Un modello di coniglio di malattia dell'occhio secco acquosa-decisa indotta da Concanavalin Un'iniezione nelle ghiandole lacrimali: applicazione agli studi sull'efficacia dei farmaci

Summary

Questo articolo descrive lo sviluppo di un metodo per indurre la malattia dell'occhio secco acuta o cronica nei conigli iniettando il concavenavalin A a tutte le porzioni del sistema di ghiandola lacrimale orbitale. Questo metodo, superiore a quelli già segnalati, genera un modello riproducibile e stabile di occhio secco adatto allo studio degli agenti farmacologici.

Abstract

La malattia dell'occhio secco (DED), una malattia infiammatoria multifattoriale della superficie oculare, colpisce 1 essere umano su 6 in tutto il mondo con implicazioni impressionanti per la qualità della vita e i costi sanitari. La mancanza di modelli animali informativi che ricapitolano le sue caratteristiche chiave ostacola la ricerca di nuovi agenti terapeutici per il DED. I modelli animali DED disponibili hanno una riproducibilità e un'efficacia limitate. Qui viene presentato un modello in cui il DED viene indotto iniettando il concanavalin mitogenA (Con A) nelle ghiandole lacrimali orbitali dei conigli. Gli aspetti innovativi di questo modello sono l'uso di indicazioni a ultrasuoni (US) per garantire un'iniezione ottimale e riproducibile della Con A nella ghiandola lacrimale inferiore; iniezione di Con A in tutte le ghiandole lacrimali orbitali che limitala produzione compensativa delle lacrime; e l'uso di iniezioni periodiche di ripetizione di Con A che prolungano lo stato di DED a volontà. DED e la sua risposta agli agenti di prova sono monitorati con un pannello di parametri che valutano la produzione di strappi, la stabilità della pellicola lacrimale e lo stato della mucosa corneale e congiuntivale. Includono osmolarità lacrimale, tempo di rottura della lacrima, test di strappo di Schirmer, colorazione bengala rosa, e livelli di lactorina lacrimale. L'induzione del DED e il monitoraggio dei suoi parametri sono descritti in dettaglio. Questo modello è semplice, robusto, riproducibile e informativo. Questo modello animale è adatto per lo studio della fisiologia lacrimale e della fisiopatologia del DED, nonché per la valutazione dell'efficacia e della sicurezza degli agenti candidati per il trattamento del DED.

Introduction

La malattia dell'occhio secco (DED) è una condizione cronica con elevata prevalenza e morbilità^1,2,3,4. L'infiammazione svolge un ruolo chiave nella sua patogenesi^5,6. La fisiofisiologia del DED è concettualizzata come derivante dalla sottoproduzione o dall'eccessiva evaporazione delle lacrime; il primo è anche conosciuto come Aqueous-carente DED⁷. La sindrome di Sjàgren, una causa prototipodica di DED, ampiamente studiata, colpisce principalmente le ghiandole lacrimali (LG) ed è un esempio lampante della loro importanza nella patogenesi del DED. Il DED è spesso trattato con lacrime artificiali che forniscono sollievo temporaneo, o con ciclosporina o lifitegrast, entrambi i quali sopprimono l'infiammazione oculare. Nessuno dei trattamenti disponibili per il DED è ottimale, rendendo necessario lo sviluppo di nuovi agenti^8,9.

La ricerca di nuovi agenti terapeutici per il DED è ostacolata da tre grandi sfide: la mancanza di un bersaglio molecolare farmaco dedrugabile riconosciuto, che può essere sfuggente data la complessità patologica del DED; la svanitità di agenti promettenti; e la mancanza di modelli animali che ricapitolano le caratteristiche chiave del DED.

Come per la maggior parte degli sforzi di sviluppo di farmaci, i modelli animali informativi del DED sono uno strumento investigativo cruciale, nonostante la dichiarazione assiomatica che nessun modello animale riassume completamente una malattia umana. I modelli di topo, ratto e coniglio di DED sono i più comunemente utilizzati mentre cani e primati sono usati raramente^10,11. La maggior parte degli oltre 12 modelli di coniglio DED segnalati fino ad oggi tentano di ridurre la produzione di strappi rimuovendo Gli LG o impedendo loro funzione^{12,13,14,15,16}. Tali approcci includono la resezione chirurgica dell'ILG; chiusura del condotto escretorio; e compromettendo la funzione LG per irradiazione o iniezione di uno dei seguenti: linfociti attivati, mitogeni, tossina botulinica, atropina o benzalklonium. Le principali limitazioni di questi metodi sono la loro incoerenza e la frequente soppressione parziale della produzione di strappi.

Concanavalin A (Con A), una lectin di origine vegetale, è un potente stimolatore di sottoinsiemi di cellule T ed è stato utilizzato in modelli sperimentali di epatite¹⁷ e DED¹⁸. Il modello originale basato su Con A è stato segnalato per offrire vantaggi significativi, tra cui la sua relativa semplicità; l'afflusso di cellule infiammatorie negli Ng, imitando malattie come quella di Sjogren; stimolazione delle citochine infiammatorie IL-1, IL-8 e TGF-1; funzione di strappo ridotta monitorata misurando la distanza della fluoresceina lacrimale e il tempo di rottura dello strappo (TBUT); e la reattività dei farmaci indicati per un corticosteroide antinfiammatorio.

Quando è stato applicato questo promettente metodo, oltre ai suoi vantaggi, sono state identificate limitazioni che hanno reso necessaria la sua revisione complessiva e drastici miglioramenti. Sono documentate tre carenze critiche del metodo. In primo luogo, il modello era acuto; il DED indotto si è abbassato dopo circa 1 settimana. In secondo luogo, la risposta degli animali era incoerente. Come dimostrato, nelle iniezioni trascutanee "cieche" all'Inferior LG (ILG), La Con A è stata consegnata solo casualmente alla ghiandola mirata. Uno studio dettagliato dell'anatomia dell'ILG ha rivelato che le sue dimensioni potrebbero variare fino a 4 volte¹⁹ facendo tali iniezioni "hit-or-miss" sforzi. Infine, anche quando l'ILG è stato iniettato, il Superiore LG (SLG) spesso compensato per il flusso di strappo ridotto, rendendo il modello problematico.

Queste limitazioni chiave sono state superate introducendo tre modifiche al metodo, generando un modello animale superiore di DED. In primo luogo, l'iniezione di Con A nell'ILG è stata eseguita sotto guida ad ultrasuoni (US), assicurando che La Con A entrasse nella ghiandola. Il successo dell'iniezione è stato confermato ottenendo un'immagine statunitense post-iniezione, come mostrato nella Figura 1. In secondo luogo, per rimuovere il contributo lacrimale compensativo del SLG, sia il palpebrale che le parti orbitali di questa ghiandola sono state iniettate con Con A. Infine, questo modello acuto di DED è stato convertito in uno cronico da ripetute iniezioni di Con A ogni 7-10 giorni. DED della durata di 2 mesi è facilmente raggiungibile in questi conigli. Il successo di questo approccio è stato ampiamente documentato¹⁹.

Come già accennato, un'importante applicazione dei modelli animali di DED è quella di determinare l'efficacia e la sicurezza degli agenti terapeutici candidati. L'utilità di questo modello è stata dimostrata dallo studio del fosforopiccolo (OXT-328), una nuova piccola molecola antinfiammatoria^20,21 somministrata come colliri. La sua efficacia è stata dimostrata sulla base di un pannello di parametri di DED¹⁹. La relativa semplicità e la natura informativa di questo modello ha anche permesso di confrontare fianco a fianco il fosforinininine con i due farmaci approvati dalla FDA per DED, ciclosporina e lifitegrast, dimostrando la sua forte superiorità preclinica.

Protocol

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Review Board della Stony Brook University e sono stati eseguiti in conformità con la dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visionaria.

1. Animali e alloggi

1. Acquisire conigli bianchi neozelandesi (N-W) del peso di 2-3 kg.
2. Casa i conigli in gabbia in gabbia e con temperatura rigorosa (65 x 5 gradi centigradi) e umidità (45 x 5%) Controllo. L'illuminazione dovrebbe avere un ciclo di 12 h on/off.
3. Fornire accesso illimitato all'acqua e al coniglio standard. Eliminare gli arricchimenti dietetici in quanto possono contenere vitamina A che colpisce l'occhio.
4. Acclimatare gli animali per almeno 2 settimane prima delle misure di base o dell'induzione dell'occhio secco.

2. Metodi di anestesia ed eutanasia

NOTA: Tutte le procedure richiedono sedazione lieve ad eccezione di iniezione Con A che richiede sedazione moderata.

1. Per la sedazione lieve, iniettare l'acepromazina (1 mg/kg) sottocutaneamente sulle spalle utilizzando un ago a 26 calibro. Endpoint per sedazione lieve: gli animali mantengono una posizione di testa rilassata con lobi dell'orecchio non più completamente in posizione verticale.
   NOTA: Se non viene raggiunto l'endpoint appropriato, può essere somministrata un'iniezione aggiuntiva di acepromazina. Gli animali devono sempre rimanere svegli, sensibili al contatto con i baffi e non mostrano mai un respiro rallentato.
2. Per la sedazione moderata, prima dare agli animali acepromazine come sopra. Una volta raggiunto il punto finale (vedere la nota precedente), dare isoflurane utilizzando una maschera antigas con flusso O₂ impostato a 1 L/min e consegna isoflurane impostato su 5% (Figura 2).
3. Somministrare isoflurane fino a quando il tono del corpo del coniglio è completamente rilassato e le orecchie sono completamente floppy.
   NOTA: Non devono verificarsi movimenti muscolari compensativi quando l'animale è acceso su un fianco; la respirazione rimane sempre spontanea.
4. Il recupero spontaneo si verifica entro 2-5 min: i segni includono movimenti spontanei della testa e tono muscolare aumentato o normale. Dopo che la procedura sperimentale è completata con sedazione moderata, osservare i conigli per circa 30 min o fino a quando il loro comportamento ritorna alla normalità.
   NOTA: L'unguento oftalmico non è richiesto durante nessuna delle due forme di sedazione. 1) Nella sedazione lieve, gli animali sono ancora vigili e mantengono un riflesso lampeggiante. Nella sedazione moderata, l'inibizione del riflesso del battito è così breve che la superficie oculare non è a rischio. 2) Posizionamento dell'unguento oftalmico sulla superficie oculare preclude la visualizzazione delle strutture valutate durante i test.
5. Eutanasia: Utilizzare un sovradosaggio di pentobarbital endovenoso (100 mg/kg).

3. Rimozione della membrana nictitante

1. Eseguire la rimozione durante il periodo di acclimatazione (di solito la prima settimana) per consentire una valutazione completa e accurata della cornea.
2. Iniezione alla giusta membrana di nictitante
   NOTA: Se la membrana nictitante di entrambi gli occhi deve essere rimossa, è più semplice farlo in una sessione. Iniziare con un occhio e procedere come descritto. Per chiarezza di descrizione, questo metodo inizia con l'occhio destro.
   1. Mettere il coniglio in un sacchetto di contenimento di dimensioni adeguate.
   2. Indurre sedazione lieve come descritto al punto 2.1.
   3. Applicare 25 l di lidocaina senza conservanti all'occhio destro utilizzando una micropipetta.
   4. Posizionare uno speculum del coperchio del filo flessibile tra le palpebre.
   5. Utilizzando 0,3 pinze (o equivalente), afferrare la membrana nictitante al suo apice ed estenderla sulla cornea.
   6. Iniettare lidocaina 1% con 1:100,000 epinefrina subcongiuntamente nella base della membrana nictitante utilizzando un ago affilato 26 (Figura 3A). Un bleb moderato dovrebbe formarsi sopra la membrana nictitante.
   7. Rimuovere lo speculum.
3. Eseguire un'iniezione identica alla membrana nictitante sinistra.
4. Taglio della membrana di nictitante
   1. Dopo circa 5 min, posizionare lo speculum del coperchio nell'occhio destro. Afferrare e ritrarre la membrana nictitante al suo apice utilizzando 0,3 pinze (o simili).
   2. Tagliare la membrana nictitante alla sua base utilizzando forbici Westcott o equivalente (Figura 3B).
      NOTA: Il sanguinamento è minimo e in genere non richiede cauterio. Tuttavia, un cautery della batteria ad alta temperatura è sempre tenuto nelle vicinanze nel caso in cui sia necessaria un'ulteriore emostasi.
   3. Rimuovere lo speculum.
   4. Posizionare unguento antibiotico topico sull'occhio (ad esempio, neomycina, polimyssina, bacbactracin e idrocortisone).
5. Lascia intatta la ghiandola di Harderian. La ghiandola di Harderian è talvolta visibile quando la membrana nictitante viene ritratta.
   NOTA: Se una grande massa bianca o l'elevazione dei tessuti è osservata nella regione subcongiunta leale nasale o superiore dopo la rimozione della membrana nictitante, la membrana è stata reseguita troppo vicino alla sua base permettendo alla ghiandola duramente di Harderian a prolasscione. Per evitare questo nelle procedure successive, lasciare più della membrana nictitante alla base.
6. Lasciare che la superficie oculare guarisca per almeno 1 settimana prima di fare ulteriori manipolazioni o vengono eseguiti i saggi di superficie oculare.

4. Misurazione dei parametri dell'occhio secco e raccolta di campioni lacrimali

NOTA: Misurare i parametri DED in base alle esigenze del protocollo di studio (ad esempio, alla linea di base e ai punti temporali specificati successivamente). Le misurazioni per il DED devono essere effettuate nel seguente ordine, con uno sforzo rigoroso per replicarle fedelmente ogni volta. Testare tutti gli animali all'incirca alla stessa ora del giorno (1 h) per ridurre al minimo le variazioni circadiane. Queste misurazioni di solito richiedono un team di due investigatori.

1. Mettere il coniglio in un sacchetto di contenimento. Indurre sedazione lieve.
2. Osmolarità lacrima²²
   1. Lampeggia manualmente le palpebre 5-10 volte per distribuire uniformemente lo strato di strappo sulla superficie oculare.
   2. Ritirare delicatamente il coperchio inferiore.
   3. Assaggia le lacrime con il TearLab Osmometer alla giunzione del palpebralo e del bulbar conjunctiva lungo la fornix inferiore, appena posteriore alla base della membrana nictitante troncata.
   4. Misurare l'osmolarità utilizzando il Test di osmolarità TearLab seguendo le istruzioni del produttore.
3. Tempo di rottura della lacrima (TBUT)
   1. Scurire la stanza per questo saggio.
   2. Posizionare uno speculum del coperchio di filo tra le palpebre.
   3. Applicare una goccia di 50 -L dello 0,2% di fluoresceina sulla superficie corneale utilizzando una micropipetta. Se anche la distribuzione della fluoresceina sulla cornea non si ottiene con la prima goccia, posizionare una seconda goccia.
   4. Avviare immediatamente un timer.
   5. Osservare la pellicola lacrimale pre-cornea sotto una luce blu. Il TBUT è definito come il tempo necessario per sviluppare punti neri, linee o evidente interruzione dellapellicolafluoresceina ( Figura 4 ). Se necessario, utilizzare le supupe chirurgiche che forniscono l'ingrandimento di 1,50 dollari per visualizzare meglio i primi segni di rottura. Monitorare fino a 1 min; se la rottura come definito qui si verifica dopo 1 min, registrare TBUT per solo 60 s.
4. Test di strappo di Schirmer (STT)
   1. Applicare sulla superficie oculare una goccia di lidocaina priva di conservanti di 25 l.
   2. Posizionare una lancia chirurgica a cellule Weck nella fornix inferiore per assorbire la lidocaina residua e qualsiasi fluido lacrimale. Se necessario, utilizzare la palpebra inferiore per coprire l'estremità prossimale della spugna per mantenerla in posizione (Figura 5A).
   3. Dopo circa 30 s, rimuovere la spugna Weck.
   4. Inserire immediatamente una striscia di prova di Schirmer nello spazio tra la cornea e la conjunctiva palpebrale nel punto medio del coperchio inferiore.
   5. Avviare immediatamente un timer (Figura 5B).
   6. Dopo 5 min, misurare la lunghezza della porzione inumidita della striscia; questo è il valore STT.
   7. Eseguire misure in triplicare e riportare la media delle 3 letture come valore STT.
5. Raccolta di campioni lacrimali
   1. Per raccogliere campioni lacrimali per la ricerca di vari analiti in essi, come la lattoferrina, dopo che il valore STT è registrato a 5 min, lasciare la striscia in posizione fino a quando non si ottiene la bagnatura di almeno 20 mm.
      NOTA: Se non si verifica un'adeguata bagnatura dopo l'indotta dal DED, far avanzare la striscia più in profondità nella fornix inferiore per raggiungere questo endpoint in tempi ragionevoli.
   2. Tagliare la striscia inumidita e metterla immediatamente in 490 -L di buffer di raccolta lacrima raffreddata (4% BSA, 1M NaCl, 0.1% Tween-20 in PBS con cocktail inibitore della proteinasi).
   3. Conservare i campioni sul ghiaccio fino a quando non possono essere conservati a -80 gradi centigradi, dove devono rimanere fino a quando non vengono rinvilati.
6. Rose Bengala Coloring (RBS)
   1. Applicare alla cornea una lidocaina senza conservanti di 50 -L dell'1%.
   2. Dopo 30 s, mettere 25 - L di 1% rosa bengalese sulla superficie oculare e manualmente lampeggiare la palpebra per distribuirlo in modo uniforme.
   3. Avviare immediatamente un timer.
   4. A 3,5 min, posizionare uno speculum del coperchio di filo tra i coperchi.
   5. A 4,0 min, fotografare la superficie congiuntivale e corneale superiore (Figura 6).
      NOTA: Regolare il tipo di fotocamera in uso. Impostazioni tipiche: fotocamera reflex digitale a lente singola, modalità di priorità dell'apertura (apertura 13 o superiore), obiettivo macro ISO 6000, 100 mm collegato con due tubi di estensione da 12,5 mm, modalità di messa a fuoco manuale, lente al massimo ingrandimento e illuminazione dal flash macro/anello impostato alla modalità automatica attraverso l'obiettivo. La lampada di messa a fuoco del flash dell'anello è accesa per aiutare la messa a fuoco sulla cornea.
   6. Completa tutte le foto per entrambi gli occhi entro 1 min.
7. Punteggio oculare della superficie utilizzando il metodo NEI²³ modificato comesegue. Non classificare 6 zone congiuntivali separate. Segna la conjunctiva superiore di ogni occhio. Questa è la porzione della superficie congiuntivale facilmente fotografata senza manipolare il globo. La manipolazione potrebbe cambiare artefatto la colorazione della superficie oculare.
8. I livelli di lattoferina lacrimale sono una misura surrogata della produzione di strappi dalle ghiandole lacrimali. Saggio lattorina lacrima in lacrime raccolte come sopra utilizzando un kit di acumento di adottivo²⁴ legato agli enzimi seguendo le istruzioni del produttore.

5. Induzione e trattamento dell'occhio secco

NOTA: vengono iniettate tre porzioni del sistema orbitale della ghiandola lacrimale.

1. Sedare i conigli con acepromazine 0,2 mg/kg sottocutaneamente.
2. Shearfuori la pelliccia nella zona periorbitale e del cuoio capelluto e rimuovere completamente qualsiasi pelliccia residua utilizzando Nair. Lasciare la pelle completamente liscia per una migliore visualizzazione delle caratteristiche anatomiche e iniezione guidata dagli Stati Uniti di concanavalin A(Figura 7).
3. Indurre sedazione moderata come descritto sopra.
4. Iniezione della porzione palpebrale della ghiandola lacrimale superiore (PSLG)
   NOTA: Eseguire prima l'iniezione di PSLG.
   1. Applicare sull'occhio appropriato 25 - L di lidocaina senza conservanti 1% con una micropipetta.
   2. Evert la palpebra superiore e applicare una leggera pressione mediale al bordo orbitale posteriore fino a quando non viene vista la protuberanza che segna la porzione palpebrale della ghiandola. Il PSLG appare come una piccola elevazione bulbosa nella porzione posteriore (temporale) del coperchio superiore.
      NOTA: Per visualizzare il tessuto della ghiandola durante il processo di apprendimento, applicare il 5% di fluorescenza sull'area (Figura 8A). Le lacrime possono essere viste in streaming dal PSLG bulboso. L'applicazione della fluoresceina non è necessaria per la somministrazione di Con A; è fatto solo a scopo illustrativo per mostrare il tessuto della ghiandola.
   3. Utilizzando pinze dai denti fini e un ago a 27 calibro su una siringa di tubercolina, penetrano direttamente nella ghiandola utilizzando un approccio transcongiuntivo. Avanzare l'ago di 2 mm nel tessuto e iniettare 500 g di Con A in un volume di 0,1 mL (Figura 8B).
      NOTA: Questa iniezione a volte può essere dolorosa. Se necessario, tenere gli animali sotto i moflurane fino al completamento dell'iniezione.
5. Iniezione della ghiandola lacrimale superiore orbitale (OSLG)
   NOTA: OSLG segue in rapida successione.
   1. Applicare la pressione mediale al globo causando l'OSLG a sporgere dall'incisure posteriore (vedi ref²⁵ per l'anatomia, se necessario). Applicare la pressione mediale al globo (Figura 9, freccia rossa) con la protuberanza dell'OSLG dall'incisure posteriore. La protuberanza serve come localizzazione lorda per trovare l'incisure posteriore.
   2. Utilizzare pinze curve con punte chiuse per far rientrare l'area fino a quando non si avverte l'apertura ossea nel cranio. Questo sarà simile a una slit-like con una direzione anteriore / posteriore sotto la protuberanza.
   3. Applicare una pressione modesta con pinze per lasciare un rientro nella pelle, che servirà come punto di riferimento per il posizionamento dell'ago (Figura 10A).
   4. Inserire un ago (siringa di tubercolina con un ago da 27 calibro, ago da 5/8 pollici) perpendicolare alla pelle sopra il segno di rientro (Figura 10B) - 1/4 di pollice nell'incisure, quindi reindirizzare l'ago posteriormente ed esternamente verso il canto laterale puntando verso il punto medio tra il sito di iniezione e il bordo orbitale osseo.
      NOTA: Se l'incisure non è mirato con precisione con l'ago, il cranio blocca il suo avanzamento.
   5. Una volta raggiunto il mozzo dell'ago, iniettare lentamente 1000 g di Con A in un volume di 0,2 mL (Figura 10C).
6. Completare l'iniezione sia del PSLG che dell'OSLG entro 2-3 min.
7. Rimuovere l'animale dalla sedazione isoflurane (se non ancora fatto). L'iniezione della ghiandola lacrimale inferiore (ILG) di solito può essere completata senza ulteriore sedazione.
8. Iniezione della ghiandola lacrimale inferiore
   1. Guarda l'animale di lato. La prominenza dell'ILG può essere vista lungo la parte anteriore inferiore dell'orbita (Figura 11A).
   2. Disegnare una linea verticale utilizzando una penna di marcatura chirurgica o un indicatore permanente adatto sulla pelle dove la parte superficiale della ghiandola ILG passa dal suo posto superficiale (più esterno) sull'osso zigomatico alla sua posizione più mediale nell'orbita. Questo è in genere inferiore al limbo anteriore (Figura 11A).
   3. Identificare la fine dell'osso zigomatico spazzando la sonda statunitense tenuta verticalmente attraverso questa linea sulla pelle. La transizione ILG si verifica quando l'immagine della ghiandola cambia da chiaramente circoscritta (linea iperecoica dell'osso zigomatico si vede lungo il bordo inferiore della ghiandola nell'immagine) a uno senza un bordo mediale riconoscibile (l'eco ossea zigomatica non è più presente, Figura 1).
   4. Osservare la posizione relativa del pezzo a mano rispetto alla linea disegnata sulla pelle quando lo schermo degli Stati Uniti mostra questo cambiamento. Questo è il "sito di iniezione" dove Deve essere somministrato Con A.
   5. Controllare la profondità dell'iniezione in modo da posizionare Con A nella ghiandola in un punto appena mediale all'osso dell'arco zigomatico.
   6. Determinare la profondità di iniezione come segue: Impostare la profondità desiderata di iniezione come profondità dell'osso zigomatico (segnale iperecoico) più 1 mm. Sottrarre questo valore dalla lunghezza nota dell'ago (15 mm in questo esempio).
   7. Inserire l'ago nella ghiandola presso il "sito di iniezione" 12 mm, quindi ritirarlo lentamente fino a quando la lunghezza dell'ago esposto al di fuori del corpo (misurata con pinze chirurgiche) è uguale alla differenza calcolata in 5.8.6 (Figura 12). Iniettare 1000 g di Con A in 0,2 mL.
      NOTA: Per garantire che la capsula della ghiandola sia forata e non semplicemente spinta dall'ago, l'ago deve essere inserito da 12 mm o quasi al mozzo prima dell'inizio del suo ritiro.
   8. Ripetere gli Stati Uniti per confermare l'esito positivo dell'iniezione. Il ILG dovrebbe mostrare uno spazio ipoechoico caratteristico (Figura 1).
      NOTA: L'iniezione di ILG è quella meglio tollerata dagli animali²⁶ ed è quindi eseguita per ultima.
9. Completare l'intera procedura per iniettare tutte le ghiandole di entrambi gli occhi entro 10 min. Ciò richiederà il raggiungimento della competenza nella procedura.
   NOTA: Un singolo set di iniezioni nelle 2 ghiandole lacrimali orbitali indurrà DED acuto della durata di 1-2 settimane.
10. Per il DED di durata più lunga, iniettare Con A esattamente come sopra ogni 7 giorni. Fino a 6 tali iniezioni sono state eseguite con successo.

6. Assistenza post-procedura

1. Dopo l'iniezione di Con A, monitorare gli animali nei loro sacchetti di contenimento per almeno 10-20 min, o fino a quando l'effetto anestetico è svanito.
2. Non lasciare gli animali incustoditi fino a quando non hanno riacquistato sufficiente conoscenza per mantenere la recumbency severa. Non riportarli alle loro gabbie individuali fino a quando non sono completamente recuperati.
3. Il dolore post-procedura è di solito lieve e dura meno di 48 h. Valutare il dolore con la scala di smorfia del coniglio. Se necessario, dare una singola dose di chetorolac sottocutaneo (5 mg/kg). Per dolori più gravi, dare buprenorfine sottocutanea 0,1 mg/kg ogni 8 h.

Results

Le iniezioni di A hanno indotto una forte risposta infiammatoria nelle ghiandole lacrimali caratterizzata da un denso infiltrato linfocitico (Figura 13), accompagnato da una diminuzione della produzione di strappi. Tutti i parametri di strappo sono stati notevolmente modificati(tabella 1 e tabella 2). Inoltre, i livelli di lactoferina lacrimale sono stati soppressi (controllo 3,1-0,45 contro La Proteina Con iniettata è 2,7-0,02 ng/mg (media - SEM); p<0,03). Il risultato finale fu un epitelio corneale e congiuntivale compromesso, evidenziato da una maggiore colorazione bengala di rosa (Figura 6).

L'iniezione dei tre tessuti Orbitali LG ha prodotto uno stato DED coerente e uniforme a differenza degli stati ottenuti con i metodi precedenti^18,27. I principali contributori a questo risultato sono stati l'iniezione guidata dagli Stati Uniti dell'ILG e l'iniezione dell'OSLG. Nella tabella 1 sono riepilogati i risultati salienti di questo metodo. Tutte le modifiche sono coerenti con il DED grave.

Un singolo set di iniezioni Con A produce DED della durata di circa 1 settimana; tutti i parametri clinici si normalizzano entro il giorno 10(tabella 2). Sequenziali Con A iniezioni di circa 1 settimana di distanza estendere la durata del DED di conseguenza. Per esempio, il secondo set di iniezioni Con A il giorno 7 mantiene DED per 2 settimane e così via. Dopo circa 5 serie di iniezioni, lo stato DED diventa spesso permanente senza la necessità di ulteriori iniezioni.

Quando i conigli con DED indotto da Con A sono stati trattati con il nuovo agente fossforsulindac, ha soppresso notevolmente la malattia. Ad esempio, dopo una settimana di trattamento con questo agente TBUT è aumentato notevolmente rispetto agli animali trattati con veicoli (43,6 ,4,0 contro. 12,2-2,8 s; p<0.001; media - SEM rispettivamente, per questi e successivi valori) mentre l'osmolarità strappo è stata normalizzata (294-4,6 contro 311-2,0 mOsm/L, p<0.002). Meccanicamente, il fosfosulindac ha diminuito i livelli di due interleucelli cruciali, IL-1, (8,4 x 1,2 vs 21,2-6,6 proteine pg/mg; p<0.03) e IL-8 (4,9-1,7 contro 13,5,5,0 proteine pg/mg; p<0.05)¹⁹.

Figura 1: Immagine ad ultrasuoni della ghiandola lacrimale inferiore. Pannello superiore: L'ILG mentre si muove più in profondità in orbita per giacere sotto l'arco zigomatico. La linea tratteggiata rappresenta la linea sulla pelle attraverso la quale viene spazzata la sonda statunitense. Pannelli centrali: Mentre il pezzo di mano viene spazzato attraverso questa linea, l'esaminatore cerca la perdita dell'eco ossea zigomatica presente nell'immagine a sinistra (freccia) e scompare a destra. Pannelli inferiori: Immagini dell'ILG scattate prima (a sinistra) e dopo(a destra) iniezione di Con A. Sviluppo di un grande spazio cistico all'interno della ghiandola conferma la corretta consegna. Ristampato con permesso¹⁹. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Sedazione maschera antigas. Questa fotografia mostra la maschera antigas che fornisce una breve sedazione moderata con isoflurane. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Rimozione della membrana nictitante. (A) Iniezione di lidocaina/epinefrina. (B) Troncamento della membrana nictitante alla sua base con forbici Westcott. (C) La superficie oculare visualizzata più facilmente dopo la rimozione della membrana nictitante. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Misurazione del tempo di rottura della strappo. (A) Aspetto uniforme della pellicola a strappo verde della superficie corneale sotto la luce blu immediatamente successiva all'applicazione di gocce di fluoresceina. (B) Superficie corneale che ha già subito una marcata rottura evidenziata da più occhiaie e striature lineari nella fluoresceina. Il tempo di rottura viene registrato non appena si sviluppa la prima macchia o linea scura. I due cerchi azzurri sono riflessi della sorgente luminosa fuori della cornea. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Test lacrimogeni di Schirmer. (A) Il corretto posizionamento della spugna Weck-Cel nella fornix inferiore per rimuovere qualsiasi soluzione lidocaina topica residua e lacrime di base. Posizionando il bordo posteriore della spugna triangolare sotto il margine inferiore del coperchio, si può mantenere una tecnica molto uniforme per asciugare la superficie oculare prima del posizionamento delle strisce di strappo. (B) Una striscia di strappo opportunamente posizionata nella posizione centrale del coperchio inferiore tra il globo e il coperchio inferiore (palpebral conjunctiva). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Colorazione bengala Rosa. Superiore: Fotografie della superficie corneale. Sinistra: Non è presente alcuna colorazione bengala di rosa prima del trattamento con la Con A. A destra: la colorazione corneale e congiuntivale diffusa è osservata nel quadrante nasale superiore dopo l'iniezione (in alto a destra). Inferiore: Cattuale cattualelogo congiunzione delle impressioni della congiunzione congiunzione. Sinistra: Numerose cellule di calice sono presenti prima del trattamento. A destra: le cellule epiteliali sono presenti, ma le cellule di calice sono assenti dopo il trattamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Preparazione del coniglio per il concanavalin iniezioni A. (A) Piccole cesoie sono utilizzate per rimuovere la pelliccia, consentendo una più facile visualizzazione dei punti di riferimento per identificare la ghiandola lacrimale superiore orbitale. (B) Nair viene utilizzato per rimuovere i capelli che rimangono dopo la tosatura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Iniezione della ghiandola lacrimale palpebrale. (A) La ghiandola lacrimale palpebrale, che appare come un'elevazione bulbosa nella porzione temporale posteriore del coperchio superiore. Le lacrime vengono osservate scorrere dalla superficie di questa ghiandola dopo l'applicazione di una goccia di 2% fluoresceina. (B) La ghiandola lacrimale palpebrale viene iniettata mentre il coniglio riceve una sedazione moderata. Un investigatore ritrae la palpebra, ottimizza l'esposizione della ghiandola e fissa la maschera mentre il secondo sperimentatore inietta la ghiandola. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Localizzazione della ghiandola lacrimale superiore orbitale. I cambiamenti nei contorni della pelle indicano la posizione dell'OSLG mentre sporge attraverso l'incisure posteriore. La pressione mediale alternata sul globo(grande freccia) provoca la prolasssione della ghiandola orbitale superiore, che è vista come una piccola elevazione nella pelle. Questa quota altimetrica aumenterà di dimensioni ogni volta che viene applicata la pressione (piccole frecce). La posizione di questa ghiandola è di solito in linea con il bordo orbitale posteriore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Iniezione della ghiandola lacrimale superiore orbitale. (A) Applicazione di una leggera pressione al cranio con pinze dai denti fini nell'area prolassato come nella Figura 9. Una sottile apertura a slit-like nel cranio può essere palpata. Lasciare un piccolo segno di rientro con le pinze aiuta notevolmente il posizionamento dell'ago durante l'iniezione. (B) L'ago viene inserito perpendicolarmente attraverso l'incisure. Se posizionato in modo errato, il suo passaggio viene fermato dal cranio osseo. (C) L'ago è in posizione finale inclinato verso il canto laterale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 11: Localizzazione della ghiandola lacrimale inferiore. (A) La prominenza della parte superficiale dell'ILG vista attraverso il coperchio inferiore. Il segno di penna curvilineale indica la posizione inferiore della ghiandola. La linea verticale, sotto il limbo nasale, indica la posizione approssimativa in cui l'ILG passa in una posizione più profonda all'interno dell'orbita e funge da riferimento visivo per gli Stati Uniti. (B) Us mano-pezzo spazzare attraverso l'area della linea verticale; il monitor statunitense mostrerà dove finisce l'osso zigomatico, dove l'ILG si transizioni e dove dovrebbe essere somministrata l'iniezione Di A ("sito di iniezione"). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 12: Iniezione della ghiandola lacrimale inferiore. L'iniezione dell'ILG viene effettuata nel luogo identificato dagli Stati Uniti. La profondità dell'iniezione viene calcolata come descritto nel testo (passaggio 5.8.6). Le pinze (viste dietro l'ago) assicurano che l'ago sia posizionato alla profondità corretta prima dell'iniezione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 13: Istologia delle ghiandole lacrimali. Sezioni tissutali di una normale ghiandola lacrimale inferiore con tipica struttura tubulo-alveolare (A) e successiva iniezione di Con A (B), mostrando un marcato infiltrato linfocitico con effatura della struttura. Infiltrati infiammatori simili sono osservati nelle ghiandole lacrimali superiori. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Metodo di iniezione	TMA, sec		Osmolalità lacrimale, Osm/L		STT, mm
	Linea	Post-iniezione	Linea	Post-iniezione	Linea	Post-iniezione
	media : SEM, variazione percentuale
ILG senza guida usa gli Stati Uniti	58,5 x 1,5	44,5 x 7,7	297 x 4,9	300 x 3,8	15,2 - 0,9	12,9 x 2,2
%modifica		-23%		1%		-15%
		P:0,05		0,36 USD		n. 0,21
Guida titolato dall'US - PSLG	59,4 x 0,6	11,4 x 4,2	296 x 4,7	326 x 3,7	15,1 - 1,3	10,7 - 1,8
Variazione percentuale		-81%		10%		-29%
		p<0.0001		p<0.0001		p<0,03
GUIDAti dall'Stati Uniti ILG - PSLG - OSLG	60 x 0,0	6,2 - 1,3	299 x 2,9	309 x 2,8	14,6 x 0,9	9,9 x 1,3
Variazione percentuale		-90%		3%		-32%
		p<0.0001		p<0.008		p<0.002
Tutti i valori sono stati misurati il giorno 6 dopo una singola iniezione di Con A nelle ghiandole elencate. Tutti i confronti sono stati effettuati con la linea di base. ILG, ghiandola lacrimale inferiore; PSLG, porzione palpebrale della ghiandola lacrimale superiore; OSLG, porzione orbitale della ghiandola lacrimale superiore; Stati Uniti, ultrasuoni.

Tabella 1: Effetto della tecnica di iniezione e del numero di siti di iniezione sulla gravità dell'occhio secco.

	Linea	Giorno 6	Giorno 13	Giorno 21
		1 iniezione	2 iniezioni	3 iniezioni
TMA, sec	58,5 x 1,5	44,5 x 7,7	29,2 e 7,8	12,8 - 3,9
Variazione percentuale		-24%	-50%	-78%
		0,17 USD	N.a. 0,001	p<0.0001
TOsmo, Osm/L	297 x 4,9	300 x 3,9	308 x 4,9	313 x 2,7
Variazione percentuale		1%	4%	5%
		0,36 USD	P:0,04	P.003
STT, mm	15,2 - 0,9	9.3 - 1,6	12,9 x 1,6	7.4 - 1,1
Variazione percentuale		-39%	-15%	-51%
		0,17 USD	n. 0,13	IMPOSSIBILe utilizzare il valore p.008
Sono stati effettuati confronti con la linea di base.

Tabella 2: Effetto delle ripetute iniezioni Di A in ILG sulla durata del DED.

Discussion

I conigli sono molto attraenti per lo studio del DED. La loro cornea e congiuntiva hanno una superficie più vicina a quella degli esseri umani rispetto a topi e ratti; il loro complemento di enzimi metabolizzanti farmacologici come le ereditiche, e l'elandologia delle loro ghiandole lacrimali sono simili a quelli degli esseri umani, e i loro occhi sono abbastanza grandi per studi farmacocinetici informativi. Rispetto ai maiali e alle scimmie, con cui condividono caratteristiche simili, costano meno e la loro manipolazione sperimentale è più facile. Se si contemplano studi meccanicistici, un relativo inconveniente del coniglio, rispetto ai topi, è che sono disponibili meno reagenti (ad esempio, anticorpi monoclonali). D'altra parte, il coniglio è di gran lunga superiore ai topi per gli studi farmacocinetici e di biodistribuzione perché i singoli tessuti sono facilmente sezionati e di dimensioni sufficienti per il lavoro analitico, evitando il "sample pooling".

Un parametro generale critico è il periodo di acclimatazione dei conigli. Gli animali vengono spediti dal venditore in condizioni che spesso non garantiscono un ambiente di trasporto della temperatura o dell'umidità appropriata. Alcuni animali potrebbero aver già sviluppato l'occhio secco all'arrivo. Si raccomanda un periodo di acclimatazione di due settimane. Altrettanto importante è l'attenzione scrupolosa all'umidità e alla temperatura dello spazio in cui i conigli studio sono alloggiati nel vivaio. Le deviazioni in entrambe le condizioni possono indurre enormi variazioni nel loro stato oculare. Avere umidificatori di back-up e deumidificatori a portata di mano. Se il sistema centrale si guasta, agire rapidamente per ripristinare l'umidità ambiente utilizzando l'apparecchiatura di backup. Tenete a mente che tali sviluppi sfortunati sono più comuni nei mesi estivi. I tre passaggi più critici, tuttavia, per indurre con successo il DED nei conigli sono: 1) l'uso abile dell'imaging statunitense per identificare l'ILG e dirigere e confermare l'iniezione di Con A; 2) garantire l'iniezione sia dell'ILG che delle due parti del SLG; e 3) in modo affidabile e riproducibile riassumendo i parametri del DED.

Lo sviluppo della competenza sperimentale richiesta non è banale, ma non dovrebbe scoraggiare alcun investigatore serio. Aspettatevi che la curva di apprendimento venga completata entro cinque iterazioni. Un sistema di imaging statunitense di qualità ragionevole è essenziale. Il riconoscimento dei segni anatomici da parte degli Stati Uniti è importante, quindi, l'investigatore dovrebbe rivedere l'anatomia del coniglio. L'eccellente descrizione dell'anatomia del coniglio di Davis²⁵, un classico, può essere immensamente utile. Anche tenere a mente la variazione delle dimensioni del ILG. Il corollario di questo è che il successo di Con A deve sempre essere confermato con l'imaging di follow-up. Variazioni nella risposta al Con A in un gruppo di conigli è più spesso dovuto alla tecnica di iniezione (iniezione non riuscita o parzialmente riuscita) o a ignorare la capacità dei tessuti della ghiandola lacrimale residui per compensare con la sovrapproduzione di lacrime. Per coloro che desiderano padroneggiare la tecnica di iniezione, l'iniezione di blu di metilene seguita da dissezione anatomica pronta può essere utile; la visualizzazione si ottiene se raggiunge la ghiandola lacrimale o si riversa sui tessuti vicini. Ad oggi, questo metodo di iniezione è stato eseguito più di 270 volte dagli autori senza una singola complicazione.

Sodire che i cinque parametri del DED presentati sopra possono essere difficili come è la loro determinazione nella pratica clinica. Anche se le variazioni circadiane non sono ancora state formalmente documentate in nessuno di essi, ci sono prove di base di tali fenomeni nell'occhio²⁸ che dovrebbero essere annotati nello stesso momento del giorno (1 h), specialmente quando i saggi ripetuti devono essere eseguiti e confrontati tra loro. La coerenza nell'esecuzione di questi saggi è essenziale. È necessaria una squadra di due persone. Quattro o più investigatori nella stessa stanza che partecipano ai saggi possono essere dirompenti, dato che alcuni passaggi richiedono tempi rigidi. È importante una documentazione fotografica adeguata e di alta qualità, ove indicata.

Questo modello è ideale per gli studi di sviluppo di farmaci. La padronanza del modello animale e le tecniche di saggia hanno garantito un'eccellente riproducibilità¹⁹ degli studi di efficacia e sicurezza.

Si tratta di un potente approccio sperimentale perché elimina la variabilità confusa dei modelli precedenti, ha semplificato il modello animale ed essenzialmente standardizzato analizzando i cinque parametri del DED. Il successo dell'applicazione di questo modello allo studio di un agente terapeutico candidato ha affermato la sua utilità pratica come modello animale informativo per una malattia che ha un disperato bisogno di nuovi agenti e di una comprensione più profonda della sua patogenesi.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Obiettivo macro 100 mm	Canon EF 100mm f/2.8L IS USM	3554B002
Aghi calibro 26 (5/8)	Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ	305115	Aghi per l'iniezione di ConA nelle ghiandole lacrimali Aghi
27 (5/8)	Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ	305921	Aghi per l'iniezione di ConA nelle ghiandole lacrimali
Aceproinj (acepromazina)	Henry Schein Animal Health, Dublino, OH	NDC11695-0079-8	0,1 ml/kg iniezione sottocutanea per sedazione del coniglio
Vaporizzatore per anestesia	VetEquip, Pleasanton, CA	Articolo #911103
Bishop Harmon Forcipe	Bausch e Lomb (Storz), Bridgewater, NJ	E1500-C	Pinze per tessuti
	Bausch e Lomb (Storz), Bridgewater, NJ	E-2404	Calibro utilizzato per misurare la lunghezza dell'ago durante l'iniezione di ConA
Concanavalin A Sigma	, St. Louis, MO	C2010	Produrre 5 mg/ml in PBS per l'iniezione nelle ghiandole lacrimali del coniglio
Fotocamera DSLR	Canon EOS 7D DSLR	3814B004	Fotocamera reflex digitale a obiettivo singolo
fluoresceina	AKRON, Lake Forest, IL	NDC17478-253	Diluire allo 0,2% con PBS per misurare l'isoflurano
	TBUTHenry Schein, Melville, NY	29405
Kit ELISA per lattoferrina	MyBiosource, San Diego, CA	MBS032049	Misurare il livello di lidocaina lacrimale
	Sigma, St. Louis, MO	L5647 1	% in PBS per l'agente anestesiologico
flash macro/anello	Canon Macro Ring Lite MR-14EXII	9389B002AA
Punte per osmolarità	TearLab Corp., San Diego, CA	#100003 REV R	Misura l'osmolarità lacrimale
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)	Mediatech, Inc. Manassas, VA	21-031-CV
Coniglio, Nuova Zelanda Bianco o Olandese Belted (come descritto nel testo)	Charles River Labs, Waltham, MA	2-3 kg	Animali da ricerca
Rose Bengal	Amcon Laboratories Inc., St. Louis, MO	NDC51801-004-40	1% in PBS, macchiare la superficie oculare
Schirmer strisce	Eaglevision, prodotti Katena. Denville, NJ	AX13613	Misurare la produzione
lacrime Lenti chirurgiche +1,50	Disegni per la visione, Boemia, NY	Articolo speciale	Fornire magnificantion della superficie oculare mentre si osserva la rottura lacrimale e si eseguono iniezioni di Concanavalin A.
Osmometro TearLab	TearLab Corp., San Diego, CA	Modello #200000W REV A Misura	dell'osmolarità lacrimale
Sonda ecografica	VisualSonics Toronto, Ont	MX 550 S	Guida non trasotografica Con A iniezione per ghiandola lacrimale inferiore