Implementazione di un microscopio non lineare basato sullo scattering Raman stimolato

Summary

In questo manoscritto, viene descritta l'implementazione di un microscopio stimolato Raman scattering (SRS), ottenuto dall'integrazione di un set-up sperimentale SRS con un microscopio a scansione laser. Il microscopio SRS si basa su due sorgenti laser femtosecondo (fs), un Ti-Sapphire (Ti:Sa) e un oscillatore parametrico ottico sincronizzato (OPO).

Abstract

La microscopia a dispersione Raman stimolata (SRS) utilizza la luce di eccitazione vicino all'infrarosso; pertanto, condivide molte proprietà di imaging microscopico multi-fotonico. La modalità di imaging SRS può essere ottenuta utilizzando microscopi a scansione laser commerciali equipaggiando un rilevatore in avanti non sottoposto a scansione con filtri a banda e uno schema di rilevamento dell'amplificatore lock-in (LIA). Un layout schematico di un tipico microscopio SRS include quanto segue: due fasci laser pulsati (cioè la pompa e la sonda diretta in un microscopio a scansione), che devono essere sovrapposti sia nello spazio che nel tempo sul piano dell'immagine, quindi focalizzati da un obiettivo del microscopio il campione attraverso due specchi di scansione (SM), che raster il punto focale attraverso un piano x-y. Dopo l'interazione con il campione, gli impulsi di uscita trasmessi vengono raccolti da un obiettivo superiore e misurati da un sistema di rilevamento in avanti inserito in un microscopio invertito. Gli impulsi della pompa vengono rimossi da una pila di filtri ottici, mentre gli impulsi della sonda che sono il risultato del processo SRS che si verificano nel volume focale del campione sono misurati da un fotodiode (PD). La lettura del PD è demodulata dal LIA per estrarre la profondità di modulazione. Un'immagine bidimensionale (2D) viene ottenuta sincronizzando l'unità di rilevamento in avanti con l'unità di scansione al microscopio. In questo articolo, l'implementazione di un microscopio SRS è descritta e dimostrata con successo, così come la segnalazione di immagini prive di etichette di perline di polistirolo con diametri di 3 m. Vale la pena notare che i microscopi SRS non sono disponibili in commercio, quindi per sfruttare queste caratteristiche, la costruzione fatta in casa è l'unica opzione. Poiché la microscopia SRS sta diventando popolare in molti campi, si ritiene che questa attenta descrizione dell'implementazione del microscopio SRS possa essere molto utile per la comunità scientifica.

Introduction

Nelle applicazioni nel campo delle scienze biologiche, la microscopia SRS è emersa come un potente strumento per l'imaging senza etichette. L'idea di base della microscopia SRS è quella di combinare la forza del contrasto vibrazionale e la sua capacità di acquisire immagini in pochi secondi.

SRS è un processo in cui la differenza di frequenza tra due frequenze di raggi laser (segnale pompa e segnale stokes a frequenze diverse) corrisponde alla vibrazione molecolare di un campione studiato, causando dispersione Raman stimolata e un significativo aumento del segnale Stokes. A differenza della spettroscopia raman lineare, sRS presenta una dipe....

Protocol

1. Avvio del sistema laser

1. Controllare se la temperatura dei refrigeratori è mantenuta a o al di sotto dei 20 gradi centigradi.
2. Controllare se l'unità di controllo dell'umidità funziona correttamente e l'umidità viene mantenuta a un valore intorno al 40%.
3. Accendere il laser Ti:Sa, seguendo rigorosamente le istruzioni nel manuale.
4. Impostare la lunghezza d'onda su 810 nm.
5. Accendere l'OPO e il mini-computer collegato. Eseguire l'applicazione che controlla il laser OPO.
6. Selezionare bypass se è richiesto il 100% dell'uscita laser Ti:Sa all'uscita della scatola OPO.
7. Deselezionare ....

Results

Un esempio di misurazione SRS (cioè la misurazione SRS in un singolo punto del campione) è riportato nella figura 7. Quando le travi non sono sovrapposte nel tempo o nello spazio, il risultato ottenuto è riportato nella figura 8a. In off-resonance, l'ampiezza del segnale misurata da LIA è pari a zero, mentre la fase del segnale misurata da LIA salta tra valori negativi e positivi. Mentre, quando le travi sono sovrapposte nello spazio, spostando la linea d.......

Discussion

La microscopia SRS ha portato l'imaging senza etichette a nuove altezze, in particolare negli studi di strutture biologiche complesse come i lipidi, fondamentali per le cellule e l'architettura cellulare. I lipidi sono coinvolti in molteplici percorsi fisiologici come la produzione di membrane biologiche, e servono come precursori biosintetici e trasduttori di segnale¹⁰. I lipidi sono confezionati in organelli intracellulari specializzati, chiamati anche goccioline lipidiche (LD). I loro diametri .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Strumento di acquisizione	Nikon Nikon	C2Tool	Strumento supportato dall'acquisizione
APE Software di controllo del collegamento a impulsi	APE-APE	Software di controllo del collegamento a impulsi	Controllo software
Autocorrelatore	APE	APE PulseCheck USB 50
Rivelatore	autocorrelatore Thorlabs	Thorlabs DET10A
Scheda rivelatore	Thorlabs	rivelatore IR	Thorlabs VRC
Specchio dicroico	Semrock Semrock	FF875-Di01-25X36	Specchio dicroico
Specchio dicroico	Semrock	FF875-Di01-25x36	Specchio dicroico
EOM	Conoptics	(EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P).	Cella di Pockels
Rivelatore veloce	Thorlabs Thorlabs	DET025AL/M	Fotodiodo
Unità di scansione a specchio veloce	Nikon	C2	Testina di scansione Microscpe
Laser a femtosecondi Ti:SA	Coerente	coerente Camaleonte Ultra II Camaleonte	ultra II
Generatore di funzioni	TTi	TG5011 AIM – Generatore di funzioni TTi
Microscopio ottico invertito	Nikon	Eclipse TE-2000-E, Nikon	Eclipse TE-2000-E,
Nikon Lock-in Amplifier	Standford Research System	SR844-200 MHz	bifase A Lock-in Amplifier di Stanford Research Systems
Filtro notch,	Semrock	NF03-808E-25	Filtro notch
Linea di ritardo ottica	Newport Newport	M-ILS200CC	Linea di ritardo ottica sintonizzabile
Oscillatore parametrico ottico	Coerente	OPO compatto OPO	Oscilloscopio OPO compatto coerente
	WaveRunner	640Zi 4GHz OSC/LeCroy	Oscilloscopio digitale
Scheda PCI	Strumento nazionale	NI PCIe 6363	Scheda di acquisizione dati
Sensori di posizione Rivelatori	Newport Newport	Conex PSD9	Sensore rilevatore di posizione
Testa del misuratore di potenza	PowerMax	PM10 coerente,	rivelatore di potenza laser
Stadi di traslazione	Thorlabs	Thorlabs PT1/M	Stadio di traslazione meachnical con micrometro standard