Protocatechuate 3,4-diossigenasi (PCD) può rimuovere ezimaticamente l'ossigeno diatomico libero da un sistema acquoso utilizzando il suo acido protocatechuico del substrato (PCA). Questo protocollo descrive l'espressione, la purificazione e l'analisi dell'attività di questo enzima di scavenging dell'ossigeno.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Espressione e purificazione di Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Diossigenasi
In questo articolo
Sommario
Abstract
La microscopia a singola molecola (SM) viene utilizzata nello studio delle interazioni molecolari dinamiche delle biomolecole con etichetta fluoroforo in tempo reale. Tuttavia, i fluorofori sono inclini alla perdita di segnale tramite fotosbiancamento mediante ossigeno disciolto (O2). Per prevenire il fotosbiancamento ed estendere la durata del fluoroforo, vengono impiegati sistemi di scavenging dell'ossigeno (OSS) per ridurre O2. L'OSS commercialmente disponibile può essere contaminato da nucleasi che danneggiano o degradano gli acidi nucleici, confondendo l'interpretazione dei risultati sperimentali. Qui abbiamo dettagliato un protocollo per l'espressione e la purificazione di Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-diossigenasi (PCD) senza contaminazione da nuclease rilevabile. La PCD può rimuovere in modo efficiente le specie reattive di O2 mediante la conversione dell'acido protocatechuic del substrato (PCA) in 3 carboxy-cis, acido cis-muconico. Questo metodo può essere utilizzato in qualsiasi sistema acquoso in cui O2 svolge un ruolo dannoso nell'acquisizione dei dati. Questo metodo è efficace nella produzione di PCD altamente attivo e privo di nuclesi o meno rispetto al PCD disponibile in commercio.
Introduzione
La biofisica a singola molecola (SM) è un campo in rapida crescita che cambia il modo in cui guardiamo ai fenomeni biologici. Questo campo ha la capacità unica di collegare le leggi fondamentali della fisica e della chimica alla biologia. La microscopia a fluorescenza è un metodo biofisico che può raggiungere la sensibilità SM. La fluorescenza viene utilizzata per rilevare le biomolecole collegandole a piccoli fluorofori organici o punti quantici1. Queste molecole possono emettere fotoni quando sono eccitate dai laser prima del fotosbiancamento irreversibilmente2. Il fotosbiancamento si verifica quando le etichette fluor....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Indurre l'espressione PCD in E. coli
- Unire 1 pVP91A-pcaHG di espressione PCD espressione pVP91A-pcaHG espressione plasmid (20 ng/l, Figura 1A) e 20 L di E.coli BL21 (20 cellule disponibili in commercio, > 2 x 106 cfu / plaspilofo) in un tubo. Scorrere il tubo per mescolare. Posizionare il tubo sul ghiaccio 5 min.
- Collocare la trasformazione a 42 gradi centigradi per 30 s. Poi ghiaccio 2 min.
- Aggiungere 80 supporti SOC (brodo super ottimale con repressione del gatto: 2,5 mM KCl, 10 mM NaCl, 2% tryptone, 0,5% di estratto di lievito, 10 mM MgSO4, 10 mM ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La PCD per scavenger di ossigeno disponibile in commercio è spesso contaminata da una nucleasi di DNA. La contaminazione dell'attività nuclease potrebbe portare a risultati spuri negli studi fluorescenti, in particolare gli studi che analizzano le proteine che interagiscono con il DNA o il DNA. Abbiamo scoperto che il PCD ricombinante, un eterodimero dell'esaracena etichettata pcaH e pcaG, può essere espresso in E. coli (Figura 1). L'eterodimero viene prima p.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
I sistemi di scavenging dell'ossigeno sono comunemente inclusi nella microscopia a fluorescenza a singola molecola per ridurre il fotosbiancamento3,7,8. Queste tecniche di microscopia sono spesso utilizzate per osservare gli acidi nucleici o le interazioni proteiche con gli acidinucleici1,13,14. La contaminazione di OSS con nucleasi può.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da NIH GM121284 e AI126742 a KEY.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2-mercaptoetanolo | Sigma-Aldrich | M3148 | β Soluzione di |
| acrilammide e bis-acrilammide ME 30%, 29:1 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Acido acetico, agar ACS | Fisherl chimico | A38C-212 | |
| , granulato | BD Biosciences | DF0145-17-0 | |
| Sistema AKTA FPLC | GE Healthcare Life Sciences | Purificatore AKTA: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900 e Frac-920 | |
| Unità di filtro centrifugo Amicon Ultra-2 | EMD Millipore | UFC201024 | 10 kDa MWCO |
| Solfato di ammonio ferro (II) esaidrato | Sigma | F-2262 | |
| Compresse di persolfato di ammonio (APS) | Amresco | K833-100TABS | |
| Ampicillina | Amresco | 0339-25G | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| BD Bacto Terreni di coltura disidratati Additivo: Estratto di lievito in bottiglia | VWR | 90004-092 | |
| BIS-TRIS propano, >=99,0% (titolazione) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| Blu di bromofenolo | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coomassie Blu brillante | Amresco | 0472-50G | |
| Costar 96... Ben piatto– Piastra EIA inferiore | Bio-Rad | 2240096EDU | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco 500ML | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | PBS |
| Bromuro di etidio | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glicerolo | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Brodo LB granulato Miller | EMD Biosciences | 1.10285.0500 | |
| Hi-Res Standard Agarosio | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250-250G | |
| IPTG | Goldbio | I2481C25 | |
| Leupeptin | Roche | 11017128001 | |
| Lisozima da albume d'uovo di gallina | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Cloruro di magnesio esaidrato | Amresco | 0288-1KG | |
| Spettrofotometro per microvolumi, con capacità cuvet | Thermo Fisher | ND-2000C | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| Ni-NTA Superflow (100 ml) | Qiagen | 30430 | |
| Novagen BL21 Competent Cells | EMD Millipore | 69-449-3 | SOC media incluso |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Pepstatin | Gold Biotechnology | P-020-25 | |
| PMSF | Amresco | 0754-25G | |
| Acido protocatechuico | Fisher | Scientific ICN15642110 | PCA |
| Sodio dodecil solfato | P212121 | CI-00270-1KG | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devises | ||
| filtranti monouso sterili con membrana PES > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-04 | |
| Unità filtranti monouso sterili con membrana PES > 500mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-02 | |
| Superose 12 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517301 | |
| TEMED | Amresco | 0761-25ML | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| Typhoon 9410 imager fluorescente a modalità variabile | GE Healthcare Life Sciences | ||
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 |
Riferimenti
- Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).
- Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
