Articolo metodologico

Valutare la risposta immunitaria cellulare del moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, utilizzando un test di fagocitosi In Vivo

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DOI:

10.3791/59543

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10 aprile 2019

 , 
1Department of Biology, University of Maryland, 2Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland, 3Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un test di fagocitosi in vivo in adulto Drosophila melanogaster quantificare fagocita riconoscimento e liquidazione delle infezioni microbiche.

Abstract

In tutti gli animali, l'immunità innata fornisce un immediato e robusta difesa contro un ampio spettro di agenti patogeni. Le risposte immunitarie umorali e cellulari sono i rami principali dell'immunità innata, e molti dei fattori che regolano queste risposte sono evolutivamente conservate tra gli invertebrati e mammiferi. Fagocitosi, il componente centrale di immunità innata cellulare, viene effettuata da cellule di sangue specializzate del sistema immunitario. Moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, è emerso come un potente modello genetico per studiare i meccanismi molecolari e fisiologici degli impatti della fagocitosi in animali interi. Qui dimostriamo un test di fagocitosi in vivo basati su iniezione per quantificare l'assorbimento delle particelle e la distruzione di cellule del sangue di Drosophila , emociti. La procedura permette ai ricercatori di controllare con precisione la concentrazione di particelle e la dose, che permette di ottenere risultati altamente riproducibili in un breve lasso di tempo. L'esperimento è quantitativa, facile da eseguire e può essere applicato per schermo per fattori ospite che influenza patogeno riconoscimento, assorbimento e liquidazione.

Introduzione

Difese immunitarie innate formano la prima linea di difesa contro i microbi patogeni. Queste risposte possono essere diviso funzionalmente in immunità innata umorale e cellulare, entrambi i quali sono mediati da recettori di riconoscimento modello germinale-codificato (PRRs) che senso pathogen-associated molecular pattern (PAMP)1. Molte delle vie di segnalazione e meccanismi effettori dell'immunità innata sono conservati nei mammiferi e invertebrati, come il nematode, elegans di Caenorhabditis e la Mosca della frutta, Drosophila melanogaster2. Moscerino della frutta è emerso come un potente sistema di difesa dell'ospite contro microrganismi infettivi3di studiare. Drosophila è geneticamente trattabile, facilmente ed a buon mercato allevati nei laboratori e ha un tempo di generazione breve. Inoltre, la Mosca della frutta esibisce altamente efficienti difese contro una matrice di microbi, che consente l'esame dell'immunità ospite contro gli agenti patogeni virali, batterici, fungini o parassitari.

Drosophila immunologi hanno storicamente utilizzato avanti schermi genetici, genoma mediata da RNA interferenza (RNAi) proiezione di linee cellulari di insetto e pre-esistente ceppi mutanti volare per esaminare l'immunità innata – che conduce la identificazione e caratterizzazione di diverse vie immuni umorali evolutivamente conservati4,5,6,7,8. La risposta immunitaria innata umorale è, senza dubbio, il migliore caratterizzata difesa immunitaria nei moscerini della frutta. A seguito di infezione, la risposta umorale conduce alla produzione e rilascio sistemico di peptide antimicrobico molecole (AMP) nell'emolinfa, il sangue equivalente negli insetti. Amplificatori sono prodotte da pedaggio altamente conservata e Imd vie di segnalazione. La via di pedaggio è omologo al mammifero segnalazione del ricevitore TLR/IL-1R e pathway Imd è omologo alla segnalazione di fattore di necrosi tumorale-alfa dei mammiferi. In Drosophila, pedaggio segnalazione è indotto da batteri Gram-positivi e funghi Drosophila X virus6,9,10 e Imd segnalazione è indotta da batteri gram-negativi11 ,12.

Immunità cellulare, composto di incapsulamento, melanizzazione e fagocitosi dei patogeni invasivi, eseguiti da cellule specializzate del sangue chiamate emociti13. Ci sono tre classi di emociti nel moscerino della frutta: cristallo celle, lamellocytes e plasmatocytes13. Crystal cellule, che costituiscono il 5% degli emociti circolanti nelle larve, rilasciano enzimi proPhenoloxidase (proPO) che conduce la melanizzazione degli agenti patogeni e tessuti dell'ospite presso siti ferita. Lamellocytes, che non si trovano in embrioni sani o larve, sono cellule aderenti che incapsulano oggetti estranei. Queste cellule sono indotte su pupariation o quando parassitanti Vespa uova sono depositate nelle larve. Plasmatocytes fagocitaria, che compongono il 95% del circolante emociti nelle larve e tutti i rimanenti emociti negli adulti, gioca un ruolo nel rimodellamento durante lo sviluppo del tessuto e, in particolare, servire come cellula effettore principale della drosofila l'immunità cellulare.

Fagocitosi un'immediato e fondamentale linea di difesa immunitaria innata; i microbi che violano la barriera epiteliale di host sono rapidamente inghiottiti ed eliminati dalle cellule fagocitiche del sangue (per una rassegna completa di biologia delle cellule della fagocitosi vedere riferimento 14). Questo processo è iniziato quando il riconoscimento di pattern con codifica germline recettori (PRRs) su emociti riconoscono patogeni associati pattern molecolari (PAMPs) di microbi. Una volta legato ai loro target, PRRs avviare cascate di segnalazione che portano alla formazione di pseudopodi attraverso actina citoscheletrica rimodellamento. Pseudopodi circondano il microbo, che successivamente viene inghiottito e interiorizzato in un organello nascente phagosome. I microbi sono distrutti come phagosome subisce il processo di maturazione del fagosoma quando phagosome è trafficata verso l'interno degli emociti e acidifica attraverso una serie di interazioni con i lisosomi. In vitro e cella studi di biologia in cellule di mammifero primario sono stati strumentali nell'identificazione e caratterizzazione di fattori che regolano la fagocitosi, come il ricevitore di Fc-gamma dei mammiferi e C3b recettori15,16. Tuttavia, la possibilità di eseguire grandi schermi o studi in vivo sono limitati nei sistemi mammiferi.

Qui presentiamo un test in vivo per la fagocitosi in adulti mosche della frutta, che si basa su una procedura introdotta dal laboratorio di David Schneider nel 200017. Il laboratorio di Schneider ha mostrato che sessile emociti cluster lungo il vaso dorsale addominale prontamente fagocitare batteri e perle di polistirolo. Per visualizzare la fagocitosi, mosche sono iniettati con fluorescente contrassegnate particelle (come e. coli etichettati con isotiocianato di fluorescina (e. coli -FITC)), incubate per 30 minuti permettere emociti di fagocitare le particelle e poi iniettato con trypan blu, che disseta la fluorescenza delle particelle non phagocytosed durante il periodo di incubazione. Volare navi dorsale sono quindi Imaging utilizzando un microscopio invertito a fluorescenza. Questa carta seminale, utilizzando un esperimento relativamente semplice, ha dimostrato che emociti fagocitare batteri e granuli di lattice, che fagocitosi batterica possono essere inibite iniettando pre-Vola con granuli di lattice, e che vola senza sia cellulare ed umorale le risposte immunitarie sono suscettibili anche di e. coli. L'analisi presentata in questo rapporto si basa sul lavoro del laboratorio Schneider per quantificare in vivo fagocitosi misurando l'intensità della fluorescenza delle particelle inghiottito da emociti vaso dorsale associato.

Simile all'approccio adottato nei sistemi mammiferi, Drosophila genetisti inizialmente utilizzato genoma schermi RNAi in vitro per identificare i geni richiesti per la risposta immunitaria cellulare18,19,20 ,21,22,23. Tuttavia, lo sviluppo del dosaggio adulto fagocitosi in vivo attivato follow-up esperimenti per essere prontamente effettuati in animali interi, consentendo ai ricercatori di verificare il biologico il ruolo dei fattori individuati negli studi in vitro. Tale era il caso con il recettore transmembrana Eater, che è stato prima identificato come un recettore batterico in un schermo di RNAi utilizzando S2 cellule24 e poi più tardi mostrato a mediare Escherichia coli (Escherichia coli),, Enterococcus faecalis, e fagocitosi di Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) in adulti25.

Il nostro laboratorio impiegato il test di fagocitosi in vivo in avanti schermi genetici e studi di associazione genome-wide (usando il pannello di riferimento genetico drosofila (DGRP)) per identificare nuovi geni che regolano la fagocitosi in adulti emociti. Questi studi hanno portato alla caratterizzazione i recettori PGRP-SC1A e PGRP-SA26, la vescicola intracellulare traffico proteina Rab1427, il trasportatore del glutammato Polifemo28e RNA-proteina Fox-129.

Anticipiamo che futuri schermi che incorporano la fagocitosi in vivo potrebbero portare all'identificazione di ulteriori geni che sono importanti per la risposta immunitaria cellulare in drosofila. Schermate mediante linee inbred completamente sequenziato, ad esempio la DGRP o la drosofila sintetico popolazione risorsa (DSPR), possono identificare varianti naturali che influenzano lo sviluppo di fagocitosi o emociti. Inoltre, la tecnica potrebbe essere adottata in altre specie di Drosophila o utilizzata per nuove risorse comunitarie di schermo, ad esempio la raccolta di 250 specie di Drosophila mantenuto dal National Drosophila specie Stock Center (NDSSC ) alla Cornell. Questi esperimenti possono essere effettuati utilizzando fluorescente etichettati batteriche o fungine-parete bioparticelle che sono commercialmente disponibili o possono essere eseguiti utilizzando qualsiasi numero di specie batteriche o fungine – fornito che il microbo esprime marcatori fluorescenti .

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Protocollo

1. preparare le particelle della fluorescina per iniezione

  1. Ricostituire 10mg di commercialmente disponibili, calore-uccisi batteri particelle etichettate con fluoresceina (Vedi Tabella materiali) ad una concentrazione stock di 10 mg/mL aggiungendo 990 µ l sterile 1X PBS e 10 µ l 50 mM sodio azide. Vortice di mescolare.
    1. Dividere in aliquote di µ l 8 monouso in provette da 0,2 mL e conservare in una scatola scura a 4 ° C per ridurre al minimo la sensibilità alla luce associata.
      Nota: Conservante sodio azide è facoltativa e può essere omesso se gli stock di 10 mg/mL sono realizzati con 1 mL di PBS 1X sterile, aliquotati e conservati a-20 ° C.
  2. Fare un 10 mL di soluzione di 5% colorante alimentare in PBS 1X mescolando 500 µ l siringa filtrata cibo verde colorazione e 9,5 mL sterile 1X PBS.
  3. Lavare le particelle prima dell'iniezione per rimuovere sodio azide. Sterile 1 µ l di mix 42 x PBS e 8 µ l di 10 mg/mL in una provetta da 1,7 mL. Centrifugare a massima velocità per 2,5 min a temperatura ambiente.
    1. Eliminare il surnatante, aggiungere 50 µ l 1 x PBS e centrifuga a velocità max per 2,5 min a temperatura ambiente.
    2. Ripetere i passaggi da 1.3 e 1.3.1 x 2, per un totale di 3 lavaggi.
    3. Dopo il lavaggio finale, scartare il surnatante e risospendere le particelle a 1,6 mg/mL in 50 µ l di 5% colorante alimentare in PBS 1X.
    4. Avvolgere il tubo in alluminio per proteggerlo dalla luce. Conservare a 4 ° C, gettare dopo 1 settimana.

2. preparare la stazione di iniezione e mosche

  1. Preparare il tampone di iniezione. Per iniettare fino a 4 genotipi di mosche allo stesso tempo, uso laboratorio nastro per dividere una rettangolare CO2 Mosca pad in 4 sezioni. Sulla panchina vicino al microscopio, designare le zone per posizionare le fiale una volta mosche sono stati allineati sul pad (uno per ogni angolo del pad).
  2. Preparare i flaconcini di pari età, 4-7 giorni-vecchie, mosche per iniezione. Per ogni sforzo essere testato, trasferire 5 maschi e 5 femmine in una fiala di fresca, con etichetta di cibo preparato Vola e mantenere a 25 ° C.
  3. Preparare l'iniettore pneumatico (Vedi Tabella materiali) impostando lo strumento su una modalità temporizzata di 100 ms (brevi raffiche di pressione del gas per espellere il liquido – che consentono la fornitura di sub-nanolitro volumi).
  4. Preparare i vetrini di microscopio. Tagliare le strisce di 1,5 pollici di nastro isolante, piegare in un ciclo con il lato adesivo fuori e posto su un vetrino da microscopio con etichetta.

3. preparare gli aghi capillare di vetro

  1. Tirare gli aghi di vetro (tubi capillari in vetro parete sottile) utilizzando un estrattore di ago.
    1. Tenere l'ago sotto il microscopio con un micrometro e rompere la punta con una pinzetta #5 punta fine in acciaio inox. 100 µm suggerimenti sono sufficienti per perforare la cuticola della Mosca mentre minimizza il ferimento.
    2. Misurare il volume di liquido che sarà iniettato in ogni volo. Caricare l'ago con colorante in 1X PBS sterile 5% alimentare ed espellere il liquido su una goccia di olio minerale su un micrometro di 0,01 mm.
      Nota: Se la goccia di liquido è sferica, il volume in picolitri è calcolato come (dimensione)3/1910. 30 un ago con un diametro di 100 µm espellerà ~ 2 nL a 100 ms.

4. iniettare mosche

  1. Pipettare 10 µ l di particelle di 1,6 mg/mL su una piccola piazza di parafilm.
    1. Tirare il liquido nell'ago e montare l'ugello iniettore (Vedi Tabella materiali).
    2. Anestetizzare mosche con CO2 e metterli in fila nella loro area designata su flypad, con il lato ventrale verso l'alto e le teste orientate verso la parte anteriore del pad. Posizionare fiale nelle aree corrispondenti in panchina.
    3. Iniettare mosche nell'angolo superiore dell'addome con 5, ms 100 pompe di liquido (totale di ~ 10 nL).
    4. Trasferire le mosche iniettate alle fiale appropriate, il tempo di notare sul flacone. Conservare a 25 ° C.
  2. Caricare un nuovo ago con 0,4% soluzione di blu di Trypan.
  3. Impostare l'iniettore pneumatico GATED, che permette un flusso costante di aria per spingere il liquido fuori l'ago.
  4. Anestetizzare mosche dopo che essi hanno riposato per 30 min e iniettare con Trypan Blue, fino a quando l'addome è completo e dilatato.
    Nota: Quando si esamina la maturazione del fagosoma con particelle marcate con un colorante sensibile al pH, consente mosche a riposare per 1 h e non iniettare con trypan blu prima di montaggio mosche.
  5. Montare mosche su vetrini da microscopio con del nastro isolante, lato ventrale verso il basso. Spingere le ali al lato della Mosca e fissarli al nastro. Inoltre, spingere delicatamente la testa nel nastro per garantire che non si muoverà al volo.
  6. Passare immediatamente alla fase 5.

5. imaging mosche

  1. Immagine Vola, uno alla volta, a x 25 o 32 x ingrandimento, utilizzando un microscopio di fluorescenza invertito collegato a una fotocamera digitale e computer (Vedi Tabella materiali). Concentrarsi sul vaso dorsale della Mosca utilizzando software per computer per la fotocamera digitale.
  2. Registrare il tempo di esposizione e l'ingrandimento tra esperimenti.
    Nota: Perdere traccia dei genotipi è una potenziale fonte di errore quando si fotografano ceppi multipli in una sola seduta. Per evitare un'etichettatura erronea mosche, annotare il numero dell'immagine della prima e l'ultima fotografia Vola per ciascun genotipo.

6. quantificare e normalizzare la fluorescenza

  1. Aprire il software e aprire una sola immagine alla volta.
    1. Misurare l'intensità di fluorescenza del vaso dorsale. Disegnare un poligono attorno al vaso dorsale. Selezionare misura e registra l'intensità della fluorescenza all'interno del poligono.
    2. Determinare l'intensità di fluorescenza di fondo. Copiare il primo poligono e spostarlo in un'area adiacente al vaso dorsale della Mosca. Selezionare la misura e l'intensità di fluorescenza record della zona di sfondo.
    3. Normalizzare la fluorescenza del vaso dorsale di fluorescenza di fondo:
      Priorità bassa di ÷ vaso dorsale.
    4. Calcolare la che media normalizzati intensità di fluorescenza del vaso dorsale di tutte le mosche in un ceppo.
    5. Ripetere l'esperimento 2 volte.
    6. Uso uno studente di spaiati t-test per confrontare le intensità media di fluorescenza relativa di controllo mosche e testare Vola da tre esperimenti. Calcolare la dimensione dell'effetto utilizzando la formula: Cohen d = (M1- M2) ÷ SDpool, dove M1 è la media di genotipo 1 e M2 è la media del genotipo 2 &
      SD in pool =figure-protocol-1
      dove SD1 è la deviazione standard di genotipo 1 e SD2 è la deviazione standard di genotipo 2.

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Risultati

Un disegno schematico del dosaggio fagocitosi in vivo utilizzando particelle della fluorescina-labeled è mostrato in Figura 1A. Le mosche sono montati sul lato ventrale verso il basso su un pezzo di nastro isolante e i primi due segmenti dell'addome, dove il vaso dorsale si trova, è chiaramente visibile (Figura 1B). Principali fonti di errore sperimentale derivano alle fasi della procedura (Figura 1)...

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Discussione

Commercialmente disponibile, fluorescente contrassegnate particelle sono utilizzate per valutare la fagocitosi in generale (0,2 µm per volta carbossilato microsfere) o fagocitosi dei microbi (calore - fluorescente etichettati o chimicamente uccisi batteri o lieviti). Per valutare la maturazione del fagosoma, i ricercatori possono selezionare particelle marcate con un colorante di pH-sensibile che reagisce in quando il pH si abbassa da neutro ad acido, come il phagolysosome. In alternativa, per esaminare i pa...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano il Dr. Beth Gonzalez e Dr. Aprajita Garg per supporto nello svolgimento degli esperimenti in vivo fagocitosi. Una sovvenzione di seme di NSF UMD ADVANCE e UMD NIH T32 borse per la formazione, cellula e biologia molecolare (CMB) e le interazioni ospite-patogeno (HPI), finanziato quest'opera.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,2μ m FluoSpheres modificate con carbossilato fluorescente rossoInvitrogenF8810Perle di lattice marcate con fluorescenza per testare la capacità fagocitaria generale dei fagociti. (~580/~605 nm) Iniettare una diluizione 1:20 in PBS con colorante al 5%.
5430-10 PicoNozzle KitWorld Precision Instruments5430-10Supporto per pipetta da 1,0 mm
E. coli (K-12 ceppo) Bioparticelle, Alexa Fluor 488 coniugatoInvitrogenE13231Killed E. coli etichettato con Alexa Fluor 488. Utilizzare per testare il riconoscimento dei fagociti e l'assorbimento dei batteri gram-negativi. (~495/~519 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 coniugatoInvitrogenE23370Killed E. coli marcato con Alexa Fluor 594. Utilizzare per testare il riconoscimento dei fagociti e l'assorbimento dei batteri gram-negativi. (~590/~617 nm)
E. coli (K-12 Strain) Bioparticelle, Fluoresceina coniugatoInvitrogenE2861Ucciso E. coli marcato con FITC (Fluoresceina). Utilizzare per testare il riconoscimento dei fagociti e l'assorbimento dei batteri gram-negativi. (~494/~518 nm)
E. coli (K-12 Strano) Bioparticelle, Texas Red coniugatoInvitrogenE2863Ucciso E. coli marcato con Texas Red. Utilizzare per testare il riconoscimento dei fagociti e l'assorbimento dei batteri gram-negativi. (~595/~615 nm)
E. coli (K-12 Strano) Bioparticelle, Texas Red coniugatoInvitrogenE2863Ucciso E. coli marcato con Texas Red. Utilizzare per testare il riconoscimento dei fagociti e l'assorbimento dei batteri gram-negativi. (~595/~615 nm)
Estrattore per pipette ad agoDavid Kopf InstrumentsModello 725
pHrodo Red E. coli BioParticles coniugato per fagocitosiInvitrogenP35361Ucciso E. coli marcato con pHrodo Red. Utilizzare per testare la riconiazione, l'assorbimento e la maturazione dei fagosomi dei batteri gram-negativi. (~560/~585 nm). Non c'è bisogno di spegnere con Trypan Blue.
pHrodo Red S. aureus BioParticelle coniugate per la fagocitosiInvitrogenA10010Ucciso S. aureus marcato con pHrodo Red. Utilizzare per testare la riconiazione, l'assorbimento e la maturazione dei fagosomi dei batteri gram-positvi. (~560/~585 nm). Non c'è bisogno di spegnere con Trypan Blue.
Pneumatica PicoPump PV820World Precision InstrumentsSYS-PV820La pneumatica PicoPump PV820 di World Precision Instruments utilizza pressioni differenziali per trattenere il liquido nell'ago di vetro tra un'iniezione e l'altra. L'utente controlla manualmente brevi raffiche di pressione del gas per espellere il liquido consentendo l'erogazione di volumi inferiori ai nanolitri. La quantità di liquido erogato dipende da due variabili principali: La dimensione dell'apertura dell'ago di vetro e la quantità di tempo di applicazione della pressione di iniezione. Impostare lo strumento su 100 ms " CRONOMETRATE" modo.
S. aureus (Ceppo di legno senza proteina A) Bioparticelle, Alexa Fluor 488 coniugatoInvitrogenS23371Ucciso S. aureus etichettato con Alexa Fluor 488. Utilizzare per testare il riconoscimento dei fagociti e l'assorbimento dei batteri gram-positivi. (~495/~519 nm)
S. aureus (Ceppo di legno senza proteina A) Bioparticelle, Alexa Fluor 594 coniugatoInvitrogenS23372Ucciso S. aureus etichettato con Alexa Fluor 594. Utilizzare per testare il riconoscimento dei fagociti e l'assorbimento dei batteri gram-positivi. (~590/~617 nm)
S. aureus (Ceppo di legno senza proteina A) Bioparticelle, Fluoresceina coniugatoInvitrogenE2851Ucciso S. aureus marcato con FITC (Fluoresceina). Utilizzare per testare il riconoscimento dei fagociti e l'assorbimento dei batteri gram-positivi. (~494/~518 nm)
Capillari in vetro a parete sottileWorld Precision InstrumentsTW100F-3Aghi per iniezione. OD = 1,0 mm
Soluzione di Trypan Blue (0,4%)SigmaT8154Utilizzato per spegnere la fluorescenza extracellulare di particelle marcate con Fluoresceina, Alexa Fluor o Texas Red.
Microscopio ZEISS SteREO (Discovery.V8)ZeissSteREO Discovery.V8Microscopio a fluorescenza invertita per l'imaging di mosche. Utilizzare una fotocamera digitale (ad esempio: fotocamera AxioCam HC) e il software in dotazione (ad esempio: software AxioVision 4.7) per scattare foto.
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 coniugatoInvitrogenZ23373Ucciso marcato con Alexa Fluor 488. Utilizzare per testare il riconoscimento dei fagociti e l'assorbimento del lievito. (~495/~519 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 coniugatoInvitrogenZ23374Ucciso marcato con Alexa Fluor 594. Utilizzare per testare il riconoscimento dei fagociti e l'assorbimento del lievito. (~590/~617 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) Bioparticelle, Coniugato di fluoresceinaInvitrogenZ2841Ucciso marcato con FITC (Fluoresceina). Utilizzare per testare il riconoscimento dei fagociti e l'assorbimento del lievito. (~494/~518 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas RedInvitrogenZ2843Ucciso marcato con Texas Red. Utilizzare per testare il riconoscimento dei fagociti e l'assorbimento del lievito. (~595/~615 nm)

Riferimenti

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