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Articolo metodologico

Studio dell'infezione da Cryptosporidium nei sistemi di coltura degli organiidi umani derivati dai tessuti 3D mediante Microinjection

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⸱

DOI:

10.3791/59610

⸱

14 settembre 2019

 ,  , 
1Hubrecht Institute, Oncode Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW), UMC Utrecht, 2Veterinary Microbiology and Pathology, College of Veterinary Medicine, Washington State University, 3Janssen Pharmaceutica

In questo articolo

Sommario

Descriviamo protocolli per preparare le oocisti e purificare gli sporozoiti per studiare l'infezione degli organoidi intestinali e delle vie aeree da Cryptosporidium parvum. Dimostriamo le procedure per la microiniezione di parassiti nel lume organoide intestinale e l'immunostaining degli organoidi. Infine, descriviamo l'isolamento delle oocisti generate dagli organoidi.

Abstract

Cryptosporidium parvum è una delle principali cause della malattia della diarrea umana. Per comprendere la patologia del parassita e sviluppare farmaci efficienti, è necessario un sistema di coltura in vitro che riassume le condizioni nell'ospite. Gli organiidi, che assomigliano molto ai tessuti della loro origine, sono ideali per studiare le interazioni ospite-parassita. Gli organiidi sono strutture derivate da tessuti tridimensionali (3D) che derivano da cellule staminali adulte e crescono in coltura per lunghi periodi di tempo senza subire alcuna aberrazione genetica o trasformazione. Hanno una polarità ben definita con superfici apicali e basolaterali. Gli organiidi hanno varie applicazioni nei test farmacologici, nel bio banking e nella modellazione della malattia e negli studi sull'interazione tra host e microbo. Qui presentiamo un protocollo passo-passo di come preparare le oocisti e sporozoiti di Cryptosporidium per infettare gli organoidi intestinali e delle vie aeree umane. Dimostriamo quindi come la microiniezione può essere utilizzata per iniettare i microbi nel lume organoide. Ci sono tre metodi principali con cui gli organoidi possono essere utilizzati per gli studi di interazione host-microbe: microiniezione, tosatura meccanica e placcatura, e facendo monostrati. La microiniezione consente il mantenimento della struttura 3D e consente un controllo preciso dei volumi di parassiti e il contatto laterale apicale diretto per i microbi. Forniamo dettagli per una crescita ottimale degli organoidi per la produzione di imaging o oocisti. Infine, dimostriamo anche come le oocisti appena generate possono essere isolate dall'organoid per un'ulteriore elaborazione e analisi a valle.

Introduzione

Lo sviluppo di farmaci o vaccini per il trattamento e la prevenzione dell'infezione da Cryptosporidium è stato ostacolato dalla mancanza di sistemi in vitro che imitano precisamente la situazione in vivonell'uomo 1,2. Molti dei sistemi attualmente disponibili consentono solo l'infezione a breve termine (<5 giorni) o non supportano l'intero ciclo di vita del parassita3,4. Altri sistemi che consentono il completo sviluppo del parassita si basano su linee cellulari immortalate o linee cellulari tumorali che non ricapitolano fedelmente la situazione fisiologicanell'uomo 5,6,7 . Gli organoidi o "mini-organi" sono strutture derivate di tessuto 3D che vengono coltivate in una matrice extracellulare integrata con vari fattori di crescita specifici del tessuto. Gli organiidi sono stati sviluppati da vari organi e tessuti. Sono geneticamente stabili e riassumono la maggior parte delle funzioni degli organi della loro origine, e possono essere mantenuti in coltura per lunghi periodi di tempo. Abbiamo sviluppato un metodo per infettare gli organoidi intestinali e polmonari umani con il Cryptosporidium che fornisce un modello accurato in vitro per lo studio delle interazioni ospite-parassita rilevanti per la criptosporidiosi intestinale e respiratoria8 ,9,10,11,12,13. A differenza di altri modelli di coltura pubblicati, il sistema organoide è rappresentativo delle interazioni reali dell'ospite, consente il completamento del ciclo di vita in modo che tutte le fasi del ciclo di vita dei parassiti possano essere studiate e mantenga la propagazione dei parassiti per un massimo di 28 giornie 10.

Cryptosporidium parvum è un parassita apicomplexa che infetta l'epitelio dei tratti respiratori e intestinali, causando una malattia di diarrea prolungata. Lo stadio ambientale resistente è l'oocisti, che si trova negli alimenti e nell'acqua contaminati14. Una volta ingerito o inalato, l'oocisti si estingo e rilascia quattro sporozoiti che si attaccano alle cellule epiteliali. Gli sporozoiti scivolano sulle cellule ospiti e coinvolgono i recettori delle cellule ospiti, ma il parassita non invadere completamente la cellula e sembra indurre la cellula ospite a inghiottirla15. Il parassita, che viene interiorizzato all'interno di un compartimento intracellulare ma extracitoplasmatica, rimane sulla superficie apicale della cellula, replicandosi all'interno di un vacuolo parassofoso. Subisce due cicli di riproduzione asessuata, un processo chiamato merogonia. Durante la meroginia, si sviluppano meronts di tipo I che contengono otto merozoiti che vengono rilasciati per invadere nuove cellule. Questi merozoiti invadono nuove cellule per svilupparsi in meront di tipo II contenenti quattro merozoiti. Questi merozoiti, una volta rilasciati, infettano le cellule e si sviluppano in macrogamont e microgamont. I microgameti vengono rilasciati e fertilizzano i macrogameti che producono zigoti che maturano in oocisti. Le oocisti mature vengono successivamente rilasciate nel lume. Le oocisti sono o a parete sottile che immediatamente si estesciper reinfettare per reinfettare l'epitelio, o spesse mura che vengono rilasciate nell'ambiente per infettare il prossimo ospite14. Tutte le fasi del ciclo di vita di Cryptosporidium sono state identificate nel sistema di coltura organoide precedentemente sviluppato dal nostro gruppo10.

Dal momento che gli organoidi umani replicano fedelmente i tessuti umani9,11,13, e supportano tutte le fasi replicative del Cryptosporidium10, sono il sistema di coltura dei tessuti ideale per studiare Biologia del cryptosporidium e interazioni ospite-parassita. Qui descriviamo le procedure per infettare gli organoidi sia con le oocisti di Cryptosporidium che con gli sporozoiti eccitati e per isolare le nuove oocisti prodotte in questo sistema di coltura tissutale.

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Protocollo

Tutta la manipolazione e la resezione dei tessuti è stata eseguita in base ai protocolli approvati dall'IRB (Institutional Review Board) con il consenso del paziente.

1. Preparazione di C. parvum Oocysts per l'iniezione

NOT: Cryptosporidium oocisti sono stati acquistati da una fonte commerciale (vedi la Tabella dei Materiali). Queste oocisti sono prodotte in vitelli e sono conservate in salina tampone di fosfato (PBS) con antibiotici. Possono essere conservati per circa 3 mesi a 4 gradi centigradi e non devono mai essere congelati. Normalmente usiamo le oocisti entro un mese. Gli organoidi possono essere infettati da oocisti intatti, o gli sporozoiti possono essere isolati dalle oocisti eccitati e utilizzati per infettare gli organoidi se è importante non avere oocisti riporto dall'inoculo originale.

  1. Preparare le oocisti di Cryptosporidium per infettare le cellule (Figura 1A).
    1. Mantenere le oocisti sul ghiaccio in tutte le manipolazioni fino a quando non vengono aggiunti agli organoidi.
    2. Calcolare il numero di oocisti necessari per una piastra completa a sei pozze di organoidi (di solito circa 5 x 105–2,5 x 105 per la piastra). Contare il numero di oocisti in un emocitometro per verificare la quantità e trasferirla in un tubo di centrifuga.
      NOT: Per facilitare la visualizzazione, le oocisti possono essere mescolate 1:1 con un anticorpo fluorescente specifico per l'oocisti (vedi la tabella dei materiali) prima di essere caricate sull'emocitometro. Le oocisti con etichettatura fluoroforo possono quindi essere facilmente visualizzate ed enumerate utilizzando un microscopio a fluorescenza. Si consiglia di iniettare circa 100-1.000 oocisti/organoidi. In generale, 1.000-2.000 organoidi possono essere coltivati in una piastra di sei pozze.
    3. Portare il volume della sospensione delle ovociti fino a 900 gradi con PBS. Aggiungere 100 l di ipoclorito di sodio (ad esempio, Clorox) candeggina (a 4 gradi centigradi). Incubare per 10 min sul ghiaccio.
    4. Centrifuga per 3 min in una microcentrifuga a 8.000 x g a 4 gradi centigradi. Orientare i tubi nella centrifuga con l'apertura del tappo rivolto verso l'interno. Il pellet può essere difficile da vedere in modo da sapere dove i parassiti hanno spinto nel tubo è essenziale.
    5. Rimuovere il supernatante con una pipetta facendo attenzione ad evitare il pellet. Aggiungere 1 mL del mezzo di Dulbecco modificato Eagle (DMEM) e vortice da mescolare.
    6. Centrifuga per 3 min in una microcentrifuga a 8.000 x g a 4 gradi centigradi.
    7. Ripetere i lavatori con DMEM altre due volte.
    8. Preparare il supporto di espansione (OME) o il mezzo organoide di differenziazione (OMD) a cui è stato aggiunto il taurocholate a una concentrazione finale dello 0,5% (w/v) (vedere Tabella dei materiali). Il taurocolata deve sempre essere preparato e aggiunto fresco.
      NOT: Abbiamo utilizzato con successo lo 0,5% di taurocholato nei nostri saggi di infezione in cui l'inoculum è oocisti intatti, e abbiamo visto tassi migliorati di infezione senza effetti deleteri sulle cellule ospiti. Tuttavia, il taurocholate può avere effetti imprevisti sulle cellule, e concentrazioni più basse sono state utilizzate con successo nei saggi di infezione16.
    9. Risospendere le oocisti in 100 gradi centigradi di coltura organoide medio integrato con 0.5% (w/v) taurocholate di sodio. Contare nuovamente le oocisti come descritto nel passaggio 1.1.2.
    10. Aggiungere colorno verde veloce alla sospensione per visualizzare l'iniezione.
    11. Riempire le punte del micro-caricatore (vedere la Tabella dei Materiali) con la sospensione dell'oocistia e usarla per riempire i capillari tirati.
      ATTENZIONE: L'intera procedura dovrebbe essere eseguita in una cappa di coltura tissutale con protocolli di sicurezza di livello 2. L'uso di maschere è raccomandato come Cryptosporidium oocisti può anche essere infettivo quando in volo.

2. Purificazione in vitro di Sporozoites da C. parvum Oocysts

  1. Purificare gli sporozoiti da C. parvum oocyiss dopo lo sbiancamento e il lavaggio della candeggina come descritto sopra.
    1. Trasferire le ovociti in un tubo da 15 mL. Risospendere le oocisti nel mezzo di escissimento a temperatura ambiente (0,75% w/v taurocholate di sodio in DMEM) per ottenere 1 x 107 oocisti/mL. L'aggiunta di taurocholate migliora il tasso di esocissimento delle oocisti, migliorando la resa sporozoite.
    2. Incubare la sospensione dell'ovocita a 37 gradi centigradi per 1–1,5 h.
    3. Controllare il campione microscopicamente per l'estensione dell'escissioni; 60-80% escissioni è ragionevole per un buon recupero di sporozoiti. Se il livello di escissioni è basso, incubare più a lungo (altri 30 min a 1 h).
    4. Determinare la percentuale di emocidazione rispetto al numero di oocisti iniziali. Excystation viene calcolato come:
      % di escidazione : [1 – (numero di oocisti intatti/numero di oocisti all'inizio)] x 100
    5. Lavare le cellule per rimuovere i reagenti di escissione aggiungendo 14 mL di PBS o media, mescolando e recuperando le cellule (oocisti intatti, gusci di oocisti e sporozoiti) per centrifugazione a 3.400 x g per 20 min per recuperare sporozoites. Aspirate con attenzione per evitare di perdere le cellule.
    6. Risospendere il pellet sporozoite in 1-2 mL di DMEM per ottenere 3 x 107 oocisti/mL (in base al numero di oocisti iniziali).
    7. Per rimuovere le oocisti e le shell rimanenti, filtrare la sospensione tramite un filtro di 3 m (Figura 1B). Utilizzare un apparato portafiltri da 47 mm dotato di filtro in policarbonato (dimensione dei pori di 3 m) collegato a un barile di siringa da 10 mL. Posizionare l'apparecchio del supporto del filtro sopra un tubo da 15 mL. Collocare l'assieme in un secchio di ghiaccio o in una stanza fredda.
    8. Aggiungere 7,5 mL della sospensione sporozoite al gruppo del filtro e lasciare filtrare per gravità. Lavare con altri 7,5 mL di DMEM.
      NOT: Per garantire il successo nell'isolamento sporozoite, le oociti fresche e le buone esocienze sono fondamentali. Se ci sono troppe oocisti non esandati, la sospensione non scorrerà attraverso per gravità. L'applicazione di pressione sulla siringa può forzare le oocisti non esordite. La microiniezione di sporozoiti è più impegnativa di quella delle oocisti perché gli sporozoiti possono bloccarsi e bloccare il capillare. Per evitare questo, si consiglia di fare una punta capillare più ampia quando si inietta organoidi con sporozoiti. Per raggiungere livelli sufficienti di infezione, 2-4 volte il numero di sporozoiti deve essere iniettato in ogni organoide rispetto agli organoidi infettati da oocisti.
    9. Centrifugare la sospensione sporozoite filtrata a 3.400 x g utilizzando un rotore a benna oscillante per 20 min a pellet sporozoites.
    10. Risospendere in 50-100 - L di OME o OMD organoid e mezzo di coltura organoide (vedi tabella dei materiali) integrato con 0.05% (w/v) Fast Green colorante e L-glutathione, betaina, L-cysteine, acido linoleico e taurina contenenti buffer5 (vedere il buffer di riduzione Tabella dei materiali).
      NOT: Incubare le oocisti per troppo tempo può portare alla lisi delle sporozoiti e al scarso recupero e quindi dovrebbe essere evitato.

3. Cultura in vitro degli organiidi intestinali e polmonari per microiniezione

  1. Organiids intestinali della coltura in condizioni di mezzi di espansione e differenziazione.
    nota:    I dettagli della propagazione organoide intestinale e polmonare sono stati descritti in precedenza in altri articoli8,13(vedereTabella dei materialiper le ricette dei media). Qui, descriviamo brevemente il metodo di coltura organoide con riferimento specifico all'ottimizzazione perCryptosporidiuminiezione e crescita. Abbiamo scoperto che per l'imaging di parassiti negli organoidi, gli organoidi coltivati nel mezzo di espansione sono preferibili a quelli dei supporti di differenziazione cresciuti in quanto c'è meno accumulo di detriti rispetto a quello visto negli organoidi cresciuti nel mezzo di differenziazione. Tuttavia, se l'obiettivo è quello di isolare le oocisti, gli organoidi coltivati nei mezzi di differenziazione producono un numero molto più elevato di oocisti.
    1. Mantenere gli organoidi nelle colture 3D in matrice extracellulare (vedere la Tabella dei Materiali)a 37 gradi centigradi. Aggiungi OME (supporti di espansione) in cima e aggiorna ogni giorno.
      NOT: Per gli organoidi polmonari, non disponiamo di supporti di espansione e differenziazione separati.
    2. Per dividere e piastra organoidi per microiniezione, rimuovere il supporto dalla piastra 6-pozzo contenente organoidi umani e aggiungere F12 s (Vedi la tabella dei materiali) al pozzo e rompere la matrice pipetta con una punta pipetta 1 mL più volte. Per ulteriori procedure è sufficiente raccogliere le cellule in un tubo da 15 mL (2 mL di F12 x per tubo).
    3. Aggiungete 10-12 mL di F12 in un altro tubo da 15 mL e mettete un tubo di vetro lucidato al fuoco nel mezzo, pipette su e giù 3 volte per rompere gli organoidi intestinali e polmonari umani.
      NOT: Utilizzare un lungo tubo di vetro (20-30 cm) e lucidarlo brevemente. Non rendere l'apertura (diametro 1 mm) molto piccola perché gli organoidi possono essere danneggiati. Rendere la punta del tubo liscia da brevemente lucidatura del fuoco. Rompere gli organoidi in pezzi più piccoli di organoidi polmonari da 50 m. hanno una membrana esterna più spessa e quindi richiedono una tosatura più forte con la pipetta di vetro rispetto agli organoidi intestinali. Inoltre, hanno un tasso di crescita più lento rispetto agli organoidi intestinali (fino a 14 giorni tra ogni passaggio).
    4. Aggiungere l'F12, fino a 5-7 mL e centrifugare a 350 x g per 5 min.
      NOT: La velocità di centrifugazione in questo passaggio è superiore al normale per creare un buon pellet cellulare ben separato dalla matrice extracellulare (vedere la Tabella dei Materiali). Abbiamo osservato che rispetto agli organoidi intestinali piccoli di topo, gli organoidi intestinali piccoli umani sono più difficili da interrompere.
    5. Rimuovere il più mezzo possibile senza disturbare le cellule, quindi rispendere il pellet con matrice mantenuta a 4 gradi centigradi; È richiesta una matrice di 200-300 litri per pozzo di una piastra a sei pozzetti. Gli organiidi devono essere divisi uno su tre per mantenere una densità cellulare abbastanza elevata.
    6. Placcare gli organoidi in goccioline di matrice di circa 5-10 gradi ciascuno nel pozzo di una piastra di sei pozzetti. Incubare per 20-30 min a 37 gradi centigradi e quindi aggiungere il mezzo di espansione (OME) in cima.
    7. Cambiare il mezzo ogni 2-3 giorni.
      NOT: In circa 5-7 giorni, gli organoidi che crescono nei modelli raggiungono una dimensione di 100-200 m e sono pronti per l'iniezione.
    8. Per differenziare gli organoidi, dopo 5-6 giorni in EM, cambiare i media in condizioni di differenziazione dei mezzi di trattamento (DM) e conservare per 5-6 giorni aggiuntivi prima di iniettare i parassiti.
      NOT: Per l'espansione degli organoidi, si consiglia di placcare gli organoidi densamente. Per la microiniezione, si raccomanda l'uso di una piastra a sei pozzetto con organoidi placcati a densità inferiore. Ad esempio, gli organoidi a piastre da tre pozze di una piastra a sei pozzetto in una piastra completa a sei pozze per le microiniezioni. La matrice deve essere mantenuta a -20 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine e scongelata a 4 gradi centigradi o sul ghiaccio prima dell'uso. L'espansione degli organoidi polmonari è fatta in modo simile, ma l'utilizzo di componenti multimediali specifici organoidi polmonari (Tabella 1)8 .

4. Microiniezione di oocisti/Sporozoiti nel Lumen Organoid

  1. Microinietta parassiti nel lato apicale dell'organoide 3D (Figura 2).
    1. Preparare capillari di 1 mm di diametro utilizzando un puller micropipette.
      NOT: Le impostazioni utilizzate sull'emittente di micropipette (vedere La tabella dei materiali)sono: Calore - 663, Pull 100, Velocità : 200, Tempo 40 ms. Le impostazioni dovranno essere regolate in base alle istruzioni dell'utente per una particolare macchina.
    2. Tagliare la punta del capillare con pinze. La dimensione/diametro dell'estremità capillare misura circa 9-12 m; ciò consente un facile flusso di oocisti (4-5 dimensioni m).
    3. Riempire i capillari con ovocitti o sospensioni sporozoite utilizzando punte micro-caricatore.
    4. Caricare il capillare pieno di oocisti su un microiniettore.
    5. Microinietta 100-200 nL sospensione in ogni organoide sotto un microscopio invertito a ingrandimento 5x, mantenendo la pressione costante. Dopo la microiniezione, aggiornare i supporti con OME o OMD ogni giorno e mantenere la piastra a 37 gradi centigradi.
      NOT: Non usiamo un micromanipolatore per la microiniezione. L'uso dello stesso capillare è raccomandato per l'intero esperimento per garantire la stessa iniezione in ogni campione.

5. Immunofluorescenza Colorazione degli organoidi

  1. Raccogliere gli organoidi (1-2 x 24 pozze) con una pipetta P1000 in un tubo da 15 mL contenente F12.
  2. Organoidi pellet a 300 x g per 2 min, rimuovere il supernatante senza interrompere il pellet e convogliare delicatamente il pellet allentato nel volume rimanente.
  3. Aggiungere 5 mL di 2% paraformaldeide in PBS. Per evitare che gli organoidi si attacchino alla parete, non invertire il tubo. Lasciare che gli organoidi si depositino sul fondo del tubo e fissare a 4 gradi centigradi o 1 h a temperatura ambiente.
  4. Rimuovere il fissativo e aggiungere 10 mL di buffer di permeabilizzazione (0,2% Triton in PBS).
  5. Ruotare il tubo a temperatura ambiente per 20 min (questo assicura che tutti gli organoidi rimangano in sospensione).
  6. Pellet gli organoidi a 300 x g per 2 min, e poi scartare il supernatante.
  7. Risospendere delicatamente gli organoidi in 500 gradi di soluzione di blocco (vedere la tabella dei materiali)e trasferirli in un tubo di microcentrifuga da 2 mL.
  8. Incubare per 20 min a temperatura ambiente su uno shaker. Lasciare che gli organoidi si depositino sul fondo del tubo per gravità. Sostituire la soluzione di blocco con la soluzione anticorpale primaria (vedere La tabella dei materiali)e incubare per 1-2 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 gradi centigradi.
  9. Lavare 3x con PBS contenente lo 0,1% Tween. Lasciate che gli organoidi si sistemino ogni volta e rimuovano il super-natante.
  10. Aggiungere la soluzione anticorpale secondaria (vedere la tabella dei materiali) e incubare per 2 h a temperatura ambiente.
  11. Lavare 3x con PBS contenente lo 0,1% Tween. Lasciare 50 - L di PBS dopo il terzo lavaggio.
  12. Montare sul vetrino convogliando gli organoidi sospesi in 50 gradi di PBS sul vetrino. Rimuovere il PBS in eccesso, aggiungere una goccia di agente di montaggio (vedere la tabella dei materiali) e aggiungere lo coverslip in cima. Sigillare i lati con smalto e lasciarlo asciugare.

6. Isolamento delle oocisti dagli organiidi

  1. Isolare le oocisti appena formate dal lume organoide.
    nota:    Le oocisti sono isolate dagli organoidi mediante separazione immunomagnetica utilizzando un kit di isolamentoTabella dei materiali) con le modifiche descritte di seguito. Le oocisti isolate possono quindi essere analizzate mediante immunofluorescenza e microscopia elettronica.
    1. Iniziare con organoidi differenziati che sono stati mantenuti in OMD per 5-7 giorni e che non sono infetti, infettati per 1 giorno e infettati per 5 giorni. Utilizzare i primi due come controlli negativi.
      NOT: Abbiamo scoperto che gli organoidi differenziati producono più oocisti rispetto ai polmoni o all'espansione degli organoidi intestinali10.
    2. Raccogliere gli organoidi in tubi di centrifuga da 15 mL. Centrifugare gli organoidi per 20 min a 3.000 x g e 10 gradi centigradi.
      NOT: Questa alta velocità è necessaria per assicurarsi che nessuna oocisti venga persa da qualsiasi organoide che possa essere rotto.
    3. Rimuovere il supporto organoide e sostituirlo con 5 mL di acqua.
    4. Rompere gli organoidi da ripetuti tubi vigorosi con una pipetta Pasteur in vetro lucidato dal fuoco.
    5. Se i grumi sono visibili, trasferire la sospensione organoide a un omogeneizzatore di vetro e omogeneizzare fino a quando gli organoidi sono ben disturbati. L'omogeneizzatore dounce non influenzerà le oocisti.
    6. Una volta che non ci sono grumi visibili, aggiungere 5 mL di buffer A dal kit di isolamento oocyst. Mescolare e aggiungere 120 l delle perline magnetiche rivestite con anti-oocisti IgM.
    7. Incubare le sospensioni cellulari e perline magnetiche per 2 h a temperatura ambiente con miscelazione continua su una piattaforma rocker.
    8. Alla fine dell'incubazione, posizionare i tubi contenenti cellule e perline su un rack di separazione magnetica progettato per tubi da 15 mL.
    9. Ruotare manualmente i tubi nel rack di separazione magnetica per 3 min. Le perline aderiscono al lato del tubo accanto al magnete.
    10. Con attenzione, con una pipetta da 10 mL, rimuovere il super-natante dalle perline. Risospendere le perline in 450 gradi di Buffer B e trasferirle in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml.
      NOT: Mantenere il supernatore fino a quando l'isolamento delle oocisti è confermato.
    11. Per raccogliere eventuali perline e oocisti rimanenti, lavare il tubo da 15 mL con 450 l'l di Buffer B e aggiungere questo lavaggio alle perline magnetiche nel tubo di microcentrismo.
    12. Ripetere il passaggio 6.1.11 ancora una volta. Tutte le perle e le oocisti catturate ora devono essere trasferite al tubo di microcentrifuga.
    13. Posizionare il tubo di microcentrifuga su un rack di separazione magnetica progettato per contenere i tubi di microcentrismo.
    14. Ruotare il tubo nel rack di separazione magnetica a mano per 3 min.
    15. Rimuovere con attenzione il supernatante con una pipetta in un nuovo tubo.
      NOT: Mantenere il supernatore fino a quando l'isolamento delle oocisti è confermato.
    16. Rimuovere il tubo di microcentrifuga contenente perline magnetiche e oocisti dal rack di separazione magnetica.
    17. Aggiungere 100 luna di 0,1 N HCl alle perline magnetiche per eluire le oocisti dalle perline. Vortice per 30 s.
      NOT: Vortexer deve essere impostato su una velocità leggermente inferiore alla massima.
    18. Incubare le perline in 0,1 N HCl per 10 min a temperatura ambiente.
    19. Vortice di nuovo. Quindi riporre il tubo sul rack di separazione magnetica. Attendere che le perline aderiscano al lato del tubo e quindi trasferire il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifuga.
    20. Ripetere i passaggi da 6.1.17 a 6.1.19 e combinare il secondo eluato con la prima eluzione.
    21. Neutralizzare l'eluato con 20 :L di 1 N NaOH, o un altro buffer neutralizzante come 1 M Tris, pH 8.
    22. Per contare le oocisti, prendere 10 l dell'eluato, combinarlo con 10 : L di anticorpo specifico di oocisti (Vedere Tabella dei materiali) e contare le oocisti fluorescenti su un emocitometro.
      NOT: Le oocisti isolate possono essere conservate a 4 gradi centigradi o utilizzate immediatamente per l'immunofluorescenza o l'imaging a microscopia elettronica.

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Risultati

I protocolli qui presentati si traducono in un'efficiente purificazione di oocisti e sporozoiti (Figura 1A) pronti per la microiniezione. Il protocollo di esostation si traduce nel rilascio di sporozoiti da circa il 70-80% delle oocisti, quindi è essenziale filtrare le rimanenti oocisti e gusci attraverso un filtro da 3 m. Filtrazione risultati in quasi 100% sporozoite purificazione (Figura 1B). Inoltre, l'aggiunta di un coloranti verde aiuta a garantire l'iniez...

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Discussione

La coltura dei parassiti del Cryptosporidium negli organoidi intestinali e delle vie aeree fornisce un modello accurato per studiare le interazioni ospite-parassita10, ma ha anche molte altre applicazioni. Ad esempio, gli attuali metodi di selezione e propagazione dei parassiti del Cryptosporidium geneticamente modificati richiedono un passaggio nei topi19, il che non consente l'isolamento dei parassiti che hanno modifiche essenziali per l'infezione in viv...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Siamo grati a Deborah A. Schaefer della School of Animal and Comparative Biomedical Sciences, College of Agriculture and Life Sciences, Università dell'Arizona, Tucson, Az, USA per averci aiutato con la produzione e l'analisi degli oocisti. Ringraziamo anche Franceschi Microscopy and Imaging Center e D.L. Mullendore alla Washington State University per la preparazione e l'imaging di oocisti organoidi isolati.

D.D. è il destinatario di una sovvenzione VENI dell'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO-ALW, 016.Veni.171.015). I.H. è il destinatario di una sovvenzione VENI dell'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO-ALW, 863.14.002) ed è stata sostenuta dalle borse Marie Curie della Commissione europea (Proposta 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca nell'ambito del ERC Advanced Grant Agreement n. 67013 e da NIH NIAIH sotto R21 AT009174 a RMO. Questo lavoro fa parte dell'Oncode Institute, che è in parte finanziato dalla Società Olandese per il Cancro ed è stato finanziato da una sovvenzione della Società Olandese per il Cancro.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Estratto di membrana basale (matrice extracellulare)amsbio3533-010-02  Anticorpo
Crypt-a-Glo (anticorpo specifico per oocisti)Waterborne, IncA400FLR-1XConcentrazione finale = Utilizzare 2-3 gocce/diapositiva
Crypto-Grab IgM rivestito Perline magneticheWaterborne, IncIMS400-20 
Portapacchi Dynamag 15Thermofisher Scientific12301D 
Dynamag 2 rastrellieraThermofisher Scientific12321D 
EMD Millipore  Filtri a membrana in policarbonato Isopore - 3µ mEMD-MilliporeTSTP02500 
Colorante verde veloceSIGMAF7252-5G    
Microiniettore Femtojet 4iEppendorf5252000013 
Capillari in vetro da 1 mm di diametroWPITW100F-4 
Matrigel (matrice extracellulare)Corning356237 
Provetta per microfuga 1,5 mLEppendorfT9661-1000EA 
Punte per microcaricatoriEppendorf612-7933 
Estrattore per micropipette P-97Strumento otturatoreP-97 
Siero d'asino normaleBio-RadC06SB 
PenstrepGibco15140-122 
Ipoclorito di sodio (utilizzare il 5%)Clorox50371478 
Super bastone scivoliWaterborne, IncS100-3 
Swinnex-25 47 mm Portafiltro in policarbonatoEMD-MilliporeSX0002500 
Acido tautocolico sale sodico idratoSIGMAT4009-5G 
Tween-20Merck8221840500 
Agente di montaggio VectashieldVector LabsH-1000 
Vortex Genie 2Scientific industries, IncSI0236 
Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)    Quantità finale
DMEMInvitrogen12634-010500 mL
PenstrepGibco15140-1225 mL di stock in 500 mL DMEM
Glutamax Gibco350500385 mL di stock in 500 mL
DMEM HepesGibco156300565 mL di stock in 500 mL di DMEM
INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Mezzi di espansione)    Concentrazione finale
A83-01Tocris2939-50mg0,5 &; M
Adv+++  preparare fino a 100 mL
B27Invitrogen175040441x
EGFPeprotechAF-100-1550 ng/mL
GastrinTocris3006-1mg10 nM
NACSigmaA9125-25G1,25 mM
NICSigmaN0636-100G10 mM
Noggin CMIn casa* 10%
Inibitore P38 (SB202190)SigmaS7076-25 mg10 µ M
PGE2Tocris2296/1010 nM
PrimocinInvivoGenant-pm-11 mL/500 mL media
RSpoI CMInterno* 20%
Wnt3a CMIn casa* 50%
In house* - le linee cellulari saranno fornite su richiesta   
INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Mezzi di differenziazione)  Per differenziare gli organoidi, gli organoidi dell'intestino tenue in espansione sono stati coltivati in un terreno ricco di Wnt per sei o sette giorni dopo la scissione, e poi cresciuti in un mezzo di differenziazione (ritiro di Wnt, nicotinamide, SB202190, in un mezzo di differenziazione (ritiro di Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandina E2 da un mezzo ricco di Wnt o OME)
MEZZO ORGANOIDE POLMONARE- LOM (Terreno di differenziazione)    Concentrazione finale
Adv+++  preparare fino a 100 mL
ALK-I A83-01Tocris2939-50mg500 nM
B27Invitrogen175040440,0763888889
FGF-10Peprotech100-26100 ng/mL
FGF-7Peprotech100-1925 ng/mL
N-acetilcisteinaSigmaA9125-25G1,25 mM
NicotinamideSigmaN0636-100G5 mM
Noggin UPEU-Protein ExpressContatta l'azienda direttamente10%
p38 MAPK-ISigmaS7076-25 mg1 µ M
PrimocinInvivoGenant-pm-11:500
RhoKI Y-27632Abmole BioscienceM1817_100 mg2,5 µ m
Rspo UPEU-Protein ExpressContatta l'azienda direttamente10%
Tampone riducente (per la risospensione di oocisti e sporozoiti per iniezione)    Concentrazione finale
L-Glutatione ridottoSigmaG4251-10MG0,5 μ g/μ L di OME/OMD/LOM
BetainaSigma619620.5 μ g/μ L di OME/OMD/LOM
L-CisteinaSigma168149-2.5G0.5 μ g/μ L di OME/OMD/LOM
Acido linoleicoSigmaL1376-10MG6.8 μ g/mL di OME/OMD /LOM
TaurinaSigmaT0625-10MG0,5 μ g/μ L di OME/OMD/LOM
Tampone bloccante (per colorazione con immunofluorescenza)    Concentrazione finale
Siero d'asino/capraBio-RadC06SB2%
PBSThermo-Fisher70011044Preparare fino a 100 ml
Tween 20MerckP13790,1%
Elenco degli anticorpi utilizzati      
Alexa 568 capra anti-coniglioInvitrogenA-11011Diluizione-1:500; RRID: AB_143157
Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Anticorpo marcato con fluoresceina Crypto-GloWaterborne, IncA400FLKDiluizione- 1:200
Crypta-Grab IMS Beads- Perle magnetiche rivestite con anticorpo monoclonale reattivoWaterborne, IncIMS400-20Diluizione-1:500
DAPIThermo Fisher ScientificD1306Diluizione-1:1.000; RRID : AB_2629482
falloidina-Alexa 674InvitrogenA22287Diluizione-1:1.000; RRID: AB_2620155
anticorpo anti-gp15 di coniglio generato da R. M. O' Connor (co-autore).Su richiestaSu richiestaDiluizione-1:500
Sporo-GloWaterborne, IncA600FLR-1XDiluizione- 1:200

Riferimenti

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