Articolo metodologico

Preparazione di nanoparticelle polimeriche neutralmente cariche e sensibili al pH per la consegna del siRNA citosolico

DOI:

10.3791/59549

⸱

2 maggio 2019

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of Mississippi, 2Department of BioMolecular Sciences, University of Mississippi, 3Biomedical Engineering Program, University of Mississippi

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sono presentati metodi per preparare e caratterizzare le proprietà fisico-chimiche e la bioattività delle nanoparticelle siRNA reattive al pH neutralmente caricate. Sono discussi i criteri per le nanomedicine siRNA di successo come le dimensioni, la morfologia, la carica superficiale, il carico di siRNA e il silenziamento genico.

Abstract

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Il successo di siRNA come medicina molecolare mirata dipende dalla sua efficace somministrazione citosolica alle cellule all'interno del tessuto della patologia. È stato raggiunto il successo clinico per il trattamento degli obiettivi di malattia epatica precedentemente "non ondulabili" con siRNA. Tuttavia, efficace somministrazione di siRNA tumorale richiede ulteriori considerazioni di progettazione farmacocinetica, tra cui lungo tempo di circolazione, l'evasione degli organi di clearance (ad esempio, fegato e reni), e la penetrazione del tumore e ritenzione. Qui descriviamo la preparazione e la caratterizzazione fisico-chimica/biologica in vitro di nanoparticelle polimeriche progettate per una consegna efficiente del siRNA, in particolare per i tessuti non epatici come i tumori. Le nanoparticelle di siRNA sono preparate con la complessazione elettrostatica di siRNA e il diblock Copolimero Poly (etilene glicole-b-[2-(dimethylamino) etil metacrilato-co-butile metacrilato]) (PEG-DB) per formare complessi poliionici ( polyplexes) dove siRNA è sequestrato all'interno del nucleo Polyplex e PEG forma una corona idrofila, neutralmente caricata. Inoltre, il blocco DB diventa membrana-Lisica come vescicole della via endolysosomiale acidificante (< pH 6,8), innescando la fuga endosomiale e la somministrazione citosolica di siRNA. Sono descritti i metodi per caratterizzare le caratteristiche fisico-chimiche delle nanoparticelle di siRNA, come la dimensione, la carica superficiale, la morfologia delle particelle e il caricamento del siRNA. La bioattività delle nanoparticelle di siRNA viene misurata utilizzando la luciferasi come gene modello in un saggio di silenziamento genico rapido e ad alto rendimento. I disegni che superano questi test iniziali (come i poliplexi basati su PEG-DB) sono considerati appropriati per la traduzione in studi preclinici sugli animali che valutano la somministrazione di siRNA a tumori o altri siti di patologia.

Introduzione

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Poiché i siRNA inibiscono la traduzione delle proteine dalle sequenze di mRNA, possono teoricamente essere usati per la droga tutte le patologie conosciute1,2,3,4,5. Tuttavia, l'uso di siRNA in medicina è limitato dal profilo farmacocinetico globalmente scarso delle molecole di siRNA6,7. Quando iniettato per via endovenosa, i siRNA vengono rapidamente cancellati attraverso i reni e/o degradati dalle nucleasi8,9. A causa delle sue grandi dimensioni e della carica negativa, siRNA non può entrare nelle cellule o sfuggire alla via endolysosomiale per accedere al complesso di silenziamento indotto dall'RNA (RISC) che risiede nel citosol10,11,12, 13. la Così, ampio sforzo si è concentrato sulla progettazione e l'attuazione delle strategie di consegna siRNA14. Questo sforzo si è concentrato principalmente sullo sviluppo di nanoparticelle a base lipidica e polimerica che confezionano siRNA, la proteggono dalla clearance e dalla degradazione in vivo, e avviano l'assorbimento cellulare e la fuga endosomiale attraverso gruppi ionizzabili di ammina cationica. Molti successi pre-clinici sono stati segnalati e, più recentemente, è stato riportato il primo successo clinico per la somministrazione di siRNA epatica basata su nanoparticelle per il trattamento dell'amiloidosi ereditaria da transthyretina (hATTR)15.

Ci sono molti geni che causano il cancro che sono attualmente "ondulabili" dalla farmacologia convenzionale (cioè farmaci di piccole molecole), motivando la progettazione di nanoparticelle polimerica siRNA (si-NPs) per il trattamento del cancro16. Tuttavia, ci sono un insieme separato di parametri di progettazione che devono essere considerati per la consegna non epatica siRNA. Il sistema di erogazione deve proteggere la carica cationica del Polyplex che provoca l'agglutinazione all'interno della circolazione sistemica17,18,19. Per la somministrazione del tumore, in particolare, la stabilità si-NP è essenziale per dotare la lunga circolazione e quindi un aumento dell'accumulo all'interno dei tumori tramite l'effetto di permeabilità e ritenzione potenziata (EPR)20,21. Inoltre, il controllo sulle dimensioni si-NP è essenziale poiché solo le nanoparticelle di circa 20 – 200 Nm di diametro in dimensioni sfruttano EPR22, e più piccoli si-NPS (~ 20 – 50 Nm di diametro) mostrano una migliore penetrazione del tumore su nanoparticelle di dimensioni maggiori e microparticelle23.

Per ovviare a questi vincoli di progettazione aggiuntivi per la somministrazione di tumore sistemico di siRNA dopo somministrazioni endovenose, sono stati sviluppati (Figura 1)24il pH-NPS reattivo. Questi si-NP sono pegilati, o più recentemente, Zwitterionated25, per la carica superficiale neutrale e la resistenza all'adsorbimento proteico e opsonizzazione in circolazione. Poiché non possono affidarsi esclusivamente al carattere cationico per guidare la consegna intracellulare, la fuga endosomiale estremamente efficiente è indispensabile per ottenere un potente silenziamento genico. Di conseguenza, il nucleo di questi si-NPs è composto da un nucleo altamente endosomolitico che è inerte a pH extracellulare (7,4), ma che viene innescato in modo simile a un interruttore nelle condizioni acidificate della via endolysosomiale [pH 6,8 (primi endosomi) – 5,0 ( lisosomi)]. Infine, una miscela di contenuto cationico e idrofobico all'interno del nucleo di si-NPs fornisce sia le forze di stabilizzazione elettrostatiche e Van der Waals, migliorando la stabilità del si-NP nel sangue rispetto ai sistemi semplicemente cationici.

L'integrazione di molte funzioni in un design relativamente semplice è possibile utilizzando la polimerizzazione controllata di trasferimento della catena di addizione reversibile (RAFT) per produrre polimeri con un'architettura complessa e una composizione precisa. Per produrre si-NPs con carica superficiale neutra, pH-reattività, e stabilità NP, zattera è usato per sintetizzare poli (etilene glicole-b-[2-(dimetilammonio) etil metacrilato-co-butile metacrilato]) (PEG-DB; Figura 1a). PEG-DB è elettrostaticamente complessato con siRNA, formando si-NPs con una corona PEG e DB/siRNA nucleo (Figura 1B). PEG forma uno strato idrofilo inerte e neutralmente caricato sulla corona si-NP. Il blocco DB è costituito da un rapporto molare 50:50 di 2-(dimethylamino) etil metacrilato (DMAEMA) e butile metacrilato (BMA). Cationic DMAEMA elettrostaticamente complessi siRNA caricato negativamente. BMA self-Associates all'interno del nucleo NP da Van der Waals interazioni, aumentando la stabilità NP. Insieme, DMAEMA e BMA impartiscono il comportamento lipidico-lisico del pH-dipendente al blocco polimerico DB. A pH extracellulare, il blocco DB viene sequestrato al nucleo si-NP ed è inerte ai bilayer lipidici. In condizioni acide, come quelle all'interno della via endolysosomiale, la DMAEMA ionizzabile all'interno del blocco DB facilita l'effetto della spugna protonica, dove il buffering endosomiale conduce al gonfiore osmotico e alla rottura26. Inoltre, le frazioni di BMA idrofobica all'interno del blocco DB si integrano attivamente e Lisano i bilayer lipidici, con conseguente potente endosomolisi. Pertanto, siRNA è complessato con PEG-DB per formare si-NPs che sono neutralmente caricati e altamente stabili a pH extracellulare ma che interrompono i bilayer lipidici a pH acido, assicurando la consegna citosolica del payload siRNA.

Qui sono descritte le procedure sperimentali per produrre si-NPs da PEG-DB. I metodi per caratterizzare i parametri fisico-chimici e la bioattività di si-NPs sono presentati e discussi. Al fine di valutare rapidamente la bioattività si-NP, la luciferasi viene utilizzata come gene modello per gli studi di knockdown. Firefly luciferase è la proteina responsabile del ' bagliore ' delle lucciole27. Di conseguenza, le cellule di mammiferi trasfusate con il gene lucciola luciferasi producono un "bagliore" bioluminescente che può essere catturato utilizzando un luminometro per quantificare i livelli di espressione di luciferasi. Qui, usiamo luciferase per valutare la bioattività di si-NP fornendo siRNA contro luciferase e quantificando la corrispondente riduzione della bioluminescenza nelle cellule che esprimono luciferasi rispetto alle cellule che ricevono un siRNA criptato.

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Protocollo

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1. preparazione e caratterizzazione di si-NPs

  1. preparazione si-NP
    1. Sciogliere il polimero in tampone di acido citrico da 10 mM (pH 4,0) a 3,33 mg/mL. Il polimero può prima essere sciolto con una concentrazione di 10 volte in etanolo per garantire la dissoluzione.
      Nota: il polimero può essere disciolto a concentrazioni inferiori, ma l'uso a concentrazioni superiori a 3,33 mg/mL può impedire la formazione di NP omogenee.
    2. Aggiungere siRNA (50 μM in diH2O) per determinare N+:P- rapporto di 10. Miscelare accuratamente le soluzioni di polimero e siRNA pipettando e lasciar Incubare per 30 minuti. Il rapporto N+:P rappresenta il numero di gruppi di ammine caricati positivamente sul polimero al numero di gruppi di fosfato caricati negativamente sul siRNA ed è calcolato dalla seguente formula:
      figure-protocol-1
      dove, mol Pol è la quantità molare del polimero, l'ammina RU è il numero di unità ripetute di ammine cariche positivamente per polimero, mol siRNA è la quantità molare di siRNA, e BP siRNA è il numero di coppie di base per molecola siRNA.
    3. Aggiungere 5 volte l'eccesso di tampone fosfato di 10 mM (pH 8,0) e mescolare delicatamente pipettando o invergendo il tubo. Per confermare che il pH finale è neutro (~ 7.2-7.5), Pipettare 10 μL di soluzione si-NP su strisce di prova di pH.
      Nota: i tamponi di acido citrico e fosfato sono preparati secondo i grafici del centro di riferimento di Millipore Sigma buffer.
  2. Caratterizzazione fisochimica di si-NPs
  3. Registrare le dimensioni e la carica superficiale dei risultanti si-NPs usando la dispersione luminosa dinamica (DLS). Preparare un campione DLS filtrando 1 mL di si-NPs (0,1-1,0 mg/mL) attraverso filtri per siringa da 0,45 μm in una cuvetta quadrata in quarzo o polistirolo. Misura delle dimensioni e della carica superficiale utilizzando uno strumento DLS secondo le specifiche del produttore.
    1. Confermare le dimensioni e la morfologia di si-NPs mediante analisi di imaging mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM).
      1. Aggiungere 5 μL di soluzione si-NP a 1 mg/mL alle griglie TEM e incubare per 60 s. asciugare per 3 s.
      2. Aggiungere 5 μl di soluzione di acetato di uranile al 3% e incubare per 20 s. asciugare per 3 s. griglie a secco durante la notte sotto essiccamento.
      3. Griglie immagine secondo il protocollo stabilito per il microscopio specifico da utilizzare.
    2. Caratterizzare il carico di siRNA in si-NPS a vari N+:P- indici utilizzando il ritardo del gel di agarosio.
      1. Per produrre 2% gel di agarosio, aggiungere 2 g di polvere di agarosio di grado elettroforesi a 100 mL di 1 tampone TAE (tris-acetato-EDTA) a pH 8,0. Mescolare per sospendere l'agarosio. Calore scoperto nel forno a microonde fino a quando tutto l'agarosio è sciolto (1-3 min).
      2. Una volta raffreddato, aggiungere 5 μL di bromuro di etidium (10 mg/mL in H2O) e mescolare bene. Versare l'agarosio in un vassoio di gel e posizionare il pettine per produrre pozzi, lasciando asciugare per 30 minuti. rimuovere con cautela il pettine per lasciare dietro i pozzi di carico, e riempire il vassoio di gel alla linea di riempimento max con 1x tampone TAE.
      3. Generare si-NPs (secondo la procedura di cui sopra) a 0, 1, 2, 5, 7, 10, 20, e 40 N+:P- indici. Posizionare 2 μL di aliquote di colorante di carico (senza SDS e agenti riducenti) sulla pellicola di paraffina per ogni formulazione di si-NP. Miscelare 10 μL di soluzione si-NP con colorante di carico su pellicola di paraffina mediante pipetta.
      4. Aggiungere si-NP/caricare le soluzioni coloranti ai pozzi di gel di agarosio. Eseguire la tensione di alimentazione a 100 V per 35 min (o fino a quando i campioni sono attraversati 80% della lunghezza del gel).
      5. Visualizza le bande siRNA su un transilluminatore UV secondo le specifiche del produttore.

2. determinazione della bioattività in vitro di si-NP

  1. Knockdown del modello gene luciferasi
    1. Generare luciferasi si-NPS (secondo la procedura di cui sopra) utilizzando luciferasi siRNA e strapazzate si-NPS utilizzando una sequenza siRNA strapazzate come un controllo. Formualte sia si-NPs allo stesso finale N+:P- ratio e al rapporto ottimale identificato dagli studi di ritardo del gel di agarosio. Le sequenze siRNA di esempio sono incluse nella tabella dei materiali.
    2. Cellule che esprimono la luciferasi del seme [MDA-MB-231/luciferase (BSD) celle stabili] in 96-piastre a parete nera con una densità di 2.000 cellule per pozzo. Lasciar aderire durante la notte nei media completi (DMEM, 10% FBS) in un incubatore (37 ° c, 5% CO2, 95% di umidità).
    3. Diluire si-NPs in media sierica completa per un volume finale di 100 μL per pozzetto e la concentrazione di siRNA di 100 nM. Trattare le cellule per 24 h con si-NPs.
    4. Dopo 24 h, rimuovere i trattamenti e sostituire il supporto con un supporto siero pieno contenente 150 μg/mL D-luciferina. Incubare le cellule per 5 minuti prima di misurare la luminescenza su un lettore di piastre o un sistema di imaging ottico in vivo secondo le specifiche del produttore.
    5. Sostituire i supporti contenenti luciferina con supporti di siero freschi e pieni e incubare 24 ore in più. Ripetere il passaggio precedente, rimuovendo i supporti e sostituendo con un supporto siero pieno contenente 150 μg/mL D-luciferina, seguita da un'incubazione di 5 minuti prima di misurare la luminescenza al punto temporale 48 h.
    6. Per gli studi longitudinali, mantenere le cellule in condizioni sterili durante la misurazione della luminescenza. Continuare la coltura in media fresco e pieno tra le misurazioni dopo la sostituzione di luciferina-contenente.
      Nota: la concentrazione appropriata di siRNA varierà con diverse molecole di si-NPs e siRNA. Quando si utilizzano poliplexi neutralmente caricati con un nucleo endosomolitico (ad esempio PEG-DB), 100 nM è tipicamente ben tollerato dalle cellule e produce > 75% di knockdown di luciferasi. Il rapporto di massa di PEG-DB a siRNA a 10 N+:P- ratio e 100 Nm siRNA trattamenti (assumendo 26 BP sirna) è 23,3, cioè, aggiungere 23,3 ng di PEG-DB per ogni 1,0 ng di siRNA. Ad esempio, aggiungere 1,16 μL di 3,33 mg/mL di polimero per 166,5 ng di siRNA per trattare un pozzo a 100 nM in una piastra 96-well (100 mL di volume media per pozzo).

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Risultati

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Alcune caratteristiche essenziali di efficace si-NPs per la consegna in vivo siRNA sono la dimensione corretta (~ 20 – 200 Nm di diametro), siRNA imballaggio, e la bioattività di silenziamento genico. Anche se questo non è un elenco esaustivo (come affrontato nella discussione), queste caratteristiche di base devono essere confermate prima di considerare ulteriori test di una formulazione.

La Figura 2

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Discussione

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I si-NPs qui descritti sono formati da un'associazione elettrostatica di siRNA anionica e polimeri cationici in complessi poliioni (polyplexes). La complessazione elettrostatica di siRNA e il blocco DB cationico dei polimeri PEG-DB sono facilitati dalla miscelazione a basso pH (4,0). A pH 4,0, DMAEMA è altamente protonated, e di conseguenza il blocco DB è altamente carico. Questo assicura che i polimeri si dissolvano come unimers in soluzione al contrario di formare micelle e che i complessi DB in modo efficiente con siR...

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Dichiarazioni

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Gli autori non rivelano potenziali conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Gli autori sono grati a DRS. Craig Duvall e Rebecca Cook per l'accesso a dati e risorse di laboratorio per lo svolgimento di questa ricerca. Gli autori sono grati al Vanderbilt Institute for nanoscala Science and Engineering (VINSE) per l'accesso agli strumenti DLS e TEM (NSF EPS 1004083). Gli autori sono grati alla National Science Foundation per aver sostenuto il programma di borse di ricerca graduate (NSF # 1445197). Gli autori sono grati agli istituti nazionali di sanità per il sostegno finanziario (NIH R01 EB019409). Gli autori sono grati al dipartimento di difesa Congressionalmente diretto programma di ricerca medica per il sostegno finanziario (DOD CDMRP OR130302).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,45 μ Filtri per siringa m poriThermo Fisher ScientificF2513317 mm, membrana in PTFE
0-14 strisce reattive pHMillipore SigmaP4786
10x tampone TAEThermo Fisher Scientific/InvitrogenAM9869
6-7,7 strisce reattive pHMillipore SigmaP3536
piastre a 96 pozzetti a parete neraCorning3603Polvere di agarosio trattata con coltura tissutale
Thermo Fisher Scientific/Invitrogen16500
Acido citrico monoidratoMillipore SigmaC1909
fosfato di sodio bibasico diidratoMillipore Sigma71643
D-luciferinaThermo Fisher Scientific88294Sale monopotassico
DMEMGibco11995065Alto glucosio e piruvato
EtanoloMillipore Sigma459836
bromuro di etidioThermo Fisher Scientific/Invitrogen15585011
FBSGibco 26140079
caricamento coloranteThermo Fisher Scientific/InvitrogenR0611
Luciferase siRNAIDTN/ASequenza del filamento antisenso: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC
AAUUGUU
Sequenza del filamento senso: CAAUUGCACU
GAUAAUGAACUCCT*C* *Basi del DNA
MDA-MB-231 / Cellule stabili della luciferasi (Bsd)GenTarget IncSC059-BsdCellule che esprimono la luciferasi citate in giudizio per valutare la bioattività del si-NP
fosfato di sodio monobasico monoidratoMillipore SigmaS9638
Scarmbled siRNAIDTN/ AAntisense Strand Sequense: AUACGCGUAUU
AUACGCGAUUAACGAC
Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUAC
GCGUA*T* *Basi DNA cuvette quadrate
polistireneFisher Scientific14-955-129Griglie TEM da 4,5 ml di capacità
Ted Pella, Inc.1GC50PELCO Griglie con marcatura centrale, 50 mesh, diametro esterno 3,0 mm,
rame citrato trisodico diidratoMillipore SigmaS1804
acetato di uranilePolysciences, Inc.Codice 21447-25
diametro in

Riferimenti

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