i serbatoi di acidi grassi ospiti e i meccanismi con cui i batteri estraggono gli acidi grassi dalle particelle di lipoproteina. In questo lavoro, descriviamo protocolli per l'arricchimento di particelle di lipoproteina a bassa densità (LDL) dal tuorlo d'uovo di gallina e determinando se i LDL fungono da serbatoi di acido grasso per S. aureus. Questo metodo sfrutta l'analisi lipidomica imparziale e gli LDL di pollo, un modello efficace ed economico per l'esplorazione delle interazioni tra LL e batteri. L'analisi dell'integrazione di S. aureus degli acidi grassi esogeni da LDL viene eseguita utilizzando spettrometria di massa ad alta risoluzione/accurata e spettrometria di massa tandem, consentendo la caratterizzazione della composizione dell'acido grasso del batterio identificazione imparziale e di nuove combinazioni di acidi grassi che sorgono nei lipidi della membrana batterica dopo l'esposizione a l'LDL. Queste tecniche avanzate di spettrometria di massa offrono una prospettiva senza precedenti di incorporazione di acidi grassi rivelando gli acidi grassi esogeni specifici incorporati nei fosforidi. I metodi qui descritti sono adattabili allo studio di altri patogeni batterici e fonti alternative di acidi grassi complessi.
Introduzione
S. aureus resistente alla meticolina (MRSA) è la causa principale dell'infezione associata all'assistenza sanitaria e la resistenza agli antibiotici associata è una sfida clinica considerevole1,2,3. Pertanto, lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche è una priorità assoluta. Una promettente strategia di trattamento per gli agenti patogeni Gram-positivi sta inibendo la sintesi degli acidi grassi, un requisito per la produzione di fosforidi di membrana che, in S. aureus, include fosfatidylglycerol (PG), lysyl-PG e cardiolipina4. Nei b....
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Protocollo
NOTA: Il seguente protocollo per l'arricchimento delle particelle LDL dal tuorlo d'uovo di gallina è derivato da Moussa et al. 200233.
1. Preparazione del tuorlo d'uovo di gallina per l'arricchimento delle particelle LDL
- Sanitizzare due grandi uova di gallina lavando le conchiglie con soluzione di etanolo del 70% e lasciare asciugare all'aria.
- Sanificare il separatore delle uova utilizzando una soluzione di etanolo 70% e lasciare asciugare all'aria. Fissare il separatore dell'uovo sul labbro di un becher di medie dimensioni.
- Crack ogni uovo singolarmente nel separatore di uova e lasciare....
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Risultati
Il protocollo per l'arricchimento di LDL dal tuorlo d'uovo di gallina è illustrato nella figura 1. Questo processo inizia diluindo il tuorlo d'uovo intero con la salina e separando i solidi del tuorlo d'uovo indicati come granuli dalla frazione solubile o plasma contenente i LDL (Figura 1)33. Il contenuto di LDL della frazione plasmatica è ulteriormente arricchito dalla precipitazione del kDa 30-40 dollari.......
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Discussione
S. aureus incorpora acidi grassi esogeni nei suoi fosfolipidi di membrana27,32,43. La sintesi fosforalipidea utilizzando acidi grassi esogeni bypassa l'inibizione fasiLi ma altera anche le proprietà biofisiche della membrana27,32,44. Mentre l'incorporazione di acidi grassi esogeni nei fosfolipidi di patogeni Gram-positivi è ben.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno divulgazioni.
Ringraziamenti
Ringraziamo i membri del laboratorio Hammer per la loro valutazione critica del manoscritto e il sostegno di questo lavoro. Il Dr. Alex Horswill della University of Colorado School of Medicine gentilmente fornito AH1263. Il laboratorio Dr. Chris Waters della Michigan State University ha fornito reagenti. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione 16SDG30170026 dell'American Heart Association e dai fondi di start-up forniti dalla Michigan State University.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Solfato di ammonio | Fisher | BP212R-1 | ≥ Incubatore per colture cellulari puro al 99,5% |
| Thermo | MaxQ 6000 | ||
| Centrafuge | Thermo | 75-217-420 | Sorvall Legen XTR, rotore F14-6x250 LE |
| Piastra per test Costar | Corning | 3788 | 96 pozzetti |
| da filtro | Schleicher & Schuell | 597 | |
| Uovo di gallina grande | N/A | N/A Spettrofotometro | da un negozio comune |
| BioTek | Epoca 2 | ||
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| S. aureus ceppo AH1263 | N/A | N/A | Fornito da Alex Horswill dell'Università del Colorado |
| Tubo per dialisi | Pierce | 68700 | 7.000 MWCO |
| Tryptone | Becton, Dickison and Company | 211705 | |
| perline di ossido di zirconio da 0,5 mm | Next Advance | ZROB05 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24B | |
| Metanolo (grado LC-MS) | Fisher | A4561 | |
| Cloroformio (grado reagente) | Fisher | MCX10559 | |
| Isopropanolo (grado LC-MS) | Fisher | A4611 | |
| Dimiristoilfosfatidilcolina | Avanti Polar Lipids | 850345C-25mg | |
| Bicarbonato di ammonio | Sigma | 9830 | ≥ |
| Formiato di ammonio | Sigma | 70221-25G-F | |
| Software Xcalibur | Thermo Scientific | OPTON-30801 | |
| LTQ-Orbitrap Spettrometro di massa | Velos Thermo Scientific | ad alta risoluzione/massa accurata MS | |
| 1260 capillare HPLC | Agilent | ||
| SpeedVac Concentratori sottovuoto | Thermo Scientific |
Riferimenti
- Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
- Noskin, G. A., et al.
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Ristampe e permessi
