Sono presentati metodi per preparare e caratterizzare le proprietà fisico-chimiche e la bioattività delle nanoparticelle siRNA reattive al pH neutralmente caricate. Sono discussi i criteri per le nanomedicine siRNA di successo come le dimensioni, la morfologia, la carica superficiale, il carico di siRNA e il silenziamento genico.
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Articolo metodologico
Preparazione di nanoparticelle polimeriche neutralmente cariche e sensibili al pH per la consegna del siRNA citosolico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il successo di siRNA come medicina molecolare mirata dipende dalla sua efficace somministrazione citosolica alle cellule all'interno del tessuto della patologia. È stato raggiunto il successo clinico per il trattamento degli obiettivi di malattia epatica precedentemente "non ondulabili" con siRNA. Tuttavia, efficace somministrazione di siRNA tumorale richiede ulteriori considerazioni di progettazione farmacocinetica, tra cui lungo tempo di circolazione, l'evasione degli organi di clearance (ad esempio, fegato e reni), e la penetrazione del tumore e ritenzione. Qui descriviamo la preparazione e la caratterizzazione fisico-chimica/biologica in vitro di nanoparticelle polimeriche progettate per una consegna efficiente del siRNA, in particolare per i tessuti non epatici come i tumori. Le nanoparticelle di siRNA sono preparate con la complessazione elettrostatica di siRNA e il diblock Copolimero Poly (etilene glicole-b-[2-(dimethylamino) etil metacrilato-co-butile metacrilato]) (PEG-DB) per formare complessi poliionici ( polyplexes) dove siRNA è sequestrato all'interno del nucleo Polyplex e PEG forma una corona idrofila, neutralmente caricata. Inoltre, il blocco DB diventa membrana-Lisica come vescicole della via endolysosomiale acidificante (< pH 6,8), innescando la fuga endosomiale e la somministrazione citosolica di siRNA. Sono descritti i metodi per caratterizzare le caratteristiche fisico-chimiche delle nanoparticelle di siRNA, come la dimensione, la carica superficiale, la morfologia delle particelle e il caricamento del siRNA. La bioattività delle nanoparticelle di siRNA viene misurata utilizzando la luciferasi come gene modello in un saggio di silenziamento genico rapido e ad alto rendimento. I disegni che superano questi test iniziali (come i poliplexi basati su PEG-DB) sono considerati appropriati per la traduzione in studi preclinici sugli animali che valutano la somministrazione di siRNA a tumori o altri siti di patologia.
Introduzione
Poiché i siRNA inibiscono la traduzione delle proteine dalle sequenze di mRNA, possono teoricamente essere usati per la droga tutte le patologie conosciute1,2,3,4,5. Tuttavia, l'uso di siRNA in medicina è limitato dal profilo farmacocinetico globalmente scarso delle molecole di siRNA6,7. Quando iniettato per via endovenosa, i siRNA vengono rapidamente cancellati attraverso i reni e/o degradati dalle nucleasi8,
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Protocollo
1. preparazione e caratterizzazione di si-NPs
- preparazione si-NP
- Sciogliere il polimero in tampone di acido citrico da 10 mM (pH 4,0) a 3,33 mg/mL. Il polimero può prima essere sciolto con una concentrazione di 10 volte in etanolo per garantire la dissoluzione.
Nota: il polimero può essere disciolto a concentrazioni inferiori, ma l'uso a concentrazioni superiori a 3,33 mg/mL può impedire la formazione di NP omogenee. - Aggiungere siRNA (50 μM in diH2O) per determinare N+:P- rapporto di 10. Miscelare accuratamente le soluzioni di polimero e siRNA pipettando e lasciar Incubare per 30 minuti. Il rapporto N
- Sciogliere il polimero in tampone di acido citrico da 10 mM (pH 4,0) a 3,33 mg/mL. Il polimero può prima essere sciolto con una concentrazione di 10 volte in etanolo per garantire la dissoluzione.
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Risultati
Alcune caratteristiche essenziali di efficace si-NPs per la consegna in vivo siRNA sono la dimensione corretta (~ 20 – 200 Nm di diametro), siRNA imballaggio, e la bioattività di silenziamento genico. Anche se questo non è un elenco esaustivo (come affrontato nella discussione), queste caratteristiche di base devono essere confermate prima di considerare ulteriori test di una formulazione.
La Figura 2
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Discussione
I si-NPs qui descritti sono formati da un'associazione elettrostatica di siRNA anionica e polimeri cationici in complessi poliioni (polyplexes). La complessazione elettrostatica di siRNA e il blocco DB cationico dei polimeri PEG-DB sono facilitati dalla miscelazione a basso pH (4,0). A pH 4,0, DMAEMA è altamente protonated, e di conseguenza il blocco DB è altamente carico. Questo assicura che i polimeri si dissolvano come unimers in soluzione al contrario di formare micelle e che i complessi DB in modo efficiente con siR.......
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Dichiarazioni
Gli autori non rivelano potenziali conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Gli autori sono grati a DRS. Craig Duvall e Rebecca Cook per l'accesso a dati e risorse di laboratorio per lo svolgimento di questa ricerca. Gli autori sono grati al Vanderbilt Institute for nanoscala Science and Engineering (VINSE) per l'accesso agli strumenti DLS e TEM (NSF EPS 1004083). Gli autori sono grati alla National Science Foundation per aver sostenuto il programma di borse di ricerca graduate (NSF # 1445197). Gli autori sono grati agli istituti nazionali di sanità per il sostegno finanziario (NIH R01 EB019409). Gli autori sono grati al dipartimento di difesa Congressionalmente diretto programma di ricerca medica per il sostegno finanziario (DOD CDMRP OR1303....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,45 μ Filtri per siringa m pori | Thermo Fisher Scientific | F25133 | 17 mm, membrana in PTFE |
| 0-14 strisce reattive pH | Millipore Sigma | P4786 | |
| 10x tampone TAE | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | AM9869 | |
| 6-7,7 strisce reattive pH | Millipore Sigma | P3536 | |
| piastre a 96 pozzetti a parete nera | Corning | 3603 | Polvere di agarosio trattata con coltura tissutale |
| Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 16500 | ||
| Acido citrico monoidrato | Millipore Sigma | C1909 | |
| fosfato di sodio bibasico diidrato | Millipore Sigma | 71643 | |
| D-luciferina | Thermo Fisher Scientific | 88294 | Sale monopotassico |
| DMEM | Gibco | 11995065 | Alto glucosio e piruvato |
| Etanolo | Millipore Sigma | 459836 | |
| bromuro di etidio | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 15585011 | |
| FBS | Gibco 26140079 | ||
| caricamento colorante | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | R0611 | |
| Luciferase siRNA | IDT | N/A | Sequenza del filamento antisenso: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC AAUUGUU Sequenza del filamento senso: CAAUUGCACU GAUAAUGAACUCCT*C* *Basi del DNA |
| MDA-MB-231 / Cellule stabili della luciferasi (Bsd) | GenTarget Inc | SC059-Bsd | Cellule che esprimono la luciferasi citate in giudizio per valutare la bioattività del si-NP |
| fosfato di sodio monobasico monoidrato | Millipore Sigma | S9638 | |
| Scarmbled siRNA | IDT | N/ A | Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUU AUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUAC GCGUA*T* *Basi DNA cuvette quadrate |
| polistirene | Fisher Scientific | 14-955-129 | Griglie TEM da 4,5 ml di capacità |
| Ted Pella, Inc. | 1GC50 | PELCO Griglie con marcatura centrale, 50 mesh, diametro esterno 3,0 mm, | |
| rame citrato trisodico diidrato | Millipore Sigma | S1804 | |
| acetato di uranile | Polysciences, Inc. | Codice 21447-25 |
Riferimenti
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mam....
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Ristampe e permessi
