Presentiamo un protocollo per studiare la regolazione della traduzione di mRNA nelle cellule infettate da Poxvirus usando il saggio reporter di luciferasi basato sull'RNA trascritto in vitro. Il saggio può essere utilizzato per studiare la regolazione della traduzione da parte di CIS-elementi di un mRNA, tra cui 5'-non tradotto regione (UTR) e 3'-UTR. Diverse modalità di avvio della traduzione possono anche essere esaminate utilizzando questo metodo.
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Articolo metodologico
Saggio reporter di luciferase basato su RNA trascritto in vitro per il regolamento di traduzione dello studio nelle cellule infettate da Poxvirus
In questo articolo
Sommario
Abstract
Ogni poxvirus mRNA trascritta dopo la replicazione virale del DNA ha un leader di 5' poli (A) evolutivamente conservato, non-templato nel 5'-UTR. Per dissezionare il ruolo di 5'-poli (a) leader nella traduzione di mRNA durante l'infezione da Poxvirus abbiamo sviluppato un saggio reporter luciferasi basato su RNA trascritto in vitro. Questo saggio reporter comprende quattro fasi principali: (1) PCR per amplificare il modello di DNA per la trascrizione in vitro; (2) trascrizione in vitro per generare mRNA utilizzando T7 RNA polimerasi; (3) trasfezione per introdurre mRNA trascritto in vitro in cellule; (4) rilevazione dell'attività di luciferasi come indicatore della traduzione. Il saggio reporter a base di RNA luciferasi descritto qui aggira i problemi della replicazione plasmide nelle cellule infettate da poxvirus e nella trascrizione criptica dal plasmide. Questo protocollo può essere utilizzato per determinare la regolazione della traduzione da parte di CIS-elements in un mRNA comprendente 5'-UTR e 3'-UTR in sistemi diversi dalle cellule infettate da Poxvirus. Inoltre, è possibile studiare diverse modalità di iniziazione alla traduzione come il CAP-dipendente, il CAP-Independent, la riiniziazione e l'iniziazione interna utilizzando questo metodo.
Introduzione
Secondo il dogma centrale, le informazioni genetiche fluiscono dal DNA all'RNA e poi infine alla proteina1,2. Questo flusso di informazioni genetiche è altamente regolamentato a molti livelli, tra cui la traduzione di mRNA3,4. Lo sviluppo di saggi reporter per misurare la regolazione dell'espressione genica faciliterà la comprensione dei meccanismi normativi coinvolti in questo processo. Qui descriviamo un protocollo per studiare la traduzione di mRNA utilizzando un saggio reporter di luciferasi basato su RNA trascritto in vitro in cellule affette da P....
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Protocollo
1. preparazione del DNA template per PCR per trascrizione in vitro
- Per preparare il modello di DNA da PCR, primer di progettazione. Quando si progetta primer considerare caratteristiche cruciali come lunghezza del primer, temperatura di ricottura (Tm), contenuto di GC, 3' fine con G o C ecc.
Nota: Discusso in dettaglio in questa letteratura25,26,27. - I primer di progettazione per generare la PCR amplicon contenente i seguenti elementi in 5' a 3' direzione: T7-promoter, poli (A) leader, lucciola luciferasi ORF ....
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Risultati
I quattro passaggi del saggio reporter di luciferasi basato su RNA trascritto in vitro: PCR per generare il modello di DNA per la trascrizione in vitro, la trascrizione in vitro per generare mRNA, la trasfezione di mRNA e la misurazione della luciferasi, possono essere osservate nel diagramma schematico ( Figura 1). La progettazione di primer per entrambi i modelli di DNA (Fluc e Rluc) e lo schema generale di estensione di sbalzo PCR è illustrata nello schema.......
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Discussione
Tutti i passaggi a quattro core sono fondamentali per il successo del saggio reporter di luciferasi basato su RNA trascritto in vitro. Particolare attenzione deve essere prestata alla progettazione del primer, in particolare per la sequenza di promoter T7. T7 RNA polimerasi inizia la trascrizione dal primo G sottolineato (ggg-5'-UTR-Aug-) in T7 promoter aggiunto prima della sequenza 5'-UTR. Sebbene il sito iniziale di trascrizione (TSS) inizi dal primo G all'estremità 5', diminuendo il numero di G inferiore a tre .......
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Dichiarazioni
Gli autori vorrebbero dichiarare nessun interesse finanziario concorrente.
Ringraziamenti
Il progetto è stato finanziato dagli istituti nazionali di sanità (AI128406 www.nih.gov) a ZY e in parte dal Johnson Cancer Research Center (http://cancer.k-state.edu) sotto forma di Graduate Student Summer stipend alla PD.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | polimerasi ad alta fedeltà utilizzata in PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti reverse Cap analog o ARCA |
| Corning 96 pozzetti Micropiastra in polistirene a fondo piatto bianca a mezza area | Corning | 3693 | Piastra bianca a 96 pozzetti a parete opaca con fondo solido |
| Sistema di analisi reporter a doppia luciferasi | Promega | E1960 | Kit di analisi a doppia luciferasi (DLAK) |
| Kit puro per ciclo E.Z.N.A. Kit | purificazione PCR | OMEGA BIO-TEK | D6492 |
| Luminometro per micropiastre GloMax Navigator | Promega | GM2010 | Indicato come luminometro lettore di piastre multimodale |
| HiScribe T7 Kit di sintesi rapida dell'RNA ad alto rendimento | New England Biolabs | E2050S | In Kit di trascrizione in vitro |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Reagente cationico per la trasfezione dei lipidi |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Utilizzato per misurare la concentrazione di DNA e RNA |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Terreni di sieroplastica ridotti |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | Kit di purificazione dell'RNA |
| Sistema di tappatura per vaccinia | di tappatura | New England Biolabs | M2080 |
Riferimenti
- Crick, F. H. On protein synthesis. Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).
- Crick, F. Central Dogma of Molecular Biology. Nature. 227, 561-563 (1970).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G.
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Ristampe e permessi
