Articolo metodologico

Misurazioni basate su telecamera di [Na+] intracellulare nei miociti atriali murini

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DOI:

10.3791/59600

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27 maggio 2022

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1Center for Biomedical Engineering and Technology and Department of Physiology, University of Maryland School of Medicine, 2Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland

In questo articolo

Sommario

La concentrazione intracellulare di Na+ ([Na+]i) nei miociti cardiaci è alterata durante le malattie cardiache. [Na+]i è un importante regolatore del Ca2+ intracellulare. Introduciamo un nuovo approccio per misurare [Na+]i in miociti atriali murini appena isolati utilizzando una fotocamera EMCCD (Electronlying Multipleplying Charged Coupled Device) e un illuminatore rapido e controllabile.

Abstract

La concentrazione intracellulare di sodio ([Na+]i) è un importante regolatore del Ca2+ intracellulare. Il suo studio fornisce informazioni sull'attivazione dello scambiatore sarcolemmale Na+/Ca2+ , sul comportamento dei canali Na+ voltaggio-dipendenti e sulla Na+,K+-ATPasi. La trasduzione del segnale intracellulare del Ca2+ è alterata nelle malattie atriali come la fibrillazione atriale. Mentre molti dei meccanismi alla base dell'alterata omeostasi intracellulare del Ca2+ sono caratterizzati, il ruolo di [Na+]i e la sua disregolazione nelle patologie atriali sono poco compresi. [Na+]I nei miociti atriali aumenta in risposta all'aumento della velocità di stimolazione. La reattività alla stimolazione del campo esterno è quindi cruciale per le misurazioni di [Na+]i in queste cellule. Inoltre, la lunga preparazione (caricamento del colorante) e la durata dell'esperimento (calibrazione) richiedono un protocollo di isolamento che produca miociti atriali di qualità eccezionale. A causa delle piccole dimensioni degli atri di topo e della composizione della matrice intercellulare, l'isolamento di miociti atriali murini adulti di alta qualità è difficile. Qui, descriviamo un protocollo di isolamento ottimizzato basato sulla perfusione di Langendorff che offre costantemente un'elevata resa di miociti murini atriali di alta qualità.

L'isoftalato benzofurano legante il sodio (SBFI) è l'indicatore fluorescente Na+ più comunemente usato. L'SBFI può essere caricato nel miocita cardiaco sia nella sua forma salina attraverso una pipetta di vetro sia come estere acetossimetilico (AM) che può penetrare la membrana sarcolemmale del miocitta. A livello intracellulare, SBFI-AM è deesterificato dalle esterasi citosoliche. A causa delle variabilità nella penetrazione della membrana e nella deesterificazione citosolica, ogni cellula deve essere calibrata in situ. Tipicamente, le misurazioni di [Na+]i utilizzando l'epifluorescenza a cellula intera SBFI vengono eseguite utilizzando un tubo fotomoltiplicatore (PMT). Questa configurazione sperimentale consente di misurare una sola cellula alla volta. A causa della lunghezza del carico del colorante dei miociti e della calibrazione dopo ogni esperimento, la resa dei dati è bassa. Abbiamo quindi sviluppato una tecnica basata su telecamera EMCCD per misurare [Na+]i. Questo approccio consente misurazioni simultanee di [Na+]i in più miociti, aumentando così significativamente la resa sperimentale.

Introduzione

Nelle malattie atriali (ad esempio, la fibrillazione atriale [FA]) la segnalazione intracellulare del Ca2+ è profondamente alterata1. Mentre molti dei meccanismi alla base del segnale intracellulare del Ca2+ 'rimodellato' nella FA sono stati ben caratterizzati 2,3, il ruolo che un'alterata concentrazione intracellulare di sodio ([Na+]i) può svolgere è poco compreso. [Na+]i è un importante regolatore del Ca2+ intracellulare. Lo studio di [Na+]i può fornire informazioni sull'attivazione dello scambiatore sarcolemmale Na+/Ca2+ (NCX), sul comportamento dei canali Na+ e della Na+,K+-ATPasi (NKA)4. Abbiamo precedentemente dimostrato che alti tassi di attivazione atriale, come quelli che si verificano durante la FA, portano ad una significativa riduzione di [Na+]i 1. Lavori precedenti hanno mostrato un aumento della densità di corrente NCX (INCX) e dei livelli di espressione proteica in AF3. È stato riportato anche un aumento della componente tardiva della corrente Na+ voltaggio-dipendente (INa, tardiva) nei miociti atriali isolati di pazienti con FA5. Pertanto, vi è evidenza di profondi cambiamenti nell'omeostasi intracellulare del Na+ nella FA. Misurazioni affidabili e riproducibili di [Na+]i nei miociti atriali isolati sono quindi necessarie per approfondire la nostra comprensione della patologia della FA. Qui, dimostriamo come isolare in modo riproducibile miociti atriali murini di alta qualità adatti per misurazioni di [Na+]i. Abbiamo focalizzato il nostro protocollo ottimizzato di isolamento delle cellule atriali sui miociti atriali murini perché i modelli murini transgenici (TG) di fibrillazione atriale sono diventati una parte vitale della ricerca sulla fibrillazione atriale6. Questi topi sono spesso disponibili solo in numero limitato e gli atri sono spesso fibrotici, il che comporta sfide per l'isolamento cellulare.

In generale, [Na+]i in celle vitali può essere misurato con indicatori fluorescenti 7,8 o con diversi tipi di microelettrodi9. Le tecniche basate su microelettrodi richiedono la penetrazione della membrana sarcolammale. Questa tecnica è quindi limitata alle cellule più grandi e non è adatta per miociti atriali piccoli e stretti la cui integrità cellulare è facilmente compromessa.

L'isoftalato benzofurano legante il sodio (SBFI) è un indicatore fluorescente che subisce un grande spostamento della lunghezza d'onda dopo aver legato Na+ 7. L'SBFI viene eccitato alternativamente a 340 nm e 380 nm e la fluorescenza emessa viene raccolta dopo essere passata attraverso un filtro di emissione (510 nm). I rapporti dei segnali alle due lunghezze d'onda di eccitazione (F340/380) possono annullare la lunghezza del percorso locale, la concentrazione del colorante e le variazioni indipendenti dalla lunghezza d'onda nell'intensità dell'illuminazione e nell'efficienza di rilevamento. Quando in ogni cella viene eseguita una calibrazione in situ utilizzando soluzioni con concentrazione di sodio nota ([Na+]), il rapporto F340/380 ottenuto durante l'esperimento produce misure precise e sensibili di [Na+]i. Come tutti gli indicatori Na+ , anche l'SBFI mostra una certa affinità per il K+. L'utilizzo del metodo di calibrazione qui mostrato consente di "bloccare" in modo affidabile [Na+]i e la concentrazione intracellulare di potassio ([K+]i) durante il processo di calibrazione in modo che [Na+]i possa essere calibrato in modo affidabile anche quando è <10% di [K+]i 10.

Introduciamo una nuova tecnica basata su telecamera EMCCD per misure raziometriche di [Na+]i utilizzando SBFI. La telecamera EMCCD consente, per la prima volta, misurazioni (e calibrazioni) simultanee [Na+]i in più celle. Ciò è particolarmente vantaggioso in un contesto sperimentale in cui il numero di animali è limitato (ad esempio, modelli murini transgenici). Tipicamente, le misure [Na+]i con SBFI vengono eseguite utilizzando un tubo fotomoltiplicatore (PMT) per raccogliere l'epifluorescenza dell'intera cellula 1,11. Mentre i PMT offrono un'ottima risoluzione temporale del segnale di fluorescenza, la risoluzione spaziale è molto bassa e gli esperimenti sono limitati a una cellula alla volta.

Il nostro nuovo protocollo facilita misure altamente riproducibili e sensibili di [Na+]i. È ottimizzato per l'acquisizione simultanea di cambiamenti in [Na+]i in più miociti atriali murini, ma è adattabile a molti altri tipi di cellule.

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Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Maryland, Baltimora.

1. Isolamento di miociti atriali da cuori murini adulti

  1. Metti ogni topo in un vaporizzatore di precisione e in una camera di induzione gassata con isoflurano in ossigeno al 100%.
  2. Impostare il flusso di isoflurano all'1% fino a quando l'animale non risponde prima di somministrare un'iniezione intraperitoneale (IP) di eparina (1-1,25 U/g) 15 minuti prima dell'eutanasia.
  3. Anestetizzare profondamente il topo aumentando l'anestesia con isoflurano al 5% e confermare il piano profondo dell'anestesia pizzicando il piede.
  4. Eseguire l'eutanasia eseguendo una toracotomia rapida12; Usa pinze standard e forbici chirurgiche per aprire il torace. Mobilizzare passivamente cuore e polmone, isolare l'arco aortico, tenere premuto con una pinza e tagliare l'aorta per rimuovere il cuore.
  5. Mettere il cuore in un tampone di isolamento cellulare nominalmente privo di Ca2+ ghiacciato (CIB, Tabella 1).
  6. Cannulare l'aorta con una cannula da 22 G e legare con una sutura di seta al microscopio ottico con ingrandimento 3x in soluzione CIB (Figura 1A, B).
  7. Verificare che la cannula sia ben al di sopra dei seni aortici erogando la soluzione CIB attraverso la cannula collegata a una siringa e confermare la perfusione dell'arteria coronarica al microscopio.
    NOTA: Questo passaggio è importante per garantire una corretta perfusione del tessuto atriale perché è stato dimostrato che l'anatomia dell'arteria coronaria è molto variabile nei topi13.
  8. Montare il cuore su una configurazione di Langendorff a base di gravità e perfondere con la soluzione CIB priva di Ca2+ per 5 minuti a 37 °C per lavare via il sangue rimanente fino a quando l'eluato non è limpido (Figura 1C).
  9. Passare alla soluzione enzimatica (Tabella 2) e perfondere per 3-5 minuti a 37 °C fino a quando il tessuto atriale è morbido e flaccido.
  10. Asportare l'atrio destro e sinistro utilizzando una pinza super-grip e piccole forbici a molla e trasferirlo in un piccolo piatto di coltura contenente la soluzione enzimatica CIB utilizzata nella fase 1.8 ma con 0,15 mM di CaCl2 e collocare in un'incubatrice a 37 °C per 5-8 minuti (Figura 1D).
  11. Trasferire gli atri in una piastra per colture cellulari contenente 4 mL di soluzione di conservazione preriscaldata (37 °C) (soluzione di Tyrode modificata (Tabella 3) contenente 15 mM di albumina sierica bovina e 30 mM di 2,3-butandione monoxima).
  12. Tagliare gli atri in piccole strisce di tessuto (10-20, a seconda delle dimensioni dell'atriale) utilizzando piccole forbici a molla e pinze super-grip.
  13. Per la dissociazione meccanica, aspirare delicatamente la sospensione tissutale utilizzando diverse pipette Pasteur in vetro lucidato a fuoco con aperture comprese tra 2 e 5 mm. Iniziare con il puntale della pipetta più grande e passare al puntale della pipetta più piccolo, aspirando 5-10 volte per pipetta.
  14. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro da 200 μm e aggiungere CaCl2 tre volte ogni 10 minuti per ottenere una concentrazione finale di 0,3 mM.

2. Valutazione della qualità delle celle

  1. Porre 200 μl della sospensione cellulare contenente i miociti atriali appena isolati su un vetrino coprioggetti di vetro.
  2. Usa un obiettivo 10x per contare tutte le celle nel campo visivo e classificarle come arrotondate o a forma di bastoncino. Determinare quante delle celle a forma di bastoncello mostrano una striatura incrociata chiara (passare all'obiettivo 25x se questo è difficile da determinare, vedere la Figura 2C).
  3. Ripetere i passaggi 2.1–2.2.
  4. Calcola le percentuali di celle arrotondate, a forma di bastoncino e a forma di bastoncino con striature incrociate chiare.
  5. Modificare la procedura di isolamento delle cellule fino a quando l'80% delle cellule non è a forma di bastoncello con una chiara striatura incrociata.
  6. Posizionare 500 μl di sospensione cellulare atriale su un vetrino coprioggetti rivestito di laminina e posizionare la camera cellulare sul microscopio invertito. Lasciare riposare le celle per 5 minuti. Perfondere con la soluzione di Tyrode contenente 1,8 mM di Ca2+.
  7. Utilizzare un sistema di stimolazione cellulare per avviare la stimolazione del campo elettrico (impulso bipolare di 2 ms, 30 V) a 0,5 Hz e contare il numero di cellule che si contraggono nel campo visivo di un obiettivo 10x.
  8. Ripetere con la stimolazione del campo esterno a 3 Hz.
  9. Calcolare la percentuale di cellule che rispondono a velocità di stimolazione di 0,5 e 3 Hz (vedere Figura 2B). Perfezionare il protocollo di isolamento cellulare fino a quando il 50% delle cellule risponde alla stimolazione di campo a 3 Hz.

3. Carico dell'indicatore Na+ di miociti atriali murini appena isolati

  1. Utilizzare l'estere acetossimetilico (AM) cellulare dell'indicatore fluorescente benzofurano legante il sodio (SBFI-AM).
  2. Per facilitare la dispersione del colorante e ottenere un carico cellulare omogeneo, sciogliere SBFI in dimetilsolfossido (DMSO) e polioli tensioattivi adatti (ad es. pluronico) per ottenere una concentrazione finale di 10 μM di SBFI nella sospensione cellulare.
  3. Caricare le celle con SBFI per 60 minuti al riparo dalla luce su un bilanciere a temperatura ambiente.
  4. Lasciare riposare le cellule per 30 minuti, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in una soluzione di conservazione (1-2 mL).
    NOTA: Gli esperimenti devono essere eseguiti entro 4 ore dall'isolamento delle cellule. Il BDM viene lavato via dalla perfusione con la soluzione di Tyrode prima dell'inizio degli esperimenti14.

4. Strumentazione, misure [Na+]i e calibrazione [Na+]i

NOTA: La Figura 3 illustra lo schema del percorso luminoso per la strumentazione sperimentale.

  1. Preparare soluzioni di taratura con concentrazioni di Na+ crescenti come descritto nelle Tabelle 4–6.
  2. Aggiungere l'agente permeabilizzante gramicidina D (10 μM; da una soluzione madre conservata a -20 °C) e l'inibitore dell'ATPasi Na+, K+ strofantidina (100 μM, da una soluzione madre conservata a -20 °C) a ciascuna soluzione di calibrazione. Agitare bene o utilizzare un sonicatore per assicurarsi che la gramicidina e la strofanantina siano completamente disciolte.
  3. Riempire un sistema di perfusione multi-barilotto con le soluzioni di calibrazione contenenti l'aumento di [Na+]o preparate nei passaggi 4.1 e 4.2. Collegarsi a una camera cellulare utilizzando velocità di perfusione lente (~1 mL/min; le velocità di perfusione possono variare in base al volume della camera cellulare).
  4. Collegare l'aspirazione alla camera della cella e raccogliere il perfusato in un apposito contenitore (di vetro) sul pavimento.
  5. Arrestare la perfusione e l'aspirazione.
  6. Dopo aver consentito 30 minuti di deesterificazione SBFI, posizionare 100 μl della sospensione cellulare concentrata (fase 3.5) caricata con colorante su un vetrino di vetro rivestito di laminina sopra il campo visivo dell'obiettivo 40x del microscopio invertito.
  7. Utilizzare un illuminatore a commutazione rapida con una sorgente luminosa allo xeno da 300 W. Imaging ad ampio campo con due lunghezze d'onda di eccitazione (340 nm e 380 nm) utilizzando specchi di scansione a commutazione rapida e filtri di eccitazione a larghezza di banda ridotta (340 nm ± 10 nm; 380 nm ± 10 nm).
  8. Ottimizza il campo visivo della telecamera EMCCD. Un'area di osservazione più ampia richiede tempi di fotogramma più lunghi. Tempi di fotogramma più lunghi portano a un maggiore sbiancamento dell'indicatore. Pertanto, bilanciare le dimensioni del campo visivo e il tempo del fotogramma in modo che non si verifichi uno sbiancamento evidente della sonda.
  9. Determinare che la fluorescenza intrinseca sia minima in un sottogruppo di cellule atriali che non sono caricate con SBFI assicurandosi che la fluorescenza intrinseca delle cellule sia simile alla fluorescenza di fondo (come mostrato nella Figura 4).
  10. Determinare la frequenza di campionamento appropriata in base al disegno sperimentale (le frequenze di campionamento possono essere basse perché le variazioni di [Na+]i sono relativamente lente (ad esempio un punto dati acquisito ogni 10-20 s).
  11. Attenuare la luce di eccitazione utilizzando appropriati filtri a densità neutra (ND) e riducendo adeguatamente l'intensità della sorgente luminosa (ad esempio, modificando l'intensità nel software operativo).
  12. Raccogliere la luce di emissione a 510 ± 40 nm utilizzando filtri appropriati con una telecamera EMCCD collegata al microscopio invertito.
  13. Definire una regione di interesse (ROI) per ogni cella e una ROI di sfondo (vedere la Figura 4). Sottrarre lo sfondo dai segnali F340 e F380 registrati (online o durante l'analisi dei dati).
  14. Avviare l'acquisizione dei dati.
  15. Riavviare la perfusione e l'aspirazione. Perfondere per 10-15 minuti con la soluzione di Tyrode contenente 1,8 mM di Ca2+ e registrare una linea di base Fstabile 340/380 prima di iniziare l'esperimento.
    NOTA: Assicurati di registrare una linea di base stabile per 10-15 minuti. Se si verifica uno sbiancamento (ad esempio, riduzione della linea di base F340/380 ), cercare di attenuare ulteriormente l'intensità dell'illuminazione aumentando la densità del filtro ND, diminuendo l'intensità del segnale luminoso di eccitazione e/o il tempo del frame di acquisizione (vedere i passaggi 4.10-4.11).
  16. Avviare la misurazione [Na+]i in base alla domanda di ricerca.

5. Calibrazione [Na+]i

  1. Dopo la conclusione dell'esperimento (passaggio 4.16) eseguire una calibrazione del segnale F340/380 in ogni cella in situ.
  2. Calibrare il segnale F340/380 perfondendo i miociti caricati con SBFI con le soluzioni di calibrazione (preparate nei passaggi 4.1-4.3).
  3. Perfondere in modo graduale per elevare [Na+]o da 0 a 20 mM. Attendere il segnale F340/380 stabile prima di passare alla concentrazione successiva (~5 min a seconda della portata; vedere Figura 3B e Figura 5A).
    NOTA: La relazione tra il segnale F340/380 e il [Na+] delle soluzioni di calibrazione deve essere lineare per una calibrazione valida del segnale F340/380 (Figura 5 e Figura 6).

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Risultati

Valutazione della qualità delle cellule atriali
I miociti atriali appena isolati sono stati valutati in base alla morfologia cellulare e alla reattività alla stimolazione del campo, come indicato nel protocollo, in sei isolamenti consecutivi di cellule atriali. I dati mostrati nella Figura 2 mostrano una percentuale molto alta di miociti atriali a forma di bastoncello che mantengono una chiara striatura incrociata. Allo stesso modo, circa ...

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Discussione

Qui presentiamo una nuova tecnica basata su telecamera EMCCD per la misurazione quantitativa simultanea di [Na+]i in più miociti atriali vitali utilizzando l'isoftalato benzofurano legante il sodio (SBFI). L'approccio qui descritto è il primo a consentire la misurazione simultanea di [Na+]i in più cellule. I principali vantaggi che questo nuovo protocollo presenta sono (i) il significativo aumento della resa sperimentale e (ii) la riduzione del...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione per lo sviluppo scientifico dell'American Heart Association (14SDG20110054) a MG; la sovvenzione di formazione interdisciplinare NIH in biologia muscolare (T32 AR007592) e la sovvenzione di formazione per malattie cardiovascolari NIH (2T32HL007698-22A1) a LG; una sovvenzione per lo sviluppo degli scienziati dall'American Heart Association (15SDG22100002) a LB e dalle sovvenzioni NIH R01 HL106056, R01 HL105239 e U01 HL116321 a WJL.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2,3-butandione monoxime (BDM)Sigma-AldrichB0753
340 Filtro di eccitazioneChromaET40X25 mm
380 Filtro di eccitazioneChromaET80X25 mm
510 Filtro di emissioneChromaET510/80m25 mm
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma-AldrichA7906
Trappola a bolleBD Medical Technologies904477realizzato su misura da una siringa Luer Lok da 5 ml, che si trova nel percorso del tubo dalla soluzione di perfusione alla
soluzione di cannula CaCl2Sigma-Aldrich21115
BD Medical Technologies305167realizzata su misura da un ago da 22 G x 1 1/2 pollici. Tagliare a 1 pollice e carteggiare la punta distale da 1 mm.
Camera della cellalavorata su misura con un'apertura in grado di contenere in modo sicuro un vetrino di vetro da 25 mm e con un coperchio che ha una porta di ingresso e una di uscita per la perfusione.
Bagno d'acqua circolanteVWR
Collagenase IIWorthingtonLS004176Attività specifica 290 U/g
CreatininaSigma-AldrichC0780
Illuminatore DG5-plusStrumento SutterLambda DG-4/DG-5 Plus
DMSOThermo FischerBP231
EGTASigma-AldrichE4378
Telecamera EMCCDPrinceton InstrumentsProEM-HS
Emostatici fini Strumenti perla scienza fine130-20
Forbici finiStrumenti per la scienza14060-10
Pinze SupergripStrumenti per la scienza fine00632-11
Vetrini copricoperchioVWR4838089cerchio da 25 mm
GlucosioSigma-AldrichG7528
Gramicidina DSigma-AldrichG5002
HEPESSigma-AldrichH3375
Tubo interno in siliconeVWRVWRselect marca tubo in silicone
Microscopio invertito NikonInstruments NikonTE2000 U
Strumenti
K GluconatoSigma-AldrichP1847
KCISigma-AldrichP5405
KH2PO4Calbiochem529568
Apparecchio di perfusione
MgCl2.6H2O *Sigma-AldrichM0250
MyoPacer Stimolatore cellulareIonOptix
Na GluconateSigma-AldrichS2054
NaClSigma-AldrichS9888
NaH2PO4Sigma-AldrichS9390
Natural Mouse LamininThermo Fischer230170150,5-2,0 mg/ml
Tubo esternoVWR
Petri piatto 35X10 mmFalcon351008
PowerLoadThermo FischerP10020
Proteasi XXIVSigma-AldrichP8038
SBFI-AMThermo FischerS1264
Sutura in setaStrumenti per le scienze Fine Science18020-50da 0,12 mm
di diametro Strumenti per le scienze fini 15000-03
Pinze standardper la scienza11000-12
StrophanthidinSigma-AldrichG5884
Forbici chirurgiche Tough CutFine Science Tools14054-13
Pinze per legatura di suturaStrumenti per la scienza fine00272-13
TaurineSigma-AldrichT0625
TrisbaseSigma-AldrichTRIS-RO
TripsinaSigma-AldrichT0303
UVFS Riflettente 0.1 ND FiltroThorlabsNDUV01B25 mm
UVFS Riflettente 0.2 ND FiltroThorlabsNDUV02B25 mm
UVFS Riflettente 0.3 ND FiltroThorlabsNDUV03B25 mm
UVFS Riflettente 0.5 ND FiltroThorlabsNDUV05B25 mm
UVFS riflettente 1 ND filtroThorlabsNDUV010B25 mm
Cannula di isolamentodi Langendorff Forbici per molle piccole Strumenti

Riferimenti

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