Qui, presentiamo un protocollo per un test di immunofluorescenza indiretta a fluttuazione libera sulle sezioni di biopsia cutanea che consente l'identificazione di varianti di conformazione specifiche della malattia di sinucleina alfa coinvolte nella malattia di Parkinson e proteine multiple del sistema nervoso periferico.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Targeting Alpha Synuclein Aggregati in cutaneous periferici nervose fibre nervose da Pro(Enunciante autofluorescenza libera)
In questo articolo
Sommario
Abstract
Ad oggi, per la maggior parte delle malattie neurodegenerative è disponibile solo una diagnosi definitiva istopatologica post-mortem. Per il morbo di Parkinson (PD), la diagnosi si basa ancora solo su segni clinici di coinvolgimento motorio che appaiono più tardi nel corso della malattia, quando la maggior parte dei neuroni dopaminergici sono già persi. Quindi, c'è una forte necessità di un biomarcatore in grado di identificare i pazienti all'inizio della malattia o a rischio di svilupparlo. Negli ultimi anni, la biopsia cutanea si è rivelata un eccellente strumento di ricerca e diagnostica per le malattie nervose periferiche come la piccola neuropatia delle fibre. È interessante notare che, una piccola neuropatia della fibra e sinucleina alfa (SynSyn) depositi neurali sono stati mostrati dalla biopsia della pelle in pazienti affetti da PD. Infatti, la biopsia cutanea ha il grande vantaggio di essere una procedura facilmente accessibile, minimamente invasiva e indolore che consente l'analisi del tessuto nervoso periferico incline alla patologia. Inoltre, la possibilità di ripetere la biopsia cutanea nel corso del follow-up dello stesso paziente consente di studiare la correlazione longitudinale con la progressione della malattia. Abbiamo istituito un protocollo affidabile standardizzato per studiare la presenza di aggregati di Syn nelle fibre nervose della pelle del paziente PD. Questo protocollo prevede pochi brevi passaggi di fissazione, una sezionamento criotomeo e poi una doppia colorazione immunofluorescenza a fluttuazione libera con due anticorpi specifici: antiproteina Gene Product 9.5 (PGP9.5) per contrassegnare le fibre nervose cutanee e anti 5G4 per la rilevazione di : syn. Si tratta di un protocollo versatile, sensibile e facile da eseguire che può essere applicato anche per colpire altre proteine di interesse nei nervi della pelle. La capacità di contrassegnare gli aggregati di Syn è un altro passo avanti verso l'uso della biopsia cutanea come strumento per stabilire una diagnosi istologica pre-mortem della PD.
Introduzione
La biopsia cutanea ha acquisito una grande importanza come strumento diagnostico e di ricerca nel campo dei disturbi neurologici1. Infatti, epidermide e dermide contengono abbondanti fibre nervose sensoriali somatiche (mielinate e non mitielinate), terminazioni nervose libere nocicettive, recettori sensoriali e innervazione autonoma di ghiandole sudoripare, vasi, ghiandole sebacee e muscolo arrectorilorum 2.
A metà del XX secolo, l'installazione per l'immunohistochimica dell'anticorpo PGP9.5 ha permesso l'evidenza di un'ampia innervazione della pelle di mammifero dell'epidermide uma....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico cantonale e tutti i soggetti arruolati hanno dato il consenso informato scritto allo studio.
1. Collezione di biopsia cutanea
- Consentire a un medico qualificato di eseguire la biopsia cutanea in un ambiente clinico appropriato.
- Scegli l'area per eseguire la biopsia della pelle e pulirla con un tampone alcolico.
- Preparare la soluzione anestetica con 1 cc di lidocaine 2%.
- Con l'ago parallelo alla zona, iniettare l'anestesia locale sottocutaneamente.
- Dopo aver controllato l'effetto dell'anestesia, prendi il punzone usa e getta da 3 mm e applica....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Seguendo la procedura descritta (Figura1), abbiamo rilevato aggregati di Syn, etichettati con anticorpi 5G4, in fascicoli nervosi dermici innervaccando le strutture autonomiche dei pazienti affetti da PD. La morfologia dei depositi alfa-sinucleina appare come un segnale punteggiato lungo gli assoni dei nervi dermici (Figura 2). Infatti, sfruttando questo protocollo in 19 pazienti affetti da PD e 17 controlli nelle biopsie cutanee in tre siti anatomici (collo del.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Descriviamo un test di immunofluorescenza fluttuante per le biopsie cutanee per la diagnosi della PD: sfrutta la doppia immunostaining con anticorpi anti-PGP9.5, un marcatore panassonale e anti-5G4, un anticorpo specifico della conformazione che riconosce la forma aggregata di "Syn".
I grandi vantaggi della biopsia cutanea a scopo diagnostico nella PD e possibilmente in altri disturbi conformazionali proteici sono: 1) l'accesso diretto al tessuto nervoso incline alla malattia con una tecnica l.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Parkinson Schweiz e ABREOC (comitato consultivo per la ricerca scientifica dell'Enteo Cantonale) per il loro sostegno finanziario a questo studio.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 5G4 (anti umano & alfa; Syneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Topo monoclonale |
| AlexaFluor 488 Capra anti Coniglio IgG | Invitrogen | 1971418 | 2 mg/mL |
| AlexaFluor 594 Capra anti Topo IgG | Invitrogen | 1922849 | 2 mg/mL |
| Soluzione di idrogeno fosfato disodico | Merk Millipore | 106586 | |
| Glicole etilenico | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glicerolo | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-Lisina monocloridrato | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Paraformaldeide | Aldrich Chimica | ||
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | policlonale di coniglio |
| Sigma | S3014 | ||
| Diidrogeno fosfato di sodio monoidrato | Merck Millipore | 106346 | |
| (meta)periodato di sodio | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Supporto di montaggio |
Riferimenti
- McArthur, J. C., Griffin, J. W. Another Tool for the neurologist's Tollbox. Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).
- Wilkinson, P. F., Millington, R. Skin. , Cambridge University Press. Cambridge. ISBN 978-0-521-10681-8 49-50 (2009).
- Weddell, G., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
