Abbiamo convertito con successo il saggio di protocollo di amplificazione (TRAP) di teleomere standard per essere impiegato nelle reazioni a catena della polimerasi digitale delle gocce. Questo nuovo saggio, chiamato ddTRAP, è più sensibile e quantitativo, permettendo una migliore rilevazione e analisi statistica dell'attività telomerasi all'interno di varie cellule umane.
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Articolo metodologico
Droplet Digital TRAP (ddTRAP): adattamento del protocollo di amplificazione di ripetizione telomere a droplet reazione a catena della polimerasi digitale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il protocollo di amplificazione di ripetizione dei telomeri (trap) è il saggio più diffuso per rilevare l'attività telomerasi all'interno di un dato campione. Il metodo basato sulla reazione a catena della polimerasi (PCR) consente misurazioni robuste dell'attività enzimatica dalla maggior parte dei lisati cellulari. Il TRAP a base di gel con primer con etichetta fluorescente limita la velocità di campionamento e la capacità di rilevare le differenze nei campioni è limitata a due o più cambiamenti nell'attività enzimatica. Il goccia Digital trap, ddtrap, è un approccio altamente sensibile che è stato modificato dal tradizionale saggio TRAP, permettendo all'utente di eseguire un'analisi robusta su 96 campioni per corsa e ottenere una quantificazione assoluta del DNA (prodotti di estensione telomerasi ) all'interno di ciascuna PCR. Pertanto, il saggio ddTRAP di nuova concezione supera i limiti del tradizionale saggio TRAP basato su gel e fornisce un approccio più efficiente, accurato e quantitativo per misurare l'attività della telomerasi all'interno di contesti clinici e di laboratorio.
Introduzione
I telomeri sono complessi di proteine del DNA dinamici alle estremità dei cromosomi lineari. I telomeri umani sono composti da una serie di ripetizioni di 5'-TTAGGGn formazione del esamerico che variano in lunghezza tra 12 – 15 chilobasi (KB) alla nascita1. La telomerasi umana, l'enzima ribonucleoproteina che mantiene i telomeri, è stato identificato per la prima volta nei lisati delle cellule di hela (linea cellulare tumorale)2. Insieme, telomeri e telomerasi giocano un ruolo importante in uno spettro di processi biologici come la protezione del genoma, la regolazione genica e l'immortalità delle cellule tumo....
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Protocollo
1. preparazione e stoccaggio del tampone
- Preparare 50 mL di 1x tampone di lisi RNasi-/DNase-free NP-40 Lysis (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM MgCl2, 1 mm acido etilendiamaminetetraacetico (EDTA), 1% [VOL/VOL] NP-40, 10% [VOL/VOL] glicerolo, 150 mm NaCl, 5 mm β-mercaptoetanolo e 0,1 mm 4- fluoruro di benzenesulfonile (AEBSF)). Questo buffer può essere aliquotato e conservato a-20 ° c per un uso futuro. Evitare cicli di congelamento/scongelamento al fine di ottenere una lisi ottimale delle cellule.
- Preparare 50 mL di tampone di estensione della trappola di RNAsi-/DNase-free 10x Stock (200 mM Tris-HCl [pH 8,0], 15 mM MgCl2, 630 mm ....
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Risultati
Utilizzando il ddTRAP, l'attività telomerasi è stata misurata in un pannello cellulare costituito dalle seguenti linee cellulari (Figura 1): carcinoma polmonare non a piccole cellule (H2882, H1299, Calu6, H920, A549 e H2887), carcinoma polmonare a piccole cellule (H82 e SHP77), e telomerasi-negativo fibroblasti (BJ). 1 milione pellet di cellule sono stati lisati in NP-40 buffer, e le reazioni di estensione telomerasi sono state eseguite in triplicates biologi.......
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Discussione
La misurazione dell'attività di telomerasi è fondamentale per una pletora di argomenti di ricerca tra cui, ma non limitati a, cancro, biologia dei telomeri, invecchiamento, medicina rigenerativa e progettazione di farmaci basati sulla struttura. Telomerasi RNP sono bassi abbondanti, anche nelle cellule tumorali, rendendo la rilevazione e lo studio di questo enzima impegnativo. In questo documento, abbiamo descritto le procedure passo-passo per il saggio ddTRAP di nuova concezione per quantificare in modo affidabile l'att.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori vorrebbero riconoscere le fonti di finanziamento degli istituti nazionali di sanità (NIH) (NCI-R00-CA197672-01A1). Le linee di carcinoma polmonare a piccole cellule (SHP77 e H82) erano un dono generoso di DRS. John Minna e Adi Gazdar dal centro medico UT Southwestern.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl pH 8,0 | Ambion | AM9855G | RNAse/DNAsi |
| libero 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | RnAse/DNAsi |
| libero 0,5 M EDTA pH 8,0 | Ambion | AM9261 | RNAse/DNAsi |
| libero Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% glicerolo ultrapuro | Invitrogen | 15514011 RNAsi/DNAsi | |
| fluoruro di fenilmetilsulfonile | Thermo Scientific | 36978 | Polvere |
| 2-Mercaptoetanolo | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Senza nucleasi H20 | Ambion | AM9932 | Senza RNAsi/DNAsi |
| 2,5 mM miscela dNTP | Thermo Scientific | R72501 | 2,5 mM di ogni dATP, dCTP, dGTP e dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | privo di RNAsi/DNAsi |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0,5 M EGTA pH 8,0 | Fisher | 50-255-956 | (TS) privo di RNAsi/DNA |
| Primer | del DNA integrata (IDT) | Primer personalizzato (HPLC purificato) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'ACX |
| (Revers) Primer | Tecnologia del DNA integrata (IDT) | Primer personalizzato (HPLC purificato) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3'Provette |
| a parete sottile (250 ul) per PCR | USA Scientific | 1402-2900 | strisce, piastre, provette ecc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec 96 Well Plate | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Piercable lamina di tenuta termica | Bio Rad | 1814040 | |
| Cartucce per generatore di gocce (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Olio per generatore di gocce | Bio Rad | 1863005 | |
| Guarnizione per generatore di gocce | Bio Rad | 1863009 | |
| Termociclatore a 96 pozzetti T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 Sigillante per piastre PCR | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Lettore di gocce e software Quantasoft Bio | Rad | 1864001 e 1864003 | |
| Puntali per pipette filtrati senza nucleasi | Thermo Scientifico | 10 ul, 20 ul , 200 ul e 1000 ul |
Riferimenti
- Frenck, R. W. Jr, Blackburn, E. H., Shannon, K. M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).
- Morin, G. B.
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Ristampe e permessi
