3D Kinematic Gait Analysis for Preclinical Studies in Rodents

Sommario

Presentato qui è un protocollo per raccogliere e analizzare la cinematica tridimensionale della locomozione quadrupede nei roditori per studi preclinici.

Abstract

L'utilità dei sistemi di analisi del movimento cinematico tridimensionale (3D) è limitata nei roditori. Parte della ragione di questa inadeguatezza è l'uso di algoritmi complessi e modellazione matematica che accompagnano le procedure di raccolta e analisi dei dati 3D. Questo lavoro fornisce una metodologia dettagliata semplice, user-friendly e dettagliata per l'analisi dell'andatura cinematica 3D durante la locomozione del tapis roulant in ratti sani e neurotraumatici utilizzando un sistema di motion capture a sei telecamere. Sono inoltre forniti dettagli su 1) calibrazione del sistema in un set-up sperimentale personalizzato per la locomozione quadrupede, 2) raccolta dei dati per la locomozione tapis roulant in ratti adulti utilizzando marcatori posizionati su tutti e quattro gli arti, 3) opzioni disponibili per il tracciamento video e l'elaborazione, e 4) la generazione di dati cinematici 3D di base e la visualizzazione e la quantificazione dei dati utilizzando il software di raccolta dei dati integrato. Infine, è suggerito che l'utilità di questo sistema di motion capture sia ampliata a studiare una varietà di comportamenti motori prima e dopo il neurotrauma.

Introduzione

Nei roditori, i deficit locomotori degli arti anteriori e posteriori dopo disturbi neurologici sono comunemente valutati utilizzando sistemi di punteggio soggettivi¹. Sistemi automatizzati^2,3,4,5 sono stati adottati per l'analisi dell'andatura ma soffrono di svantaggi, perché i risultati primari si basano sull'analisi dell'impronta e non riescono a catturare variabili cinemache segmentali e articolari che altrimenti possono rivelare la vera cinematica dei movimenti degli arti². Poiché la maggior parte dei parametri di andatura sono correlati, è necessaria una raccolta di parametri di andatura per comprendere le compensazioni adottate dai ratti per valutare completamente i deficit motori.

Nell'ultimo decennio, sono stati sviluppati diversi sistemi di analisi del movimento 3D⁶ per la ricerca biomedica nell'uomo. Questi sistemi hanno avuto successo e dimostrato di essere efficace nel catturare i deficit nella locomozione in adulti umani sani così come la cinetica alterata di camminare^6,7. Nei roditori, i sistemi di movimento kinematico 3D attualmente disponibili adottano algoritmi complessi e la modellazione per il comportamento del movimento e utilizzano sofisticate tecniche di analisi dei dati^8,9,10,11 , che alla fine limitano la loro versatilità. Inoltre, i metodi utilizzati per la raccolta di dati con la maggior parte dei sistemi di motion capture 3D non sono adeguatamente spiegati nella letteratura. Mancano i dettagli sulle procedure di raccolta e analisi dei dati, le limitazioni e le tecniche coinvolte nell'utilizzo efficace del sistema.

Di conseguenza, una delle nozioni comuni tra i ricercatori è che le valutazioni cinematiche di tracciamento del movimento 3D sono procedure piuttosto laboriose e dispendiose in termini di tempo che richiedono competenze tecniche e un'elaborata analisi dei dati. L'intento di questo lavoro è quello di abbattere i protocolli di raccolta e analisi dei dati e descrivere la metodologia attraverso un processo passo-passo in modo che sia oggettivo, facile da imparare e possa essere sistematicamente affrontato. Oggi, c'è un'enfasi emergente sulla valutazione del comportamento motorio funzionale in modo più completo e sistematico a seguito di lesioni neurologiche e interventi negli studi preclinici.

Nel regno della locomozione quadrupede, qui è presentato l'uso di un sistema di tracciamento del movimento 3D in grado di fornire informazioni aggiuntive come la postura del corpo, la rotazione delle zampe rispetto agli assi del corpo, le relazioni delle articolazioni e informazioni più accurate per quanto riguarda il coordinamento, il tutto contemporaneamente visualizzando l'intero animale da tutti i piani. Questo, a sua volta, può rivelare differenze critiche nel comportamento motorio all'interno e tra ratti sani e feriti attraverso risultati multipli. Con un'analisi cinematica più raffinata che sia accurata e obiettiva, il rischio di dedurre erroneamente gli effetti di un intervento è ridotto al minimo. I dati generati da questo software di motion capture vengono visualizzati fotogramma per fotogramma per la qualità del movimento e possono essere tracciati automaticamente e la raccolta o la quantificazione dei dati non richiede algoritmi o modellazioni aggiuntive. L'obiettivo di questo lavoro è quello di fornire dettagli metodologici e considerazioni coinvolte nella raccolta e nell'analisi dei dati della cinematica dell'andatura 3D durante la locomozione del tapis roulant in ratti sani e feriti da midollo spinale. Questo protocollo è destinato all'uso da parte di ricercatori preclinici che utilizzano modelli di ratto neurologici negli esperimenti.

Protocollo

Questo studio è stato condotto in conformità con le raccomandazioni del National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Il protocollo è stato approvato dal Comitato di ricerca sugli animali del Cancelliere della Stony Brook University.

1. Configurazione del sistema di motion capture

1. Configurazione
2. Montare sei telecamere sulla parete (o treppiedi) utilizzando teste orientate finemente regolabili. Posizionare tre telecamere sopra su ciascun lato del tapis roulant, con ogni telecamera inclinata di 20-45 gradi sotto l'orizzonte, a circa 2,0 m dal tapis roulant e a circa 0,5 m di distanza dalle telecamere adiacenti per la massima copertura dei marcatori (Figura 1).
   1. Equipaggia ogni fotocamera con una luce ad anello per la visualizzazione di marcatori retroriflettenti.
3. Avviare il sistema di motion capture.
   1. In Progetto Specifica, definire i marcatori desiderati per l'esperimento.
      NOTA: a scopo dimostrativo, viene utilizzato un totale di 22 marcatori sia per gli arti anteriori che per gli arti posteriori (11 marcatori su ciascun lato) per valutare la locomozione quadrupede bilaterale. In alternativa, l'opzione Importa marcatore con ID marcatore specifico consente calcoli preimpostati all'interno del software.

2. Calibrazione del sistema di motion capture

1. Acquisizione del video di calibrazione
   1. Posizionare il telaio di calibrazione a forma di L (in seguito indicato come "L-frame") ortogonale sul tapis roulant, con la gamba lunga del telaio A L che punta nella direzione di marcia del ratto (Figura 2).
   2. Aprire il software di motion capture e selezionare Registra per acquisire il video di calibrazione.
   3. Spostare il telaio di calibrazione a forma di tridente (in seguito indicato come "bacchetta") in tutta l'area del tapis roulant nello spazio in modo da coprire tutte le aree in cui il ratto camminerà.
      NOTA: Il fotogramma L contiene quattro marcatori che stabiliscono il sistema di coordinate globale e la bacchetta contiene tre marcatori che calibrano lo spazio di camminata 3D del ratto.
   4. Registrare un minimo di 1 min di metraggio per assicurarsi che siano presenti punti dati di bacchetta adeguati per una corretta calibrazione a 120 fotogrammi/s.
   5. Salvare i video come file di calibrazione 3D.
2. Tracciamento L-Frame
   1. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul gruppo di telecamere e selezionare Tracciamento 3D. Nella finestra a discesa, selezionare Video di calibrazione 3D, quindi Tutte le telecamere di calibrazione.
   2. Utilizzando la funzione a virgola fissa, traccia l'origine del fotogramma L, il cortometraggio L, il mid-frame L e il l-frame long su ciascuno dei sei video di calibrazione. Definire tutti i punti e selezionare il pulsante Cerca automaticamente.
      NOTA: la posizione del telaio L deve rimanere costante rispetto al tapis roulant durante l'intero esperimento per evitare lo spostamento del sistema di coordinate.
3. Tracciamento delle bacchedi
   1. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul gruppo di telecamere e selezionare Tracciamento automatico 3D-Wand.
   2. Selezionare tutte le telecamere nella selezione della fotocamera. Nella parte inferiore destra della finestra selezionare Opzioni, deselezionare Rileva frame Le selezionare Avvia rilevamento.
   3. Dopo il tracciamento automatico, selezionare Assegna lunghezza corta, metà della bacchetta e lunghezza della rugosa per tutte e sei le telecamere.
   4. Nella finestra rilevamento 3D, selezionare Esporta in dati non elaborati, quindi selezionare l'opzione Sovrascrivi dati di protezione dati esistenti per salvare il rilevamento.
   5. Selezionare Sì nella finestra visualizzata dopo l'ultimo passaggio per salvare i dati più accurati.
      NOTA: questo nuovo tracking verrà salvato come Tracciamento nella scheda Tracciamento automatico nella barra laterale sinistra. Il rilevamento salvato è accessibile e modificato in un secondo momento.
4. Calcolo della calibrazione
   1. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Gruppi di calibrazione della videocamera e selezionare Nuovo gruppo di calibrazione della bacchetta.
   2. Selezionare Tutte le telecamere e tenere premuto il tasto Ctrl (controllo) mentre si seleziona OK.
   3. Impostare la lunghezza della bacchetta su 100,00 mm, l'offset del pavimento del telaio L su 7,00 mm, le iterazioni per il rilevamento di outlier a 4 e la deviazione della lunghezza della bacchetta consentita a 0,300.
   4. Modificare l'opzione Fotocamera in cui la bacchetta deve essere visibile in 4 e attivare quanto segue: correggere le proporzioni, correggere il parametro di inclinazione e correggere il punto principale ( Tabella1).
      NOTA: queste impostazioni sono state ritenute sperimentalmente ottimali per questa configurazione.
   5. Accettare le calibrazioni con deviazione standard della lunghezza della bacchetta inferiore a 3 mm e un valore residuo inferiore a 0,004.
      NOTA: Se le telecamere o le apparecchiature associate vengono spostate oltre questo punto, sarà necessario ricalibrare il sistema.

3. Addestramento e preparazione dell'animale per la locomozione del tapis roulant

1. Addestrare i ratti per la locomozione del tapis roulant
   1. Acclimata i ratti al tapis roulant per 5 minuti prima di una sessione di allenamento¹².
   2. Addestrare i ratti a camminare con pieno peso sui loro arti a 13 cm / s per 15 min / sessione al mattino per 1 settimana. Allenare tutti i ratti fino a quando non sono in grado di camminare costantemente (minimo 10 passi continui) sul tapis roulant¹².
   3. Completa le sessioni di allenamento intorno alla stessa ora del giorno per ogni ratto.
2. Prima della raccolta dei dati, anestesizzare il ratto posizionando il ratto in una camera di incubazione.
   1. Consegnare gas Isoflurane (1,0%-2,5%) e 0,4 L di ossigeno per circa 5 min. Pizzica il piede del ratto per verificare la profondità dell'anestesia.
   2. Procedere quando il ratto non risponde al pizzico della zampa (riflesso di ritiro della zampa negativa).
3. Rasare il ratto nelle regioni in cui verranno posizionati i marcatori per evitare che la pelliccia interferisca con il marker tracking (Figura 1).
   1. Palpate la pelle per il punto di riferimento osseo per posizionare i marcatori. Utilizzare indicatori di penna per le articolazioni disrate al gomito e al ginocchio (Figura 3).
      NOTA: I marcatori retroriflettenti sono emisferi di plastica di 0,5 cm di diametro ricoperti di nastro retroriflettente.
   2. Posizionare i marcatori come desiderato sui punti di riferimento ossei prima della raccolta dei dati (Figura 3).
      NOTA: Nei ratti sani e non neurotraumatici, i marcatori retroriflettenti posizionati sopra le articolazioni discrepane vengono spesso rimossi dai ratti. A scopo dimostrativo, i marcatori retroriflettenti sono posizionati sopra i punti di riferimento ossei prossimali (cresta iliaca, anca, articolazione del ginocchio per gli arti posteriori, le articolazioni della spalla e del gomito per l'anteriore), e i pennarelli vengono utilizzati per i punti di riferimento più distale. Nelle nostre mani, questo ha prodotto risultati riproducibili tra e all'interno dei ratti (dati inediti).

4. Cattura del movimento

1. Selezionare il pulsante rosso della fotocamera nella barra superiore del software di motion capture per registrare una versione di prova. Specificare la posizione di salvataggio sul computer e selezionare Inizia registrazione per registrare a 120 fotogrammi.
2. Impostare una velocità del tapis roulant definita dall'utente e consentire al ratto di camminare per circa 30 s, o un minimo di 10 passi continui.
3. Interrompere la registrazione e verificare che il metraggio contenga almeno 10 passaggi continui di 10 USD prima di continuare.
4. Creare un nuovo gruppo di telecamere per ogni prova dopo aver salvato il video registrato.

5. Tracciamento del movimento

1. Selezionare il segno " -" accanto al gruppo di telecamere salvato. Verrà visualizzato un elenco di tutte e sei le telecamere.
2. Assegnare la calibrazione 3D al file della fotocamera
   1. Vai al gruppo di calibrazione della videocamera e fai clic con il pulsante destro del mouse su Calibrazione calcolata. Selezionare Assegna parametri telecamera 3D. Assegnare il file di calibrazione ai file della videocamera appropriati nel gruppo di telecamere salvati. Passare il mouse sul file della telecamera per verificare la calibrazione (si legge come calibrazione 3Dvalida).
3. Tracciamento 2D della telecamera individuale
   1. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul gruppo di telecamere per il rilevamento del movimento. Selezionare Tracciamento 2D.
   2. Seleziona da sette a dieci passaggi migliori continui e coerenti per il monitoraggio. Registrare il numero del fotogramma al primo contatto dell'arto di riferimento sul tapis roulant per ogni passo.
      NOTA: a scopo dimostrativo, l'arto posteriore sinistro è stato selezionato come arto di riferimento.
4. Sono disponibili varie opzioni di tracciamento.
   1. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul marcatore di interesse e selezionare Tracciamento automatico, che rileverà le macchie circolari luminose create da marcatori retroriflettenti (Figura 4).
   2. In alternativa, tenere traccia dei marcatori utilizzando Pattern matching, che utilizzerà un algoritmo integrato nel software per tenere traccia dei marcatori in base alle dimensioni e al colore (Figura 4).
   3. Monitora e correggi manualmente marcatori non rilevabili o errori nel monitoraggio.
5. Utilizzare marcatori neri quando i giunti retroriflettenti distale non sono possibili.
   1. Traccia i marcatori neri utilizzando l'elaborazione avanzata delle immagini invertendo i marcatori neri in punti luminosi per il tracciamento automatico.
      NOTA: l'opzione Elaborazione immagine può essere utilizzata per tenere traccia dei marcatori difficili da rilevare o vedere.
   2. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul video del ratto nella finestra di tracciamento 2D. Selezionare Elaborazione immagine.
   3. Selezionare Visualizzazione avanzata e aggiungere una combinazione dei quattro filtri (luminosità, contrasto, gamma) per rendere il marcatore nero il più scuro possibile rispetto all'ambiente circostante. Infine, aggiungere Inverti, e il marcatore nero diventerà un marcatore luminoso che può essere tracciato automaticamente (Figura 5).
6. Correzione del posizionamento del marcatore
   1. Monitora e correggi manualmente marcatori non rilevabili o errori nel monitoraggio.
   2. Per monitorare manualmente il video, seleziona il marcatore desiderato nella barra laterale destra. Fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Rilevamento manuale. Iniziate a tracciare il marcatore selezionato sul video del ratto che appare fotogramma per fotogramma.
   3. Per correggere eventuali errori, passare al frame in cui si è verificato l'errore di rilevamento. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla scheda del marcatore specifico nella barra laterale destra e scegliere Elimina punto. Ritracciare il punto manualmente nella posizione precisa.
7. Utilizzando il metodo di cui sopra, il tracciamento 2D completo per tutte le telecamere utilizzate per tutti i marcatori desiderati nella gamma di fotogrammi di passi continui.
8. Clicca su Salva durante tutto il processo di tracciamento.

6. Analisi cinematica

1. Assegnazioni di fase
   1. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Fasi e selezionare Modifica modello di fase.
   2. Personalizzare le fasi del ciclo di andatura per ogni arto in base ai deficit si sceglie di studiare (ad esempio, l'aggiunta di fasi di trascinamento, fasi di curl delle dimiche, ecc.) all'interno delle fasi tradizionali di posizione e oscillazione di un ciclo a gradini. Definire le fasi per l'esperimento (Figura 6).
      NOTA: A scopo dimostrativo, vengono mostrate tre fasi e l'arto posteriore sinistro viene utilizzato come arto di riferimento per i sette-dieci cicli di andatura.
   3. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla videocamera nel gruppo di videocamere e selezionare Mostra video.
   4. Assegnare le fasi del ciclo di andatura per ogni arto all'interno del software utilizzando il pulsante Aggiungi fase o il tasto di scelta rapida F11.
   5. Selezionare l'arto appropriato in fase di analisi e designare il primo fotogramma di tracciamento come inizio della fase di stance.
   6. Fai avanzare il video al fotogramma in cui termina la fase di posizione e inizia la fase di oscillazione. Designare questo fotogramma come inizio della fase di oscillazione.
   7. Portare il video al primo fotogramma in cui il piede inizia a scendere. Designare questo fotogramma come inizio della fase di oscillazionemedia.
      NOTA: Qui, la fase di posizione di un ciclo di passo per ogni arto è definita come il primo fotogramma in cui l'arto contatta la superficie del tapis roulant. La fase di oscillazione è definita come il primo fotogramma in cui l'arto lascia la superficie del tapis roulant. La fase di oscillazione media è il telaio in cui l'arto ha raggiunto la massima distanza e inizia a scendere. Un ciclo di andatura completo è definito dall'inizio della posizione iniziale all'assegnazione della fase di posizione del ciclo di andatura successivo.
   8. Ripetere questi passaggi fino a completare le assegnazioni delle fasi dell'arto per ogni passaggio. Ripetere per gli altri tre arti.
2. Calcoli delle coordinate 3D
   1. Esegui calcoli 3D dopo aver monitorato tutte e sei le telecamere.
   2. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul gruppo di telecamere e selezionare Nuovo calcolo 3D, fare clic su Tutti per la selezione della fotocamera, quindi selezionare OK.
      NOTA: verrà visualizzata una nuova cartella. Questa cartella contiene tutti i dati delle coordinate 3D per tutti i marcatori tracciati. Per visualizzare e/o modificare le fasi, fare clic con il pulsante destro del mouse sulle coordinate 3D nella barra laterale sinistra e selezionare Modifica fasi ( Figura7).
   3. Generare dati di interesse, ad esempio diagrammi di altezza o velocità giunti con punti dati trascinando il marcatore di interesse per visualizzare fianco a fianco con le fasi di andatura assegnate. (ad esempio, cinematica congiunta nella Figura 8).
3. Diagramma 3D
   1. Fare clic su Diagramma 3D per generare una figura 3D della versione di prova.
4. Esportare i dati non elaborati facendo clic con il pulsante destro del mouse su coordinate 3D/Esporta.
   1. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul file delle coordinate 3D e selezionare Esporta.
   2. Aprire il file in un foglio di calcolo software e importare i dati in MATLAB.
   3. Creare un programma per creare grafici di coordinazione dell'altezza del passo dell'arto.
      NOTA: i dati delle coordinate 3D possono essere esportati in software di analisi o script macro personalizzati definiti per generare più dati, al di là di ciò che offre le funzionalità del software.

Risultati

Questo protocollo dimostra una metodologia per la raccolta e l'analisi quantitativa dei dati cinematici 3D per la locomozione del tapis roulant nei roditori utilizzando un software semplice e integrato. I risultati mostrano che il protocollo è fattibile nella raccolta e nell'analisi della cinematografia quadrupede in ratti sani e feriti dal midollo spinale. I ricercatori con esperienza di gestione dei ratti devono posizionare marcatori sui ratti, quindi calibrare e utilizzare il sistema di motion capture senza problemi critici. I dati sono facilmente generati senza l'uso di algoritmi complessi.

Qui, il protocollo è stato implementato in ratti sani e feriti del midollo spinale (C5 emisezione destra). Ai fini del presente manoscritto, vengono indicati solo i risultati rappresentativi. Nel complesso, varie cinematiche del movimento del segmento articolare e degli arti erano facilmente ottenibili dalle coordinate 3D di ciascun marcatore. Le differenze critiche tra l'andatura anomala e i cicli di andatura sana sono state facilmente rilevate con esiti multipli, tra cui (ma non solo) misure di altezza della fase, velocità articolare, angolo articolare (Figura 9), durate di fase del ciclo passo per tutti e quattro gli arti, coordinazione degli arti (Figura 10). L'analisi dei dati qualitativi sotto forma di grafici e diagrammi a bastone può guidare la determinazione degli strumenti quantitativi utilizzati per implementare i risultati finali di questo approccio di analisi (Figura 11).

In un ratto sano rappresentativo, il profilo dell'angolo del gomito ha dimostrato picchi solidi uniformi con cicli di andatura adiacenti coerenti che mostravano un intervallo completo di movimento (Figura 9). La fase di posizione alternata e le durate della fase di oscillazione delle tracce hanno suggerito una coordinazione intralimb coerente. Al contrario, il profilo dell'angolo del gomito di un ratto ferito al midollo spinale rappresentativo ha dimostrato più picchi distorti, che erano meno coerenti e di intervalli di movimento più piccoli. Oltre alle alterazioni nella fase di posizione allungata e alla durata della fase di oscillazione accorciata, si è registrata una carenza nel coordinamento degli intralimbi per la RFL.

Nei dati rappresentativi presentati tracciati per il coordinamento, si è scoperto che i grafici di coordinamento (Figura 10) generati da ratti sani rappresentativi mostravano una coordinazione ritmica ben definita e alternata negli arti ipsilaterali durante l'andatura (modello a forma di L) e il modello a forma di D in fase d'azione con arti contralaterali. In confronto, un ratto rappresentativo del midollo spinale ferito (emisezione destra C5) ha mostrato una scarsa coordinazione non alternata e non ritmica negli arti ipsilaterali e un'insolita coordinazione ritmica alternata (modello a forma di L) in uno dei accoppiamenti di arti (Figura 10). Dato il deficit osservabile nell'anteriore destro nel video registrato, ciò suggerisce che la RFL e la LHL non erano in grado di sopportare il peso pieno senza il supporto di LFL o RHL in un dato momento. Questa tendenza suggerisce un meccanismo compensativo per far fronte alla velocità di marcia forzata su un tapis roulant.

I dati quantificabili sono stati facilmente generati dall'uso del sistema 3D, ma ciò ha comportato l'accesso a schede separate e la selezione tra una moltitudine di opzioni disponibili all'interno del software. C'è attualmente il lavoro sullo sviluppo di un modello automatizzato che genererà dati quantitativi e qualitativi in un unico rapporto per i risultati di interesse più evidenti (senza la necessità di generare singolarmente risultati diversi), come avviene abitualmente con sistema cinematico utilizzato per studi clinici. Di conseguenza, diversi endpoint possono essere compilati ed esportati in un formato di report che può essere facilmente visualizzato immediatamente dopo una prova.

Figura 1 : configurazione sperimentale. (A) Schematica di una raccolta di dati cinemici a sei telecamere per un'attività di camminata sul tapis roulant. Un set di tre telecamere è posizionato su entrambi i lati del tapis roulant per catturare (fotogramma per fotogramma) i movimenti dei marcatori a sinistra e a destra durante la locomozione. (B) Diagramma che raffigura il posizionamento dei marcatori su punti di riferimento ossei sugli arti anteriori e posteriori del roditore per catturare la cinematografica della locomozione quadrupedale. Un totale di 11 marcatori è posto su ogni lato del ratto. Le regioni ombreggiate mostrano l'area in cui il ratto è rasato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : marcatori per la calibrazione. (A) Assegnazioni di set di indicatori per il sistema di calibrazione della bacchetta, utilizzando due fotogrammi di calibrazione: L-Frame e wand (B) Il sistema di coordinate è definito dal telaio L, dove l'origine L-Frame (intersezione di due gambe del telaio) è definita come (0,0). I due arti del l-Frame, L-Frame short, e L-Frame long definiscono rispettivamente gli assi x e y, e l'asse z è definito come perpendicolare al piano XY. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : tipi di marcatore. (A) Fotografia del tronco inferiore del ratto che mostra i due tipi di marcatori utilizzati. (B) Per quanto mi risse in due La fotografia mostra un marcatore retroriflettente posto sulla cresta iliaca con nastro a due lati che è progettato per aderire alla pelle (rosso cerchiato). (C) Per quanto mi licolo, la La fotografia mostra il posizionamento di un indicatore di penna sull'articolazione metatarshalangele destra (rosso cerchiato). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : tracciamento del movimento. (A) Immagine mostra l'interfaccia di tracciamento del movimento in cui è possibile tracciare più marcatori contemporaneamente utilizzando le funzioni "Traccia automaticamente" e "Traccia utilizzando criteri di ricerca". (B) La vista ingrandita di un marcatore retroriflettente viene rilevata come un punto circolare bianco brillante nella funzione "Traccia automaticamente" durante l'assegnazione del marcatore. Il software riconosce questo punto come un punto circolare blu brillante. Il punto rosso viene infine riconosciuto come il centro del marcatore prescritto. Una macchia rossa centrata all'interno dell'indicatore circolare riduce le probabilità di errori sperimentali durante il rilevamento dei dati. La deviazione dal centro suggerisce che la misurazione e le analisi successive sono probabilmente imprecise. (C) Per quanto mi licolo, la Vista ingrandita di un marcatore retroriflettente selezionato per la corrispondenza dei pattern. In base alle dimensioni, alla forma e al colore del marcatore selezionato, il software identifica automaticamente i marcatori corrispondenti alla descrizione nei fotogrammi video successivi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 : opzioni di tracciamento di base e avanzate. (A) I video possono essere elaborati all'interno del software facendo clic con il pulsante destro del mouse sul video durante l'analisi in modo che i marcatori non chiari o sfocati siano visualizzati chiaramente per consentire il tracciamento automatico. A scopo dimostrativo, vengono mostrati due tipi di impostazioni di elaborazione delle immagini che vengono regolati per adattarsi a diverse condizioni di illuminazione ambientale durante la raccolta dei dati per un facile tracciamento. (B) Un fotogramma video rappresentativo prima dell'elaborazione delle immagini. (C) Per l'elaborazione di base delle immagini (tipo io), le impostazioni di luminosità e contrasto vengono regolate per una visualizzazione più chiara. (D) Utilizzando le impostazioni avanzate di elaborazione delle immagini (tipo di elaborazione II), il giusto marcatore articolare metatarsofhalangeal (marcatore nero) viene invertito e può quindi essere tracciato automaticamente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6 : assegnazioni di fase. Il ciclo di andatura per ogni arto può essere diviso in fasi discrete secondo la progettazione sperimentale. A scopo dimostrativo, vengono mostrate tre fasi del ciclo di andatura. (A) La fase di stance è definita come il primo fotogramma in cui l'arto contatta la superficie del tapis roulant. (B) La fase di oscillazione è definita come il primo fotogramma in cui l'arto lascia la superficie del tapis roulant (C) La fase di oscillazione media è il primo fotogramma dopo lo spazio dell'arto in cui la zampa inizia a scendere. In (D), un ciclo di andatura completo viene definito dall'inizio della posizione iniziale all'assegnazione della fase di fase di posizione del ciclo di andatura successivo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7 : opzioni avanzate per l'analisi della fase passo. Questa opzione consente una visualizzazione approfondita delle assegnazioni di tracciabilità e di fase, nonché la possibilità di modificare le assegnazioni di fase. (A) Casella di selezione del marcatore per visualizzare e selezionare il marcatore desiderato. (B) Finestra di selezione delle coordinate: evidenziando la coordinata di interesse (in questo caso, le coordinate z) verrà visualizzata come rossa nella finestra principale del diagramma. (C) La finestra di selezione della fase: le fasi assegnate per un arto possono essere visualizzate rispetto ai marcatori e alle coordinate selezionati in (A) e (B). Le fasi possono anche essere modificate tramite questa finestra. (D) Finestra Diagramma: le coordinate di un marcatore specifico possono essere confrontate contemporaneamente durante le singole fasi del ciclo di andatura. Il verde e il giallo rappresentano le fasi di posizione e oscillazione rispettivamente per l'arto posteriore destro durante la locomozione quadrupede. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8 : Campione di dati cinematici 3D. (A) I vari risultati di ciascun marcatore articolare possono essere visualizzati pittoricamente dal set di dati delle coordinate 3D dopo il tracciamento video (B) Dati rappresentativi generati per i cicli di fase di posizione e oscillazione per ciascun arti anteriori e posteriori durante quadrupede a piedi in un topo. I colori rappresentano le fasi di posizione e oscillazione dei cicli di passo consecutivi. Il rosso e il verde corrispondono rispettivamente alle fasi di posizione dell'arto anteriore e dell'arto posteriore destro. Il blu e il verde acqua corrispondono rispettivamente alle fasi di posizione dell'anteriore sinistro e dell'arto posteriore. Il giallo corrisponde alla fase di oscillazione di ogni arto. (C) Più gruppi di dati (marcatori o risultati discreti) possono essere confrontati contemporaneamente con facilità. I dati sulla velocità di coordinate z dei marcatori dell'articolazione del ginocchio sinistro e destro vengono selezionati arbitrariamente per dimostrare la velocità verticale del marcatore dell'articolazione del ginocchio dalla superficie del tapis roulant. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9 : dati netematici angolari di articolazioni rappresentativi provenienti da ratti sani e cervi feriti dal midollo spinale durante la locomozione del tapis roulant. (A) Profilo dell'angolo giunto a gomito in un ratto rappresentativo sano dimostra picchi lisci e singoli di tracce di angolo articolare con cicli di andatura adiacenti coerenti che mostrano una gamma completa di movimento. Le barre rosse e gialle indicano rispettivamente la posizione e le fasi di oscillazione del ciclo del passo dell'anteriore. (B) Al contrario, le tracce di un ratto lesse del midollo spinale rappresentativo sono relativamente più distorte e mostrano picchi multipli incoerenti con una gamma complessivamente più piccola di movimento articolare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10 : dati rappresentativi di coordinazione degli arti provenienti da un ratto midollo spinale sano e cervico durante la locomozione del tapis roulant. (A) I valori delle coordinate z dei marcatori metacarpophalangeal (MCP) e metatarsophalangeal (MTP) raffiguranti misure di altezza dei gradini sono tracciati in sei diverse combinazioni tra gli arti da circa 10 passi durante la camminata quadrupla. Sono mostrate dimostrazioni rappresentative di tutte le sei possibili coppie di coordinamento degli arti. (B) Un ratto sano mostra una chiara coordinazione ritmica alternata (modello a forma di L) per tutte le coppie (i, ii, iii, iv). Quando gli arti sono in fase (v, vi), le coppie di coordinazione seguono un modello a forma di D. (C) In un ratto ferito al midollo spinale cervicale, notare (i) la scarsa coordinazione tra i due arti anteriori, (iii) l'accoppiamento ipsilaterale destro e (iv) la coordinazione insolita per una delle coppie di arti contralaterali. Si noti che i grafici di coordinamento (B,C) non condividono la stessa scala. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 11 : Figura bastone 3D animata. Esempio di una figura a bastone 3D generata dai dati tracciati. Clicca qui per scaricare questa figura.   

Parametro di calibrazione	Ingressi di calibrazione
Lunghezza bacchetta [mm]	100 del sistema
L-Frame Scostamento pavimento [mm]	7 (in questo stato
Iterazioni per il rilevamento outlier	4 DEL psu'
Deviazione lunghezza/lunghezza bacchetta consentita	0.3 0.3
La bacchetta deve essere visibile in almeno __ telecamere	4 DEL psu'
Correggere le proporzioni	a quadretti
Correggere il parametro di inclinazione	a quadretti
Fissare il punto principale	a quadretti

Tabella 1: Impostazioni avanzate per la calibrazione. La tabella riassume i parametri che abbiamo usato per calibrare con precisione il set-up a sei telecamere. Queste impostazioni sono state testate sperimentalmente e sono state ritenute ottimali per il nostro set-up.

Discussione

Questo articolo di protocollo dimostra l'uso di un sistema di tracciamento del movimento per la raccolta e l'analisi di dati cinematici 3D durante la locomozione del tapis roulant quadrupede nei roditori. Importanti caratteristiche del sistema di analisi del movimento kinematico 3D includono la quantificazione dettagliata della cinematica del movimento articolare (fase graduale, angoli articolari, gamma di movimento, velocità di passo) da più articolazioni e arti contemporaneamente, rilevamento di deficit motori non misurabili ad occhio nudo, eliminazione di pregiudizi soggettivi nella raccolta e nell'analisi dei dati e facile visualizzazione dell'intero arto e della cinematica posturale che può essere confrontata con la giustapposizione simultanea dell'intero ratto in movimento. Senza la necessità di algoritmi e modellazioni aggiunti, i metodi mostrano la capacità del software di analizzare quantitativamente la cinematica dell'andatura con grandi dettagli, efficienza, facilità, precisione e riproducibilità.

Nei roditori, i deficit locomotori degli arti anteriori e posteriori dopo un infortunio al midollo spinale (SCI) sono comunemente valutati utilizzando sistemi di punteggio locomotori soggettivi e standardizzati come il sistema di punteggio BBB¹. I sistemi di punteggio soggettivi generalmente introducono la distorsione del tester perché diversi ricercatori possono assegnare punteggi diversi per lo stesso deficit motorio o lo stesso punteggio per diversi deficit motori, con conseguente riduzione della riproducibilità e sensibilità del test¹³ . Inoltre, l'incapacità di rilevare deficit sottili comporta il rischio di dedurre ingiustamente gli effetti di un intervento.

Per combattere questi problemi, i sistemi automatizzati^2,3,4,5 e i sistemi con o senza l'uso di complessi algoritmi^14,15 sono stati adottati da alcuni investigatori. Questi test eseguono un'analisi del ciclo di fasi che rivela i profili di cuscinetto del peso e i modelli di sequenza di gradini derivati dai movimenti di posizionamento delle zampe dei ratti che attraversano una pista. Tuttavia, uno svantaggio principale dell'analisi dell'andatura video del piano ventrale è che il corpo del soggetto stesso non è direttamente visibile^2,3. Questi dati diventano limitati alle informazioni ottenute da impressioni di movimenti di piedi e zampe, mettendo in discussione la selezione e l'interpretazione dei parametri di andatura nella valutazione dei deficit (cfr. Chen et al.¹⁶). Dettagli di movimento che rivelano la cinematica segmentale dinamica del movimento e del posizionamento degli arti non sono ottenibili con precisione per l'analisi della locomozione^3,5. Deviazioni critiche dei dati dell'angolo articolare (cioè la gamma dei movimenti, la velocità dei movimenti, ecc.), la relazione delle articolazioni rispetto all'altro all'interno di un arto e tra gli arti, e la meccanica del corpo sottostante che alterano i modelli di andatura sono impossibili da ottenere. Di conseguenza, se eventuali menomazioni osservabili dell'andatura siano conseguenti a alterazioni nei movimenti articolari singoli e/o multipli segmentati (ad esempio, coordinamento intralimbo prossimale-distal, relazioni posturali del tronco rispetto alla posizione e al ciclo di andatura gli arti, ecc.) rimangono mascherati.

Pochi sistemi attualmente disponibili catturano l'andatura cinematica e valutano la disfunzione motoria qualitativamente e quantitativa, ma sono meno ampiamente utilizzati. Un sistema di analisi dell'andatura video-tracking ad alta velocità a tutto corpo filma cicli di andatura spontanei da tre lati (un piano ventrale e due laterali) e traccia punti di riferimento ossei per emettere una serie di esiti di andatura^17,18. L'analisi dell'andatura cinematica del piano sagittale è impiegata da alcuni ricercatori per ottenere dati di movimento 2D dell'arto posteriore interessato^19,20. Tuttavia, una terza dimensione del movimento che si verifica ortogonale al piano di osservazione (laterale o sagittale) non è rilevabile nelle analisi^11,18,19.

Altri sistemi di raccolta postura del corpo del roditore più sofisticati, 3D e tre del roditore utilizzano la modellazione matematica 3D della raccolta dei dati e il sistema di analisi per tracciare e quantificare il movimento 3D dei segmenti del corpo del roditore, includendo la testa modelli di movimento⁸. Madete et al.⁹ hanno sviluppato un sistema di recupero del movimento optoelettronico basato su marcatori per quantificare la cinematica posturale del corpo 3D durante la locomozione fuori terra sui fasci che camminano utilizzando un sistema a sette telecamere. I principali risultati studiati in queste ultime due opere si concentrano principalmente sulla postura complessiva del roditore piuttosto che sull'analisi dell'andatura. I sistemi di motion capture 3D forniscono dati di andatura cinematici 3D ad alta velocità utilizzando più telecamere e sistemi software elaborati, come esaminato da Bhimani et al.²¹. Le versioni più vecchie del sistema di analisi del movimento 3D presentato sono state utilizzate anche in lavori precedenti in ratti con e senza neurotrauma^12,22,23.

Nonostante la disponibilità di sistemi di raccolta e analisi del movimento 3D per la ricerca, l'uso preclinico di questa tecnica nei roditori rimane relativamente limitato. Parte della ragione di questo problema è che i protocolli di raccolta e analisi dei dati si basano fortemente sull'uso di modelli cinematici e algoritmi complicati che si adattano a un modello cinematico dell'arto posteriore del ratto durante la camminata per generare fine, ad alta risoluzione andatura cinematica^8,9,11,22. La metodologia dettagliata qui presentata fornisce i dettagli della procedura coinvolta durante tutto il processo sperimentale, tra cui la movimentazione degli animali, la formazione, l'impostazione sperimentale, la raccolta dei dati e le fasi di analisi.

Sono inoltre forniti dettagli sulla calibrazione del sistema, che è la parte fondamentale del protocollo, che assicurerà la riproducibilità tra prove adiacenti all'interno e tra i soggetti. Le tecniche passo-passo descritte introducono l'obiettività nella procedura di raccolta dei dati e la rendono altamente riproducibile. I dati generati da questo software di motion capture possono essere visualizzati fotogramma per fotogramma per la qualità del movimento e tracciati automaticamente. Più descritto è come questa raccolta o quantificazione dei dati non richiede algoritmi o modellazioni aggiuntive. Studenti, personale e ricercatori possono utilizzare semplici software statistici per generare output cinematico di base senza fare affidamento su specifiche competenze tecniche.

Questo sistema può essere utilizzato anche per la locomozione fuori terra, raggiungere e afferrare, e altri set-up sperimentali per soddisfare l'obiettivo sperimentale. Il numero e il tipo di marcatori possono anche essere regolati per la coda, la schiena, il tronco o le orecchie, in base alle esigenze. Un grande vantaggio del software presentato rispetto ai sistemi è la sua capacità di raccogliere dati video ad alta risoluzione del soggetto. Di conseguenza, insiemi complessi di calcoli (ad esempio, movimenti angolari, linee di bastone che collegano più giunti, ecc.) possono essere sovrapposti al video registrato. Il posizionamento del marcatore e i dati 3D generati possono essere verificati con i movimenti effettivi di un ratto in movimento. Al contrario, con l'altro sistema di motion capture 3D, vengono acquisiti solo i marcatori e qualsiasi rianalisi deve essere eseguita sui diagrammi stick (framework scheletrico) invece del video del soggetto effettivo. Di conseguenza, manca la verifica del posizionamento dei marcatori sul movimento effettivo del soggetto.

Sulla base dell'esperienza con questo sistema, la calibrazione svolge un ruolo cruciale nel successo della raccolta dei dati. La calibrazione del sistema è molto sensibile al cambiamento. e un leggero movimento di una telecamera può compromettere l'intero processo di raccolta e analisi dei dati delle coordinate 3D. Solo due telecamere su ciascun lato di un piano di visualizzazione sono necessarie per la raccolta dei dati, ma la terza telecamera è altamente consigliata per fornire una maggiore precisione incrociando le posizioni di ogni marcatore con altre telecamere. Con l'aumentare del numero di telecamere di tracciamento, aumenta anche la precisione della coordinata 3D per un marcatore specifico. Durante le occasioni in cui i marcatori diventano oscurati a causa di deficit di andatura (come il curling del dito o la resistenza in caso di andatura dopo il neurotrauma), queste condizioni possono richiedere un ampio monitoraggio manuale. Tuttavia, la quantità di dati eventualmente generati dal monitoraggio è degna del tempo investito nel monitoraggio manuale dei marcatori, rendendolo uno strumento inestimabile per rilevare i piccoli deficit motori.

Nella nostra esperienza, qualsiasi noiosezza associata all'uso del sistema va oltre l'uso delle attrezzature e della tecnologia stessa. Simile ad altri protocolli per la valutazione dei comportamenti motori, il metodo con cui i ratti vengono gestiti e addestrati per l'attività influisce notevolmente sui risultati. Ad esempio, isolare i ratti dalla loro coorte è fondamentale durante i test; in caso contrario, i ratti che non sono testati ma sono ancora presenti durante i test mostrano un eventuale deterioramento delle prestazioni dell'attività. Le temperature ottimali della stanza, l'illuminazione e i livelli di rumore sono altri fattori determinanti. Fouad et al. ha pubblicato altre sfide che accompagnano il test motorio funzionale nei ratti²⁴. Infatti, gli utenti accecati di questo laboratorio che hanno seguito correttamente la metodologia non hanno riscontrato ostacoli principali con la raccolta dei dati, il tracciamento del movimento e l'analisi dei dati.

In questo documento, viene descritto un sistema di motion capture 3D per raccogliere e analizzare efficacemente i dati locomotori in modo che i ricercatori possano raccogliere rapidamente enormi quantità di dati locomotori approfonditi da più ratti. Attualmente stiamo lavorando alla creazione di un modello di analisi automatica dei dati che può essere integrato nel software e diventare in grado di generare un rapporto di risultati predeterminati in pochi secondi per la locomozione del tapis roulant nei roditori, simile a quello che viene fatto in studi utilizzando sistemi di motion capture e analisi^6,25. Lo sviluppo di questo modello permetterà ai ricercatori preclinici di ottenere dati locomotor dettagliati per roditori a comodità di pochi clic di un pulsante del mouse. Si spera che i metodi forniti in questo lavoro si riveleranno utili ai ricercatori preclinici per valutare il comportamento motorio dei roditori in modo più oggettivo. Ora stiamo perfezionando l'uso di questo sistema per raccogliere dati cinematici 3D ad alta velocità durante comportamenti comuni e qualificati degli arti anteriori come raggiungere e afferrare. È importante sottolineare che l'utilità di questo metodo può essere estesa ai ratti con una varietà di lesioni neurotraumatiche e non neurotraumatiche.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sistema di motion capture Basler (Scout scA640-120gu) a 6 telecamere.	Simi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, Germania	N/A	Dispositivo di registrazione per l'analisi del movimento.
Telaio di calibrazione e bacchetta	Simi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, Germania	N/A	Calibrazione a forma di L che definisce il sistema di coordinate globali e la bacchetta a forma di tridente (100 mm)
Marcatori	Shah Lab	N/A	Dispositivo di registrazione per l'analisi del movimento. I pennarelli sono realizzati su misura nel nostro laboratorio da 0,5 cm di occhi finti ricoperti di nastro riflettente.
Matlab	Mathworks, Inc, Natic, Ca	N/A Software	analisi dei dati
Gabbia per roditori	Realizzata su misura all'interno di Stony Brook.	N/A	Gabbia in plexiglass trasparente utilizzata per tenere il roditore sul tapis roulant.
Simi Reality Motion Systems	Simi Reality Motion Systems GmbH Max-Planck-Str. 11 85716 Unterschleibheim, Germania	N/A	Software di tracciamento 3D.
Tapis roulant	Mk Automation Inc., Bloomfield, CT 06002	N/A	Tapis roulant utilizzato per la locomozione dei roditori.

di