Qui, presentiamo un protocollo per elaborare il midollo osseo fresco (BM) isolato dal topo o dall'uomo per l'analisi di citometria di massa ad alta dimensione (Cytometria da Time-Of-Flight, CyTOF) delle cellule di filo neutrofilo.
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Articolo metodologico
Preparazione del midollo osseo intero per l'analisi della citometria di massa delle cellule di lignaggio neutrofilo
In questo articolo
Sommario
Abstract
In questo articolo, presentiamo un protocollo che è ottimizzato per preservare le cellule di lignaggio neutrofilo in BM fresco per l'intera analisi BM CyTOF. Abbiamo utilizzato un pannello CyTOF a 39 anticorpi di 39 anticorpi mieloidi per valutare il sistema ematopoietico con particolare attenzione alle cellule di linea di neutrofili usando questo protocollo. Il risultato CyTOF è stato analizzato con un algoritmo di riduzione dimensionale delle risorse aperte, viSNE, e i dati sono stati presentati per dimostrare l'esito di questo protocollo. Abbiamo scoperto nuove popolazioni di cellule di lignaggio neutrofia basate su questo protocollo. Questo protocollo di preparazione di BM intero fresco può essere utilizzato per 1), analisi CyTOF per scoprire popolazioni di cellule non identificate da tutta BM, 2), studiando interi difetti BM per i pazienti con disturbi del sangue come la leucemia, 3), assistendo l'ottimizzazione di cicli di citometria di flusso attivati a fluorescenza che utilizzano BM intero fresco.
Introduzione
Negli ultimi decenni, i metodi di citometria sono stati un potente strumento per studiare il sistema ematopoietico nel BM. Questi metodi includono la citometria di flusso attivata dalla fluorescenza e il nuovo metodo di CyTOF che utilizza anticorpi con etichettatura di metalli pesanti. Hanno portato a scoperte di molti tipi di cellule in un campione biologico eterogeneo identificando i loro profili unici di espressione dei marcatori di superficie. L'aumento delle sovrapposizioni di spettro associate a più canali porta a una maggiore imprecisione dei dati nelle applicazioni di citometria di flusso attivate dalla fluorescenza. Pertanto, le cellule indesiderate vengono r....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti seguiti hanno approvato le linee guida del La Jolla Institute for Allergy and Immunology Animal Care and Use Committee, e l'approvazione per l'uso dei roditori è stata ottenuta dal La Jolla Institute for Allergy and Immunology secondo i criteri delineati in la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio degli Istituti Nazionali di Sanità.
1. Raccoglitore del midollo osseo del mouse (BM)
- Acquista topi C57BL/6J da un fornitore commerciale. Nutrire la dieta standard del chow del roditore e la casa in gabbie di microisolatore in una struttura priva di agenti patogeni.
- Utilizzare topi maschi, ....
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Risultati
La figura 1 è presentata come risultato di esempio dagli esperimenti CyTOF. Su questa trama tSNE le cellule su più tessuti del topo sono state raggruppate in sottoinsiemi in base alla somiglianza dei loro profili di espressione dei marcatori di superficie misurati da un pannello CyTOF a 33 parametri. Le cellule con proprietà più simili sono state raggruppate automaticamente, come i neutrofili, i macrofagi o i controller di dominio in base all'espressione dei 33 marcatori su ogni cellula.
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Discussione
Negli ultimi decenni, la citometria di flusso basata sulla fluorescenza è stata utilizzata come metodo principale per studiare le linee cellulari e l'eterogeneità1,2,3. Sebbene la citometria di flusso abbia fornito dati multidimensionali, questo metodo è limitato da scelte di parametri e sovrapposizione spettrale. Per superare la debolezza della citometria di flusso abbiamo approfittato di CyTOF, che utilizza isotopi di metalli .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il nucleo di Cytometry LJI Flow per l'assistenza con la procedura di citometria di massa. Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01HL134236, P01HL136275 e R01CA202987 (tutte a C.C.H) e ADA7-12-MN-31 (04) (a C.C.H. e Y.P. ) .
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| CyTOF Antibodies (topo) | |||
| Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Umano/Topo CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Biolegend | Purificato Cat# 120402; RRID:AB_961070 | ||
| Anti-topo CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Biolegend Purificato | Gatto# 135502; RRID:AB_1937293 | ||
| Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er | Fluidigm | Cat# 3166004B | |
| Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Biolegend Purificato | Cat# 101101; RRID:AB_312774 | ||
| Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
| Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
| Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-mouse CD16.2 (Fcγ RIV) (Clone 9E9)-Biolegend Purificato | Cat# 149502; RRID:AB_2565302 | ||
| Anti-Topo CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purificato | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
| Anti-topo CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Biolegend Purificato | Gatto# 142402; RRID:AB_10916523 | ||
| Anti-topo CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purificato | Biolegend | Cat# 149302; RRID:AB_2565277 | |
| Anti-topo CD183 (Clone CXCR3-173)-Biolegend Purificato | Gatto# 126502; RRID:AB_1027635 | ||
| Anti-topo CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
| Anti-topo CD34 (Clone MEC14.7)-Biolegend Purificato | Gatto# 119302; RRID:AB_345280 | ||
| Anti-topo CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
| Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar | Ready ThermoFisher | Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481 | |
| Anti-topo CD71 (Clone RI7217)-Biolegend Purificato | Gatto# 113802; RRID:AB_313563 | ||
| Anti-topo CD90 (Clone G7)-Biolegend Purificato | Gatto# 105202; RRID:AB_313169 | ||
| Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
| Anti-mouse Fcε RI&alfa; (Clone MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
| Anti-topo GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purificato | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
| Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
| Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purificato | BD Biosciences | Cat# 556003; RRID:AB_396287 | |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purificato | abcam | Cat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
| Anti-topo Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID:AB_2563784 | |
| Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho | Fluidigm | Cat# 3165018B | |
| Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purificato | BD Biosciences | Cat# 552125; RRID:AB_394340 | |
| Anti-Topo TCRβ (Clone H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Clone H57-597)-143Nd | |
| Anti-mouse TER-119/Cellule eritroidi (Clone TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241; RRID:AB_2563789 | |
| Sostanze chimiche, peptidi e proteine ricombinanti | |||
| Antibody Stabilizer | CANDOR Bioscience Cat | # 130050 | |
| Albumina sierica bovina | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatino-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1x tampone | di lisi RBCThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / Set di tamponi per colorazione del fattore di trascrizione | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ Perle di calibrazione a quattro elementi | Fluidigm | Cat# 201078 | |
| Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| Siero fetale bovino | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato HyClone | GE Lifesciences Cat | #SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| MAXPAR Kit di marcatura degli anticorpi | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| Paraformaldeide | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| Sodio azide | Sigma-Aldrich | Gatto# S2002 | |
| Tritone X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
| Tripsina EDTA 1x | Corning | Cat# 25-053-Cl | |
| Modello sperimentale: Organismo/Ceppi | |||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | Codice prodotto: 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| Normalizzatore a base di perline | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten e Hinton, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
Riferimenti
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26....
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Ristampe e permessi
