Quantificazione delle cellule CD4 specifiche dell'antigene umano che proliferano utilizzando Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Summary

Presentato qui è un protocollo per la misurazione delle cellule CD4 - T proliferanti in risposta a proteine antigeniche o peptidi utilizzando la diluizione del tinri. Questo analisi è particolarmente sensibile alle rare cellule T specifiche dell'antigene e può essere modificato per facilitare la clonazione delle cellule specifiche dell'antigene.

Abstract

Descritto è un metodo semplice, in vitro, basato sulla diluizione dei coloranti per misurare la proliferazione delle cellule T specifiche dell'antigene nelle cellule mononucleari del sangue periferico umano (PMC). Lo sviluppo di coloranti stabili, non tossici e fluorescenti come carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) consente di distinguere le cellule T rare e specifiche dell'antigene dai bystander per diminuzione della colorazione fluorescente, come rilevato dalla citometria di flusso. Questo metodo presenta i seguenti vantaggi rispetto agli approcci alternativi: (i) è molto sensibile alle cellule T a bassa frequenza, (ii) non è richiesta alcuna conoscenza dell'antigene o dell'epitopo, (iii) il fenotipo delle cellule rispondenti può essere analizzato e (iv) vitale, rispondente, rispondendo le cellule possono essere ordinate e utilizzate per ulteriori analisi, come la clonazione delle cellule T.

Introduction

La capacità di rilevare e studiare le cellule T specifiche dell'antigene è importante negli studi sull'immunità mediata dalle cellule. Tuttavia, in questo modo è particolarmente difficile per il CD4 specifico di autoantigen^- risposte delle cellule T, che sono molto deboli e difficili da rilevare. Un metodo comune utilizzato per la rilevazione della proliferazione dei linfociti specifici dell'antigene è [3H]-thymidine, che è un nucleotide radioetichettato incorporato nel DNA delle cellule che proliferano. Anche se l'analisi [3H]-timinano può rilevare la sintesi del DNA, questo metodo è una misura indiretta della divisione cellulare, perché la sintesi del DNA....

Protocol

Tutti i soggetti hanno dato il consenso informato prima della raccolta del sangue periferico. L'approvazione etica per gli esperimenti con PBMC è stata data da St. Vincent's Hosptial (HREC-A 135/08 e HREC-A 161/15).

1. Preparazione del reagente

1. Supporti di cellule T umane
   1. Preparare i supporti RP-5 per la coltura PBMC, che consiste di RPMI 1640, 1x aminoacidi non essenziali, L-alanyl-L-glutamine dipeptide (2 mM), penicillina (100 U/mL)/streptomycin (0,1 mg/mL) e 5% di siero umano in pool (PHS).
2. Soluzioni azionarie CFSE
   1. Preparare uno stock master scioglie....

Results

Stimolazione in vitro dei PMC umani con proteina toxoidte del tetano: i PMC sono stati macchiati con CFSE e stimolati per 7 giorni in presenza di toxoid tetano. Quasi tutti i donatori hanno mostrato una forte risposta delle cellule T al tetano toxoid perché erano stati vaccinati, il che rende il tetano toxoid un utile antigene di controllo positivo. La figura 2 dimostra in triplice copia, che la proliferazione CFSE di CD4^- Le cellule T provenienti .......

Discussion

La proliferazione basata su CFSE è un metodo semplice e robusto per rilevare ed enumerare le cellule CD4 umane specifiche dell'antigene e le cellule T. È stato dimostrato in precedenza che l'utilizzo della concentrazione ottimale di CFSE è essenziale per ottenere risultati ottimali⁴. Troppo CFSE abroga la proliferazione, mentre troppo poco non consente di distinguere le cellule divise e indivise. Al contrario, concentrazioni relativamente elevate (5,0 M) di CFSE vengono utilizzate per e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-umano CD4-AlexaFluor647	Biolegend	317422	RRID:AB_2716180
Carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE)	ThermoFisher	C1157
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	71-7167-00
Glutamax (1x)	Gibco	35050
Influenza A H1N1 (PR8) Proteina della matrice 1	Sino Biological	40010- V07E
Aminoacidi non essenziali (1x)	Gibco	11140
Penicillina/Streptomicina (1x)	Gibco	15070063
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Siero umano aggregato	Croce Rossa Australiana	N/A
Proinsulina C-peptide PI33-63	Purar Chemicals	N/A	Custom peptide sintetico
realizzato RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Tetano Proteina tossoide	Statens Siero Intitut	N/A