Isolamento delle particelle di lipoproteina dal tuorlo di uovo di pollo per lo studio dell'incorporazione di acido acido grasso patogeno batterico in fosfolipidi di membrana

S. aureus resistente alla meticolina (MRSA) è la causa principale dell'infezione associata all'assistenza sanitaria e la resistenza agli antibiotici associata è una sfida clinica considerevole^1,2,3. Pertanto, lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche è una priorità assoluta. Una promettente strategia di trattamento per gli agenti patogeni Gram-positivi sta inibendo la sintesi degli acidi grassi, un requisito per la produzione di fosforidi di membrana che, in S. aureus, include fosfatidylglycerol (PG), lysyl-PG e cardiolipina⁴. Nei batteri, la produzione di acidi grassi avviene attraverso la via di sintesi degli acidi grassi II (FASII)⁵, che è notevolmente diversa dalla controparte eucatriste, rendendoI un obiettivo attraente per lo sviluppo antibiotico^5,6 . Gli inibitori del FASII si rivolgono principalmente a FabI, un enzima necessario per l'allungamento della catena del carbonio dell'acido grasso⁷. L'inibitore FabI triclosan è ampiamente utilizzato nei beni di consumo e medici^8,9. Ulteriori inibitori FabI sono in fase di sviluppo da diverse aziende farmaceutiche per il trattamento di S. aureus infezione^{10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26}. Tuttavia, molti patogeni Gram-positivi, tra cui S. aureus, sono in grado di raccogliere acidi grassi esogeni per la sintesi fosforolipidi, bypassando l'inibizione del FASII^27,28,29. Così, il potenziale clinico degli inibitori del FASII è discusso a causa di notevoli lacune nella nostra conoscenza delle fonti di acidi grassi ospiti e dei meccanismi con cui gli agenti patogeni estraggono gli acidi grassi dall'ospite^27,28. Per colmare queste lacune, abbiamo sviluppato un metodo di analisi lipidomica imparziale per monitorare l'incorporazione di acido grasso esogeno dalle particelle di lipoproteina in fosfolipidi della membrana di S. aureus.

Durante la sepsi, le particelle di lipoproteina ospite rappresentano una potenziale fonte di acidi grassi derivati dall'ospite all'interno della vascolatura, poiché la maggior parte degli acidi grassi ospiti sono associati alle particelle³⁰. Le lipoproteine sono costituite da un guscio idrofilo composto da fosfolipidi e proteine che racchiudono un nucleo idrofobico di trigliceridi e esteri di colesterolo³¹. Quattro classi principali di lipoproteine - chylomicron, lipoproteina a bassissima densità, lipoproteina ad alta densità e lipoproteina a bassa densità (LDL) - sono prodotte dall'ospite e funzionano come veicoli di trasporto lipidico, fornendo acidi grassi e colesterolo da e verso cellule ospiti attraverso la vascolatura. I LDL sono abbondanti in acidi grassi esterificati tra cui trigliceridi e tende di colesterolo^{31 .} Abbiamo già dimostrato che gli LDL umani altamente purificati sono una fonte vitale di acidi grassi esogeni per la sintesi di PG, fornendo così un meccanismo per il bypass dell'inibitore di FASII³². Purificanti LDL umani può essere tecnicamente impegnativo e richiede molto tempo, mentre le fonti commerciali di LDL umani purificati sono proibitivi da utilizzare su base di routine o per eseguire schermi batterici su larga scala. Per affrontare queste limitazioni, abbiamo modificato una procedura per l'arricchimento dei LDL dal tuorlo d'uovo di gallina, una ricca fonte di particelle di lipoproteina³³. Abbiamo utilizzato con successo spettrometria di massa ad alta risoluzione, ad alta risoluzione/accurata e spettrometria di massa tandem per monitorare l'incorporazione di acidi grassi derivati da LDL umani nella membrana di S. aureus³². A differenza dei metodi precedentemente riportati, questo approccio può quantificare i singoli isomeri di acidi grassi per ciascuno dei tre principali tipi di fosfolipidi stafilocchidi. L'acido oleico (18:1) è un acido grasso insaturi presente all'interno di tutte le particelle di lipoproteina ospite che è prontamente incorporato nei fosfolipidi S. aureus ^29,30,32. S. aureus non è in grado di sintesi di acido oleico²⁹; pertanto, la quantità di acido oleico incorporato al fosfolipidi desta la presenza di acidi grassi di origine lipoproteina ospite all'interno della membrana stafilocca²⁹. Queste specie di fosfolipidi possono essere identificate con il metodo di spettrometria di massa all'avanguardia descritto qui, offrendo una risoluzione senza precedenti della composizione della membrana di S. aureus coltivata in presenza di una fonte di acido grasso che probabilmente durante l'infezione.

NOTA: Il seguente protocollo per l'arricchimento delle particelle LDL dal tuorlo d'uovo di gallina è derivato da Moussa et al. 2002³³.

1. Preparazione del tuorlo d'uovo di gallina per l'arricchimento delle particelle LDL

1. Sanitizzare due grandi uova di gallina lavando le conchiglie con soluzione di etanolo del 70% e lasciare asciugare all'aria.
2. Sanificare il separatore delle uova utilizzando una soluzione di etanolo 70% e lasciare asciugare all'aria. Fissare il separatore dell'uovo sul labbro di un becher di medie dimensioni.
3. Crack ogni uovo singolarmente nel separatore di uova e lasciare che l'albume di fluire nel becher. Il tuorlo d'uovo intatto sarà trattenuto dal separatore.
4. Lavare il tuorlo d'uovo due volte con 30 mL di salina sterile con buffer di fosfato (PBS) per rimuovere gli albumi residui.
5. Mettere delicatamente il tuorlo d'uovo sulla carta da filtrare.
6. Forare la membrana vitelline con una punta sterile pipetta e drenare il contenuto della membrana in un tubo di centrifuga conica sterile 50 mL. Scartare la membrana e filtrare la carta.

2. Frazione del plasma contenente LDL dal tuorlo d'uovo di gallina

1. Aggiungere circa due volumi di 0,17 M NaCl a pH 7.0 al tuorlo d'uovo e mescolare vigorosamente. Quindi mescolare questa soluzione a 4 gradi centigradi per 60 min.
2. Centrifugare la diluizione del tuorlo d'uovo a 10 gradi centigradi a 10.000 x g per 45 min. Rimuovere la frazione plasma (supernatante) dalla frazione granulare (pellet) in uno sterile tubo conico da 50 mL.
3. Ripetere il passaggio 2.2.

3. Isolamento delle particelle LDL dal plasma

1. Mescolare la frazione di plasma con il 40% di solfato di ammonio (w/v) a 4 gradi centigradi per 60 min.
2. Regolare il pH della frazione di plasma con una soluzione NaOH da 420 mM a 8,7.
3. Centrifugare la diluizione del tuorlo d'uovo a 4 gradi centigradi a 10.000 x g per una durata di 45 min. Rimuovere la frazione gialla semisolida superiore in 7 kDa polisi dimensione tubo. Fornire spazio nel tubo per consentire che si gonfi.
4. Diallyze durante la notte a 4 gradi centigradi in 3 L di acqua ultrapura per rimuovere il solfato di ammonio. Agitare delicatamente l'acqua con una barra di agitazione.
5. Trasferire la soluzione dialisata in un tubo di centrifuga conicale sterile da 50 ml.
6. Centrifugare la soluzione a 4 gradi centigradi a 10.000 x g per una durata di 45 min. rimuovere con attenzione la frazione gialla semisolida superiore in un tubo sterile e conservare a 4 gradi centigradi.

4. Valutazione dei LDL di pollo come fonte di acidi grassi

1. Sottocoltura S. cellule aureus in 5 mL di brodo di tripone privo di acidi grassi 1% e incubare durante la notte a 37 sC con agitazione (225 rpm). Per gli auxotrofi di acidi grassi, integrare le colture con una fonte di acidi grassi.
2. Diluire le colture notturne a una densità ottica (OD) a 600 nm (OD₆₀₀) di 0,1 nel brodo di tripptone dell'1%. Pipetta 50 -L della sospensione cellulare in ogni pozzo di una piastra rotonda 96 pozze.
   NOTA: Quando si lavora con auxotrofi acidi grassi, lavare le colture durante la notte in due volumi di brodo di tripptone e risospendere in 5 mL di brodo di tripone per limitare il riporto di acidi grassi prima di determinare l'OD della coltura.
3. Per i pozzi contenenti controlli non trattati, aggiungere 50 -L di 1% brodo di tripptone per pozzo.
4. Ai pozzetti contenenti le sospensioni cellulari sperimentali, aggiungere 50-L di 1% brodo di tripptone integrato con l'LDL derivato dal 10% del tuorlo d'uovo, 2 triclosan di m o una miscela di 10% l'LDL derivato dal tuono d'uovo e 2 triclosan di tipo .M.
   NOTA: A questo punto, ogni pozzo conterrà 100 l e la concentrazione finale di LDL e triclosan di origine uovo sarà rispettivamente del 5% e dell'1 M.
5. Misurare oD₆₀₀ nel corso del tempo, utilizzando un lettore di microplacino impostato a 37 gradi centigradi con agitazione continua e lineare per monitorare la crescita.

5. Incubazione di S. aureus con LDL per l'analisi dei lipidi della membrana.

1. Coltura una colonia isolata in 5 mL di brodo di tripone privo di acidi grassi e incubare durante la notte a 37 gradi centigradi con agitazione (225 rpm).
2. Diluire le colture notturne 1:100 in un fiaschetta sterile da 250 mL sconcertato contenente 50 mL di brodo di tripptone dell'1%. Incubare alla fase intermedia del log (circa 4 h) a 37 gradi centigradi con agitazione.
3. Trasferire 25 mL di coltura in un tubo di centrifuga sterile da 50 mL e pellet aree celle. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 750 : L di 1% brodo di tripptone.
4. Unire le cellule risospese e le sospensioni per cellule di 300 euro in un tubo di centrifuga sterile da 1,5 ml sterile.
5. Aggiungere i LDL alla concentrazione finale desiderata e incubare a 37 gradi centigradi con agitazione (225 giri/min) per 4 h.
6. Centrifugare le colture a 4 gradi centigradi a 16.000 x g per una durata di 2 min e lavare i pellet cellulari in due volumi di PBS sterile quindi ripetere.
7. Registrare il peso di ogni pellet a cellule bagnate. Congelare i pellet delle cellule sul ghiaccio secco o in azoto liquido e conservarli a -80 gradi centigradi o procedere direttamente alla sezione 6.

6. Estrazione dei lipidi della membrana S. aureus

1. Mettere pellet a cellule congelate S. aureus sul ghiaccio secco. Aggiungere perline di ossido di zirconium da 0,5 mm sopra ogni pellet cellulare, utilizzando un volume di perline approssimativamente uguale al volume del pellet cellulare.
   NOTA: In alternativa a questo metodo di estrazione dei lipidi, i ricercatori possono utilizzare i metodi Bligh e Dyer o Folch ben consolidati per esigere i lipidi dalle cellule batteriche³⁴.
2. Aggiungete 740 luna di 75% di metanolo (grado HPLC) raffreddati a -80 gradi centigradi direttamente ai pellet cellulari.
3. Aggiungete 2 - LL di 50 M dimiristoyl fosfatidicoloina (preparata in metanolo) per 1 mg di cellule come standard interno. Chiudere la provetta e posizionare le tube di centrifuga di 1,5 mL contenenti ciascun campione in una porta disponibile in un omogeneizzatore del tessuto Bullet Blender. Omogeneizzare i campioni a bassa velocità, impostando 2-3, per 3 min.
4. Ispezionare visivamente i campioni per verificarne l'omogeneità. Se sono visibili gruppi di celle, continuare l'omogeneizzazione in Bullet Blender con incrementi di 2 min.
5. Rimuovere i campioni dal frullatore proiettile e trasferirli in una cappa di fumi chimici.
6. Aggiungere 270 l di cloroformio ad ogni tubo campione. Vortice i campioni vigorosamente per 30 min.
   AVVISO: il cloroformio è un possibile cancerogeno.
7. Centrifugare i campioni in una centrifuga panca per un massimo di 30 min ad un minimo di 2.000 x g. Velocità più elevate possono essere utilizzate con tubi di centrifuga compatibile e la durata della centrifugazione può essere ridotta a 10 min.
8. In una cappa di fumi chimici, raccogliere il monofasico e trasferirlo in una nuova provetta, evitando con attenzione il pellet proteico nella parte inferiore del tubo di estrazione.
9. Aggiungere 740 luna di 75% di metanolo (grado HPLC) e 270 -L di cloroformio al pellet proteico, e riestrarre ogni campione come descritto nei passaggi 6.6-6.8 sopra. Combinare il supernatante della seconda estrazione con il super-nato precedentemente raccolto per ogni campione.
10. Evaporare i solventi di estrazione sotto un flusso di gas inerte come azoto o argon, o sotto vuoto utilizzando un concentratore di centrifuga (Tabella dei materiali).
11. Lavare gli estratti di lipidi secchi tre volte con 1,0 mL di soluzione acquosa di bicarbonato di ammonio da 10 m m e asciugare nuovamente i campioni come al punto 6.10.
12. Risospendere gli estratti di lipidi secchi in un solvente non polare adatto come l'isopropanolo. Risospendere i campioni utilizzando 20 - L per 1 mg di peso cellulare fresco determinato nel passo 5.7 In alternativa, se il peso dei pellet cellulari è sconosciuto, rispendere i campioni in 200 - L di isopropanolo e procedere alla sezione 7.

7. Analisi dei profili lipidici S. aureus utilizzando spettrometria di massa ad alta risoluzione/precisione

1. Prima di condurre un'analisi completa dei lipidi, selezionare campioni di prova rappresentativi del gruppo o dei gruppi sperimentali e analizzarli su una serie di fattori di diluizione dei campioni per determinare le gamme di diluizione dei campioni in cui le concentrazioni totali di lipidi rientrano nel gruppo lineare gamma di risposta del rivelatore per lo spettrometro di massa, come descritto in precedenza³⁵.
2. Evaporates aliquote di ogni estratto di lipidico campione da sottoporre ad analisi lipidiche, asciugando le aliquote sotto gas inerte o sotto vuoto in un concentratore di centrifuga (Tabella dei materiali).
3. Risospendere ogni estratto di lipidico essiccato in spettrometria liquida-massa (LC-MS) di grado isopropanolo:metanolo (2:1, v:v) contenente formato di ammonio da 20 mM, utilizzando volumi equivalenti a un fattore di diluizione del campione ottimale, come determinato al punto 7.1.
4. Per un'analisi lipidica non mirata, i campioni possono essere introdotti direttamente alla piattaforma di spettrometria di massa ad alta risoluzione/accurata senza l'uso della cromatografia per iniezione di flusso o infusione diretta di estratti^35,36. Trasferire gli estratti di lipidi diluiti preparati al punto 7.3 in una fiala autocampionatore appropriata o piastra da 96 pozzi.
5. Per l'analisi basata sull'iniezione di flusso, posizionare le fiale autocampionatore in un autocampionatore a temperatura controllata (15oC) di un sistema HPLC in grado di applicazioni capillari/a basso flusso, come un HPLC (Tabella deimateriali) dotato di un flusso elettronico sistema di monitoraggio delle proporzioni e del flusso.
6. Riempire i serbatoi di solvente HPLC con l'isopropanolo:metanolo di grado LC-MS (2:1, v:v) contenente formato di ammonio da 20 mM.
7. Utilizzando il software Agilent Chemstation, programmare l'autocampione HPLC per eseguire iniezioni di campioni da 5 luna. Dal menu Strumento, selezionare Imposta iniettoree digitare 5.0 nel campo Volume iniezione. Le unità sono date come microlitri. Assicurarsi che l'HPLC sia impostato su flusso isocratico a 1 :L per min di 2:v isopropanol:metanolo contenente formato di ammonio da 20 mM.
8. Dal menu Strumento Chemstation, selezionare Configura pompa... quindi selezionare l'interruttore Modalità Micro Flow.
9. Nei campi Tabella dati immettere: Ora 0,00, 100% B, Flusso 1.0. Premere INVIO e creare una seconda riga nell'orario immettendo Ora 10.0, 100% B, Flusso 1.0. Selezionare il pulsante OK nella parte inferiore del menu Imposta pompa. Queste impostazioni abiliteranno 10 esecuzioni analitiche a una velocità di flusso di 1,0 : luna al minuto.
10. Introdurre l'eluate dalla linea di trasferimento HPLC allo spettrometro di massa utilizzando una fonte di ionizzazione elettrospray dotata di un ago metallico a basso flusso (34 G).
11. Utilizzando il software di controllo dello strumento Thermo Tune Plus, selezionare il menu Setup (Configurazione) e selezionare Heated ESI Source (Origine ESIriscaldata). Impostare la tensione di ionizzazione su 4000 V e gas di guaina su 5 (unità arbitrarie) digitando questi valori nei campi corrispondenti della finestra di dialogo. Allo stesso modo, impostare il Capillary Temp a 150 gradi centigradi e la Lente a S al 50%.
    NOTA: questi valori devono essere ottimizzati per ogni piattaforma di spettrometria di massa.
12. Per l'analisi dei lipidi non mirata, utilizzare come rivelatore una piattaforma MS ad alta risoluzione/massa accurata (Tabella dei materiali).
13. Utilizzando il software Thermo Tune Plus, fare clic sul pulsante Definisci scansione e nel menu Analizzatore selezionare FTMS. Impostare il campo Intervallo di massa su Normale e nel campo Risoluzione selezionare 100.000. Assicurarsi che Tipo di scansione sia impostato su Completo. Nel menu Intervalli di scansione, immettere 200 nel campo Prima massa (m/z) e 2000 nel campo Ultima massa (m/z).
14. Assicurarsi che venga utilizzata la polarità negativa per rilevare i lipidi S. aureus più abbondanti.
15. Ripetere l'analisi del campione utilizzando la frammentazione della spettrometria di massa in tandem (MS/MS) di tutti gli ioni lipidi all'interno di una regione spettrale di interesse per confermare le strutture lipidiche e i costituenti dell'acido grasso. In alternativa, gli ioni lipidici selezionati possono essere sottoposti all'analisi MS/MS dopo l'assegnazione delle identificazioni iniziali dei lipidi nella sezione 8.

8. Ricerca nel database per identificare i lipidi Endogeni Endogeni e derivati da LDL exogeno

1. Utilizzare il software Thermo Xcalibur per affinare ulteriormente la precisione di massa osservata. In Xcalibur, nel menu Strumenti, selezionare ricalibra la proprietà Ricalibra offline. Dopo aver aperto la finestra Ricalibra offline, caricare il file dello spettro di massa da ricalibrare selezionando il menu File e selezionando l'opzione Apri.
2. Aprire il file di interesse, attivare/disattivare il pulsante Inserisci riga nella parte superiore della finestra di visualizzazione, per visualizzare il cromatogramma iogramma totale per l'esecuzione MS. Media dei segnali MS acquisiti facendo clic con il pulsante sinistro del mouse sul mouse del computer su un bordo del picco di segnale osservato nel cromatogramma iogramma totale e trascinando il mouse sulla parte più ampia del picco.
3. Nel menu Filtro di scansione, selezionare il filtro corrispondente ai dati MS di scansione completa. Caricare un file di riferimento contenente le masse monoisotopiche teoriche di almeno tre lipidi endogeni S. aureus noti selezionando il pulsante Carica rif... e selezionando il file di riferimento. Selezionare la casella Usa accanto a ogni massa monoisotopica lipidica.
4. Fare clic sul pulsante Cerca nella parte inferiore della finestra di visualizzazione. Ricalcolare la media del segnale MS attraverso il picco del segnale nel cromatogramma iogrammo totale come fatto in precedenza.
5. Fare clic sul pulsante Converti nella parte inferiore della finestra di visualizzazione. Quando viene visualizzata la finestra di dialogo Converti, fare clic su OK. Omettere questo passaggio se sono stati raccolti dati su piattaforme di spettrometria di massa da fornitori diversi da Thermo Scientific.
6. Utilizzando il software Xcalibur, esportare gli elenchi di picchi di massa accurati ricalibrati per ogni campione non trattato o trattato con LDL in fogli di lavoro separati da un file Excel. Selezionare l'icona Del browser Qual. Aprire il file ricalibrato di interesse selezionando il menu File e l'opzione Apri... .
7. Calcolare la media del segnale attraverso l'ampio picco nel cromatogramma iogrammo totale come descritto nel passaggio 8.2.
8. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'icona della puntina da una puntina da volta nella finestra di visualizzazione dello spettro di massa e selezionare Visualizza . Elenco spettro. Dallo stesso menu, selezionare Opzioni di visualizzazione e quindi la casella di attivazione/disattivazione Tutti i picchi nel menu Visualizza. Fare clic sul pulsante OK per chiudere la finestra di visualizzazione.
9. Fare di nuovo clic con il pulsante destro del mouse sull'icona della puntina da posta nella finestra di visualizzazione dello spettro di massa e selezionare la finestra Esporta Appunti (massa esatta). Incollare la cella di dati esportati A1 del primo foglio di lavoro in un nuovo foglio di calcolo di Excel.
10. Eliminare le prime 8 righe di testo nel file di dati esportato, in modo che la cella A1 del foglio di calcolo di Excel contenga il primo punto dati di massa dallo spettro di massa. Ripetere l'esportazione di ogni file MS ricalibrato, utilizzando un nuovo foglio di lavoro nel file Excel per ogni elenco di picco esportato.
11. Utilizzando il software LIPid Mass Spectral Analysis (LIMSA)³⁷ Add-In per Excel, costruire un database contenente formule molecolari di specie note dilipidi di S. aureus, come descritto da Hewelt-Belka et al. formule che rappresentano specie lipidiche che potrebbero ipoteticamente essere presenti in LDL.
    NOTA: Inoltre, occorre fare attenzione a includere nel database potenziali formule molecolari per i lipidi batterici ipotetici che hanno incorporato i principali acidi grassi LDL, come gli acidi grassi oleici (18:1) e linoleici (18:2)³².
12. Per costruire il database, aprire un foglio di calcolo di Excel vuoto. Nella cella A1 del primo foglio di lavoro, digitare la massa monoisotopica teorica/calcolata delle specie lipidiche da aggiungere al database, corrispondente alla massa delle specie lipidiche nello stato ionico osservato nello spettrometro di massa. Nella cella B1 immettere un nome per la specie lipidica, ad esempio PG(34:0).
13. Nella cella C1, immettere la formula molecolare per la specie lipidica, corrispondente allo stato ionico del lipidico osservato nello spettrometro di massa. Nella cella D1, immettere la carica della specie lipidica come osservato nello spettrometro di massa. Passare alla cella A2 per iniziare una nuova voce per la prossima specie lipidiche da inserire nel database ricercabile.
14. Ripetere i passaggi 8.12 e 8.13 fino a quando tutte le specie di lipidi desiderate non sono state inserite nel database. Salvare il file di database e lasciarlo aperto in Excel.
15. In Excel selezionare il menu Componenti aggiuntivi in. Selezionare LIMSA per avviare il software LIMSA. Dal menu principale, fare clic sul pulsante Libreria composta. Nella nuova finestra visualizzata, fare clic su Importa composti. Questo caricherà il database composto per l'uso da parte del software LIMSA.
16. Eseguire identificazioni lipidiche accurate basate sulla massa su tutti gli spettri MS utilizzando il componente aggiuntivo per Excel del software LIMSA secondo le istruzioni del fornitore³⁵. Dal menu principale di LIMSA, selezionare Elenco di picco dal menu Tipo di spettro. Selezionare Modalità positivo o Modalità negativa per corrispondere alla polarità in cui sono stati acquisiti i dati MS.
17. Nella finestra Picco fwhm (m/z), immettere la finestra di ricerca di massa desiderata per la ricerca di picco. Per i dati MS di massa/massa ad alta risoluzione/accurate, è consigliata una finestra di ricerca di tolleranza di massa di 0,003-0,005 m/z.
18. Nella finestra Sensibilità, immettere il taglio della linea di base desiderato (ad esempio, 0,01% di abbondanza relativa). Nel menu Correzione isotopo, selezionare Algoritmi Lineare adatta o Sottrai, uno dei quali può essere utilizzato con i dati della lista di picco.
19. Evidenziare i composti lipidici da includere nella ricerca nel database facendo clic sulle specie di lipidi desiderate all'interno della finestra Composti disponibili. Fare clic sul pulsante Aggiungi per aggiungere specie lipidiche evidenziate al gruppo di ricerca.
20. Definire gli standard interni facendo clic sui composti aggiunti, quindi modificando la finestra Concentrazione alla corrispondente concentrazione dello standard interno selezionato.
21. Assicurarsi che le specie di lipidi standard interne e di lipidi selezionate da quantificare appartengano allo stesso nome di classe selezionando ciascuna specie di lipidi aggiunti e standard interni e digitando un nome di classe (ad esempio PG o Lipid) nel campo Classe.
22. Per salvare il gruppo ricercabile di composti lipidici per un uso futuro, fare clic sul pulsante Salva accanto al menu Gruppi.
23. Assicurarsi che il file Excel contenente tutti gli elenchi di picco MS esportati sia aperto al foglio corrispondente alla prima esecuzione di S. aureus MS, quindi fare clic sul pulsante Cerca dal menu principale di LIMSA.
    NOTA: l'output della ricerca nel database LIMSA includerà un elenco di caratteristiche spettrali di massa abbinate ai lipidi presenti nel database costruito nei passaggi 8.12-8.13, nonché le concentrazioni per ogni funzione corrispondente dopo la normalizzazione a uno o più selezionati standard interni.
24. Utilizzare il software Xcalibur per esaminare gli spettri MS/MS di massa accurata per m/z corrispondenti agli ioni lipidi di interesse al fine di confermare i costituenti dell'acido grasso presenti in ciascuna specie molecolare lipidica identificata. Selezionare l'icona Del browser Qual. Aprire il file MS/MS di interesse selezionando il menu a discesa File e selezionando l'opzione Apri....
25. Selezionare il filtro di scansione corrispondente all'analisi MS/MS di un lipido m/z di interesse facendo clic con il tasto destro del mouse sull'icona della puntina da posta nella finestra di visualizzazione dello spettro di massa e selezionare Intervalli dal menu. Nella nuova finestra visualizzata, selezionare il menu Filtro per selezionare la scansione.
26. Calcolare la media del segnale attraverso il cromatogramma io-totale come descritto al punto 8.2. Utilizzare il software MetaboAnalyst (www.metaboanalyst.ca) per eseguire test statistici appropriati. Valutare la differenza statisticamente significativa nella composizione dei lipidi S. aureus confrontando l'abbondanza normalizzata dei lipidi tra le condizioni non trattate e le condizioni trattate con LDL.

Il protocollo per l'arricchimento di LDL dal tuorlo d'uovo di gallina è illustrato nella figura 1. Questo processo inizia diluindo il tuorlo d'uovo intero con la salina e separando i solidi del tuorlo d'uovo indicati come granuli dalla frazione solubile o plasma contenente i LDL (Figura 1)33. Il contenuto di LDL della frazione plasmatica è ulteriormente arricchito dalla precipitazione del kDa 30-40 dollari (Figura2)33. La presenza di bande proteiche a 140, 80, 65, 60 e 15 kDa è correlata alle apoproteine di LDLs (Figura 2)33,39. Il trattamento con triclosan inibisce la crescita di S. aureus nei supporti privi di acidi grassi32. Abbiamo già dimostrato che integrare colture con plasma di tuorlo d'uovo o LDL umani purificati come fonti di acidi grassi esogeni supera l'inibizione della crescita indotta dal triclosan (Figura 3)32. Allo stesso modo, il completamento di colture trattate con triclosan con tuorlo d'uovo arricchito LDL ripristina la crescita (Figura 3). Inoltre, l'aggiunta di LDL tuorlo d'uovo supporta la crescita di un auxotrh acido grasso S. aureus precedentemente caratterizzato (Figura 4)32. Per la profilazione più accurata basata sulla spettrometria di massa di S. aureus incorporazione di acidi grassi esogeni, è importante limitare la presenza di acidi grassi liberi nel mezzo di crescita. La composizione dell'acido grasso libero dell'1% di brodo di tripone e di tuorlo di pollo diluiti nel brodo di tripone è stata determinata impiegando l'iniezione di flusso ad alta risoluzione/spettrometria di massa accurata e ha trovato quantità minime di acido grasso libero (Figura 5). La stessa analisi di spettrometria di massa non mirata è stata eseguita per determinare la composizione dell'acido grasso dei fosforidi S. aureus dopo l'esposizione a linfoll d'uovo di gallina LDL. Analisi discriminante parziale degli ortogonali (OPLS-DA)40 di abbondanti fosfolipidi di membrana S. aureus hanno dimostrato una chiara separazione di classe delle condizioni trattate con l'Olfatto di gallina non trattato e del tuono di pollo, come mostrato nella trama dei punteggi OPLS-DA (Figura 6A). La trama dei carichi OPLS-DA ha indicato numerose specie di fosfatidilglicere come variabili importanti nel modello PLS-DA. In particolare, i fosfolipidi contenenti acidi grassi insaturi, un marcatore molecolare dell'incorporazione di acidi grassi esogeni, sono arricchiti nelle colture integrate LDL rispetto alle cellule incubate in assenza di LL (Figura6B). Studi precedenti hanno scoperto che i tuorli d'uovo di gallina sono una ricca fonte di acidi grassi insaturi con acido oleico (18:1) essendo il più abbondante41,42. In accordo con queste osservazioni, abbiamo trovato l'acido oleico come l'acido grasso insaturi più comune utilizzato per la sintesi fosfolipidi quando le colture S. aureus sono state integrate con LDL di tuorlo d'uovo di gallina (Figura 6C). La tabella 1 illustra inoltre che i profili dell'acido grasso dei fosforlipidi della membrana vengono alterati quando S. aureus viene coltivato in presenza di LDL tuorlo d'uovo.

Figura 1: Illustrazione dell'arricchimento di LDL da tuorlo d'uovo di gallina che utilizza la centrifugazione e la precipitazione del solfato di ammoniaca. (A) I reagenti necessari per l'arricchimento di LDL dal tuorlo d'uovo di gallina. (B) Il diagramma di flusso illustra le fasi significative del processo di arricchimento LDL. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Profilo proteico del tuorlo d'uovo di gallina prima e dopo l'arricchimento per LDL. I lismi proteici sono stati preparati utilizzando il tampone RIPA. Il lisato proteico (15 g) è stato caricato in un gel SDS-PAGE acrilamide dell'8%. I gel sono stati macchiati durante la notte con il reagente bio-proteina Bio Rad. I pesi molecolari nelle proteine associate a KDa delle proteine associate a LDL sono indicati lungo il lato destro dell'immagine. M: marcatore proteico, Y: tuorlo d'uovo di pollo e LDL: arricchimento del tuorlo di gallino LDL Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: I LDL derivati dal tuorlo d'uovo proteggono S. aureus dall'inibizione del FASII indotta da triclosan. La crescita di S. aureus è stata monitorata nel tempo attraverso la misurazione del brodo di tripptone OD600 in 1% nelle seguenti condizioni: 1% di brodo di tripone (TB), 1 triclosan (TCS), 1 triclosan di uovo con 1% di plasma di tuorlo (TCS e EYP), 5% di tuorlo d'uovo LDL (LDL), o 1 triclosan con 5% tuorlo d'uovo LDL (TCS - LDL). Viene mostrata la media di tre esperimenti indipendenti. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard della media. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Crescita di una S. aureus auxotroph auxotroph auxotroph è supportato da LDL di origine tuorlo d'uovo. La crescita di un auxotropo di acido grasso in 1% brodo di tripone (TB) con o senza 5% di uovo tuorlo LDL (LDL) completamento è stato monitorato nel tempo attraverso la misurazione di OD600. Viene mostrata la media di tre esperimenti indipendenti. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard della media. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Contenuto di acidi grassi liberi misurato in 1% di brodo di tripptone o tuorlo d'uovo di pollo LDL. Gli acidi grassi liberi sono stati rilevati mediante iniezione di flusso ad alta risoluzione/spettrometria di massa accurata e spettrometria di massa in tandem. Il numero normalizzato di ioni per mg di proteine è stato determinato per 1% brodo di tripptone e 1% brodo di tripone integrato con 5% londilo d'uovo di pollo LDL.

Figura 6: Le lipoproteine a bassa densità del tuorlo d'uovo di pollo sono un serbatoio di acidi grassi esogeni per la sintesi di S. aureus fosfatidylglycerol. (A) Punteggi trama di analisi discriminante ortogonale parziale di yolk l'uovo l'Olo ldll e fosfolipidi di membrana non trattati identificati mediante spettrometria di massa ad alta risoluzione/massa accurata. (B) Percentuale di fosfatidicidylglycerolo (UPG) a membrana ingrata rispetto al PG totale a membrana di S. aureus coltivato in assenza (WT) o presenza (WT - LDL) di lURIdi di gallina LDL. (C) Profilo di acido grasso insaturi (UFA) della membrana S. aureus coltivati senza (WT) o con LOl (WT - LDL) di uova di gallina rappresentate graficamente come percentuale della quantità totale di acidi grassi PG totali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Profilo dell'acido grasso di S. aureus coltivato in presenza di LDL di tuorlo d'uovo di gallina. Abbiamo utilizzato un'analisi lipidomica imparziale utilizzando MS ad alta risoluzione/accurata e MS/MS per determinare il profilo dell'acido grasso di S. aureus PG. S. aureus è stato incubato in presenza o assenza di LDL tuorlo di uovo, e il profilo PG di questi cellule è stato confrontato con quello delle cellule coltivate nel brodo di tripptone dell'1%.

Gli autori non hanno divulgazioni.