Articolo metodologico

Guardando verso l'esterno: Isolamento dei polimeri e delle proteine di carboidrati rilasciati in cianobatteria

DOI:

10.3791/59590

⸱

27 maggio 2019

 , 
1Bioengineering and Synthetic Microbiology Group, Instituto de Investigação e Inovação em Saude, Universidade do Porto, 2Instituto de Biologia Celular e Molecular, Universidade do Porto, 3Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, 4Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências, Universidade do Porto

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, vengono descritti i protocolli per l'isolamento dei polimeri di carboidrati rilasciati cianobatterici e l'isolamento dei loro esoproteomi. Entrambe le procedure incorporano i passaggi chiave per ottenere polimeri o proteine con gradi di elevata purezza che possono essere utilizzati per ulteriori analisi o applicazioni. Possono anche essere facilmente adattati in base alle esigenze specifiche dell'utente.

Abstract

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I cianobatteri possono secernere attivamente una vasta gamma di biomolecole nell'ambiente extracellulare, come eteropolisaccaridi e proteine. L'identificazione e la caratterizzazione di queste biomolecole può migliorare la conoscenza delle loro vie di secrezione e contribuire a manipolarle. Inoltre, alcune di queste biomolecole sono interessanti anche in termini di applicazioni biotecnologiche. Qui sono descritti due protocolli per un facile e rapido isolamento di polimeri e proteine di carboidrati rilasciati acinobatteri. Il metodo per l'isolamento dei polimeri di carboidrati rilasciati si basa su tecniche convenzionali di precipitazione di polisaccarides in soluzioni acquose che utilizzano solventi organici. Questo metodo conserva le caratteristiche del polimero ed evita contemporaneamente la presenza di contaminanti da detriti cellulari e mezzi di coltura. Alla fine del processo, il polimero lofilofilizzato è pronto per essere utilizzato o caratterizzato o può essere sottoposto a ulteriori cicli di purificazione, a seconda dell'uso previsto finale. Per quanto riguarda l'isolamento dell'esoprotema cianobatterico, la tecnica si basa sulla concentrazione del mezzo privo di cellule dopo la rimozione dei principali contaminanti mediante centrifugazione e filtrazione. Questa strategia consente un isolamento affidabile delle proteine che raggiungono l'ambiente extracellulare tramite trasportatori di membrana o vesciche di membrana esterne. Queste proteine possono essere successivamente identificate utilizzando tecniche standard di spettrometria di massa. I protocolli qui presentati possono essere applicati non solo a una vasta gamma di cianobatteri, ma anche ad altri ceppi batterici. Inoltre, queste procedure possono essere facilmente adattate in base all'uso finale dei prodotti, al grado di purezza richiesto e alla deformazione batterica.

Introduzione

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I cianobatteri sono ampiamente riconosciuti come fonti prolifiche di prodotti naturali con promettenti applicazioni biotecnologiche/biomediche. Pertanto, la comprensione dei meccanismi di secrezione cianobatterici e l'ottimizzazione dei metodi di estrazione/recupero sono essenziali per implementare i cianobatteri come fabbriche di cellule microbiche efficienti.

Molti ceppi cianobatterici sono in grado di produrre sostanze polimeriche extracellulari (EPS), formate principalmente da eteropolisidi, che rimangono associate alla superficie cellulare o vengono rilasciate nel mezzo1. Questi polimeri di carboidrati rilasciati hanno caratteristiche distinte rispetto a quelle di altri batteri, che li rendono adatti per una vasta gamma di applicazioni (ad esempio, antivirali2, immunostimolatori3 , antiossidanti4, chelazione metallica5, emulsionando6e agenti di somministrazione di farmaci7,8). La metodologia per l'isolamento di questi polimeri contribuisce in gran parte non solo al miglioramento della resa, ma anche ad una maggiore purezza e alle proprietà fisiche specifiche del polimero ottenute9. La stragrande maggioranza di questi metodi per l'isolamento dei polimeri si basa su strategie di precipitazione del mezzo di coltura che sono facilmente realizzabili a causa della forte natura anionica del polimero9,10. Inoltre, la rimozione dei solventi utilizzati nella fase di precipitazione può essere rapidamente ottenuta mediante evaporazione e/o liofilizzazione. A seconda dell'applicazione prevista, è possibile associare diversi passaggi dopo o prima della precipitazione polimerica per personalizzare il prodotto finale, che includono il trattamento dell'acido tricloroacetico (TCA), la filtrazione o la cromatografia di esclusione delle dimensioni (SEC) purificazione colonna10.

I cianobatteri sono anche in grado di secernere una vasta gamma di proteine attraverso percorsi dipendenti da trasportatori di membrana (classica)11 o mediati da vescicoli (non classici)12. Pertanto, l'analisi dell'esoproteoma cianobatterico costituisce uno strumento essenziale, sia per comprendere/manipolare i meccanismi di secrezione delle proteine cianobatteriche e comprendere la specifica funzione extracellulare di queste proteine. L'isolamento affidabile e l'analisi degli esoproteomi richiedono la concentrazione dell'ambiente extracellulare, poiché l'abbondanza di proteine secrete è relativamente bassa. Inoltre, altri passaggi fisici o chimici (ad esempio, centrifugazione, filtrazione o precipitazioni proteiche) possono ottimizzare la qualità dell'esoproteoma ottenuto, arricchendo il contenuto proteico13,ed evitando la presenza di contaminanti (ad esempio, pigmenti, carboidrati, ecc. 14 Del sistema , 15 o la predominanza delle proteine intracellulari nei campioni. Tuttavia, alcuni di questi passaggi possono anche limitare l'insieme di proteine che possono essere rilevate, portando ad un'analisi di parte.

Questo lavoro descrive protocolli efficienti per l'isolamento dei polimeri di carboidrati rilasciati e degli esoproteomi dai media di coltura dei cianobatteri. Questi protocolli possono essere facilmente adattati agli obiettivi specifici dello studio e alle esigenze degli utenti, pur mantenendo i passaggi di base presentati qui.

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Protocollo

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1. Cianobacterial rilasciato isolamento polimero di carboidrati

  1. Isolamento e rimozione di polimeri e rimozione dei contaminanti
    1. Coltivare la varietà cianobatterica in condizioni standard [ad esempio, 30 gradi sotto una luce di 12 h (50 e2 s2s )/12 h regime scuro, con scosse orbitali a 150 rpm]. Misurare la crescita utilizzando protocolli standard [ad esempio, densità ottica a 730 nm (OD730nm), clorofilla un, peso secco, ecc.], quindi misurare la produzione di polisaccharides rilasciati secondo il metodo dell'acido fenolo-solforico16.
    2. Trasferire la coltura nelle membrane di dialisi (12-14 kDa di peso molecolare cut-off) e dialisire contro un minimo di 10 volumi di acqua deionizzata per 24 h con agitazione continua.
      NOTA: A seconda del volume della cultura per dialisizzare e composizione media, potrebbe essere necessario modificare l'acqua di dialisi.
    3. Centrifugare la coltura a 15.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi. Trasferire il super-ataltuo in una nuova fiala e scartare il pellet (cellule).
    4. Centrifuga di nuovo a 20.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi per rimuovere i contaminanti come i detriti della parete cellulare o i lipopoliosaccori (LPS).
    5. Trasferire il supernatante in un bicchiere di vetro e scartare il pellet.
  2. Precipitazioni del polimero
    1. Aggiungere 2 volumi di 96% di etanolo al supernatante.
    2. Incubare la sospensione a 4 gradi centigradi, almeno durante la notte.
    3. Recupero polimerico
      1. Per piccole o non visibili quantità di polimero precipitato: centrifugare la sospensione a 13.000 x g per 25 min a 4 gradi centigradi. Scartare il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL o 2 mL di acqua autoclaved deionizzata. Trasferire la sospensione aqueous in una fiala.
        AVVISO: Il supernatante deve essere scartato delicatamente, in quanto può diventare facilmente risospeso.
      2. Per quantità visibili/grandi di polimero precipitato: raccogliere il polimero precipitato con pinze metalliche sterili su una fiala. Spremere il polimero e scartare l'etanolo in eccesso.
    4. Facoltativo: a seconda del grado di purificazione del polimero richiesto, ripetere la fase di precipitazione con il 96% di etanolo dopo la sospensione dei polimeri in acqua deionizzata.
  3. Lofilazione del polimero
    1. Tenere le fiale con il polimero precipitato a -80 gradi centigradi, almeno durante la notte.
    2. Congelare (liofilizzare) il polimero per almeno 48 h (non lasciare che la sospensione si scongeli prima dell'essiccazione).
    3. Conservare il polimero essiccato a temperatura ambiente (RT) fino a un ulteriore utilizzo.
      NOTA: Si consiglia di conservare il polimero in un desiccatore, in quanto può assorbire acqua nel tempo.

2. Isolamento degli esoproteomi cianobatterici

  1. Concentrazione media
    1. Coltivare i cianobatteri in condizioni standard [ad es., 30 gradi sotto una luce di 12 h (50 ,e 2s )/12 h regime scuro, con scosse orbitali a 150 giri/m]. Monitorare la crescita del cianobatterio utilizzando procedure standard (ad esempio, OD730nm, clorofilla, dry-weight, ecc. ).
    2. Centrifugare le colture a 4.000 x g, per 10 min a RT.
    3. Trasferire il supernatante in una fiaschetta e scartare il pellet cellulare.
    4. Filtrare il mezzo decanato attraverso un filtro dimensione poro 0,2 m.
      NOTA: Il protocollo può essere sospeso qui per un breve periodo di tempo, se il supporto è mantenuto a 4 gradi centigradi.
    5. Concentrare il mezzo circa 500x (considerando il volume iniziale del mezzo filtrato), utilizzando concentratori centrifughi con un peso molecolare nominale cut-off di 3 kDa. La centrifugazione deve essere azionata a 4.000 x g (massimo 1 h per ciclo di centrifugazione) a 15 gradi centigradi.
      AVVISO: Per la maggior parte delle marche di concentratori, il dispositivo di filtro deve essere sciacquato dalla centrifugazione con acqua ultrapura prima dell'uso. Una volta che il filtro è bagnato, non lasciarlo asciugare. Lasciare abbastanza liquido sul serbatoio quando il dispositivo non è in uso.
      NOTA: Ridurre la temperatura di centrifugazione a 4 gradi centigradi può essere utile se l'obiettivo è studiare l'attività proteica, anche se aumenterà il tempo necessario per la concentrazione del campione. Il protocollo può essere sospeso tra le fasi di centrifugazione per brevi periodi di tempo se il mezzo è mantenuto a 4 gradi centigradi.
    6. Sciacquare le pareti del serbatoio del campione del dispositivo di filtro con il campione concentrato e trasferire il contenuto in un tubo di microcentrifuga.
    7. Eseguire un ulteriore passaggio di lavaggio del serbatoio del campione del dispositivo di filtro con mezzi di coltura autoclaved per garantire il massimo recupero dell'esoprotema.
      NOTA: per quantificare la percentuale di recupero, seguire le istruzioni del produttore specifico.
    8. Conservare i campioni di esoprotema a -20 gradi centigradi fino a un ulteriore utilizzo.
      NOTA: l'aggiunta di inibitori della proteasi è raccomandata per lo stoccaggio a lungo termine.
  2. Analisi dell'esoprotema
    1. Quantificare il contenuto proteico dal saggio proteico BCA in piastra di 96 pozze secondo le istruzioni del produttore.
    2. Separare le proteine con l'elettroforesi gel (SDS-PAGE) di sodio dodecyl solfato(polyacrilio), utilizzando protocolli di colorazione standard (ad esempio, Coomassie blue, colorazione argento).
    3. Tagliare le regioni di bande/gel di interesse e raccoglierle in diversi tubi di microcentrifuga contenenti volumi appropriati di acqua ultrapura.
    4. Procedere con l'identificazione e l'analisi delle proteine mediante spettrometria di massa.

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Risultati

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Una rappresentazione schematica del metodo descritto per estrarre i polimeri di carboidrati rilasciati dalle colture cianobatteriche è illustrata nella Figura 1. Polimeri precipitati dal moderato produttore EPS cianobatterio Synechocystis sp. PCC 6803 e l'efficiente produttore di EPS Cyanothece sp. CCY 0110 sono mostrati figura 2. Nella Figura 3sono mostrati polimeri lofilizzati con diversi gradi di contaminazione,...

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Discussione

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Per comprendere meglio i meccanismi di secrezione batterica e studiare i prodotti rilasciati, è di estrema importanza dimostrare l'isolamento efficiente e l'analisi delle biomolecole presenti nell'ambiente batterico extracellulare (come polimeri di carboidrati e proteine).

I polimeri di carboidrati extracellulari cianobatterici sono estremamente complessi, principalmente a causa del numero e della proporzione di monosaccori diversi che costituiscono la loro composizione1

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato finanziato dai fondi di Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) attraverso il COMPETE 2020 - Programma Operacional per la competitività e l'internazionalizzazione (POCI), Portogallo 2020, e da fondi portoghesi attraverso FCT - a Tecnologia/Ministério da Cioncia, Tecnologia e Ensino Superior nell'ambito del progetto POCI-01-0145-FEDER-028779 e della sovvenzione SFRH/BD/99715/2014 (CF).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Membrane per dialisiMedicell Membranes Ltd DTV.12000.07Tubo Visking Misura 7, Diametro 23,8 mm, Larghezza 39-41 mm 30m Rotolo
Etanolo 96%AGA - Á lcool e Gé neros Alimentares, S.A.4.000.02.02.00Fermentazione alcol etilico 96% AGA
PES Filtro 0,2 μ mFisher Scientific, Lda15206869Siringa filtro polistirene 33MM 0.2µ M STR 
Amicon Ultra-15, Ultracel-3KMerck Millipore Ltd.UFC900324Filtri centrifughi con un cut-off del peso molecolare nominale di 3 kDa
Thermo Scientific  Dosaggio delle proteine BCA PierceFisher Scientific, Lda10741395Reagente per il dosaggio da verde a blu, preciso e compatibile con i detergenti per misurare la concentrazione proteica totale
Concentrato colloidale Brillant Blue G.Sigma Aldrich Quí mica SLB2025-1EABlu Coomassie 

Riferimenti

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