Mappatura dell'Emergente Organizzazione Spaziale delle Cellule Mammarie utilizzando Micropatterns e Quantitative Imaging

Summary

Il metodo qui presentato utilizza il micromodellamento insieme all’imaging quantitativo per rivelare l’organizzazione spaziale all’interno delle culture dei mammiferi. La tecnica è facile da stabilire in un laboratorio di biologia cellulare standard e offre un sistema trattabile per studiare patterning in vitro.

Abstract

Un obiettivo fondamentale in biologia è capire come emergono i modelli durante lo sviluppo. Diversi gruppi hanno dimostrato che la creazione di modelli può essere realizzata in vitro quando le cellule staminali sono spazialmente confinate su micromodelli, creando così modelli sperimentali che offrono opportunità uniche per identificare, in vitro, i principi fondamentali della Organizzazione.

Qui descriviamo la nostra implementazione della metodologia. Abbiamo adattato una tecnica di fotomodellamento per ridurre la necessità di attrezzature specializzate per rendere più facile stabilire il metodo in un laboratorio di biologia cellulare standard. Abbiamo anche sviluppato un framework di analisi delle immagini gratuito, open-source e facile da installare per misurare con precisione il posizionamento preferenziale delle sottopopolazioni di cellule all’interno di colonie di forme e dimensioni standard. Questo metodo permette di rivelare l’esistenza di eventi di patterning anche in popolazioni di cellule apparentemente disorganizzate. La tecnica fornisce informazioni quantitative e può essere utilizzata per disaccoppiare le influenze dell’ambiente (ad esempio, segnali fisici o segnali endogeni), su un determinato processo di modellazione.

Introduction

Nei sistemi dei mammiferi, il patterning è una proprietà emergente del comportamento collettivo delle cellule e quindi, i modelli possono formarsi in vitro se vengono forniti segnali appropriati alle celle^1,2,3^{,4, 5} Del numero 3( ^{, 6}. Un modo per rivelare la capacità intrinseca delle cellule di auto-organizzarsi in vitro è quello di costringere le cellule a formare gruppi/colonie di forme e dimensioni definite^7,8,9,10 . Una tecnica che consente questo è micropatterning¹¹. La micropatterning consente di definire con precisione la posizione in cui le molecole di matrice extracellulare (ECM) vengono depositate su una superficie. Questo, a sua volta determina dove le cellule possono aderire e quindi controlla come le cellule si organizzano spazialmente.

Il micropatterning è una tecnica con numerose applicazioni, ad esempio il micropatterning consente la standardizzazione delle condizioni iniziali prima della differenziazione¹². È importante sottolineare che il micropatterning consente di controllare facilmente le dimensioni, la forma e la spaziatura delle colonie cellulari e questa proprietà può essere utilizzata per elaborare esperimenti volti a interrogare la risposta collettiva delle cellule al morfogeno o ai segnali fisici^{7 , 8} (IN vio ^{, 10} del sistema ^{, 13} del sistema ^{, 14} Del sistema ^{, 15} Mi lasa del sistema ^{, 16 , 17}.

Sono stati sviluppati diversi metodi di micromodellazione¹¹. Le tecniche di fotomodellazione sono forse i metodi più semplici per stabilire¹⁸. Questi approcci hanno anche il vantaggio di precisione in quanto possono essere utilizzati per controllare la forma delle singole celle^18,19,20. Tuttavia, richiedono anche costose attrezzature specializzate, tra cui un rivestimento di spin, una camera al plasma e un detergente UVO (UV-Ozone) che generalmente non sono prontamente disponibili nei laboratori di biologia standard. Per facilitare l’adozione della tecnica, abbiamo adattato il protocollo per richiedere solo la lampada UVO. Iniziamo da vetrini di plastica disponibili in commercio che possono essere tagliati con forbici o con un foro per il formato desiderato.

Un’importante utilità dei micromodelli è la capacità di standardizzare le colonie al fine di confrontare le singole colonie tra più repliche. Questo permette di chiedere in che misura la formazione del modello all’interno di queste colonie è riproducibile, ed esplorare i fattori che influenzano la robustezza del processo di modellazione. È importante sottolineare che la quantificazione dei modelli “mediati” in più colonie standardizzate può anche rivelare processi di modellazione che altrimenti non sarebbero evidenti. Il vantaggio di essere in grado di quantificare il patterning sulle colonie standardizzate dipende dalla possibilità di misurare con precisione l’espressione proteica, idealmente a livello di singola cellula. Tuttavia, le cellule su micromodelli sono spesso strettamente imballate, rendendole difficili da segmentare con alta precisione. Le cellule spesso si organizzano in tre dimensioni anziché in due dimensioni e può essere difficile rilevare e conservare informazioni tridimensionali (3D) durante la segmentazione. Una volta che le celle sono state segmentate con successo, sono necessari metodi di calcolo per estrarre le informazioni di patterning dai set di dati risultanti.

Abbiamo sviluppato strumenti di segmentazione e analisi delle immagini per aiutare a superare questi problemi. Questo metodo di analisi utilizza solo software libero e open-source e non richiede la conoscenza della riga di comando o della programmazione per implementare. Per illustrare il metodo qui, usiamo cellule staminali embrionali di topo (mES) che esprimono spontaneamente un marcatore di brachiury di differenziazione precoce (Tbra)^21,22. Anche se nessuna disposizione spaziale apparente è visivamente rilevabile, il metodo consente la creazione di una mappa del posizionamento preferenziale delle cellule di T . Mostriamo anche che il patterning Tbra contrasta con l’assenza di una localizzazione preferenziale delle cellule che esprimono Id1, una lettura diretta del percorso della proteina morfogenetica ossea (BMP)²³. Discutiamo anche le attuali limitazioni del metodo e come questa tecnica può essere adattata ad altri sistemi sperimentali.

Protocol

NOTA: una panoramica del metodo è disponibile nella Figura 1.

1. Design della maschera

1. Progettare la maschera fotografica secondo le linee guida descritte in Azioune et al. Consultare la Tabella dei materiali per un riferimento al produttore del software e della maschera utilizzato per questo studio.
   NOTA: è possibile creare più geometrie, dimensioni o spaziatura tra le forme su una maschera. La lampada UV può contenere una fotomaschera da 15 cm che può contenere fino a 49 disegni diversi (presupponendo chip 2 cm x 2 cm).

2. Procedura di produzione di micropattern

1. Preparare i materiali necessari.
   1. Preparare una soluzione di 0,1% poloxamer 407 (10 mg per 10 mL) in salina tampone di fosfato (PBS) e lasciare su uno shaker a temperatura ambiente. Il poloxamer 407 richiederà circa 20 min per sciogliersi.
   2. Laici pellicole da laboratorio (vedi la Tabella deiMateriali) sul fondo di un piatto Petri di 10 cm quadrati. Questo sarà utilizzato come camera per la deposizione di matrice.
   3. Pulire la superficie della fotomaschera, prima con 100% acetone, poi con 100% isopropanolo e infine con ddH₂O. Se possibile, asciugare l’aria la fotomaschera o altrimenti asciugare la maschera con un tovagliolo di carta pulito.
   4. Preparare un pezzo di plastica quadrato, rigido e opaco con le stesse dimensioni della fotomaschera (in seguito indicato come ‘titolare’).
      NOTA: Questo verrà utilizzato per mantenere coperture in plasticaalips a contatto con la fotomaschera durante la fase di illuminazione.
   5. Accendere la lampada UVO ed eseguire un’illuminazione di riscaldamento per 10 min.
2. Crea chip fotomodellati.
   NOTA: È possibile adattare la procedura per creare chip di qualsiasi dimensione desiderata. Per semplicità, descriviamo qui la procedura per generare un chip micropattern rotondo da 12 mm.
   1. Utilizzando un punzone da 12 mm, tagliare i vetrini di plastica idrofobica per creare 12 mm di copricapi rotondi e metterli in una nuova parabola Petri pulita.
      AVVISO: Utilizzare i guanti in ogni momento per evitare il contatto della pelle con la superficie della plastica in quanto ciò potrebbe danneggiare il trattamento superficiale.
   2. Rimuovere con attenzione la pellicola protettiva dalle coperture con una pinzetta.
      NOTA: Evitare di danneggiare la superficie di plastica in quanto ciò potrebbe influenzare il posizionamento delle cellule sul chip durante la procedura di semina (sezione 3).
   3. Posizionare la fotomaschera su una superficie pulita e stabile (ad esempio, scatola fotomaschera), lato cromato rivolto verso l’alto e aggiungere una goccia di 2 ddH₂O nella posizione del disegno del chip desiderato.
   4. Posare un coperchio sulla goccia di ddH₂O e premere delicatamente.
      NOTA: Assicurarsi che il lato di plastica che si affaccia sulla fotomaschera sia il lato che è stato protetto dalla pellicola che è stata rimossa nel passaggio precedente.
   5. Posizionare il supporto sopra i vetrini di plastica e fissare con attenzione questo panino con morsetti al fine di mantenere i pezzi di plastica a contatto con la fotomaschera.
      NOTA: Posizionare i morsetti il più vicino possibile alla posizione dei vetrini di plastica per garantire che i vetrini di plastica siano perfettamente mantenuti a contatto con la superficie della fotomaschera.
   6. Posizionare l’assieme nella lampada UVO a circa 2 cm dalla sorgente luminosa e illuminare per 10 min.
      NOTA: La potenza della luce è stimata a 6 mW/cm² a 254 nm di lunghezza d’onda quando il chip è posizionato ad una distanza di 2 cm dalla sorgente.
   7. Tenere il panino con la fotomaschera nella parte inferiore e rimuovere con attenzione i morsetti mantenendo la pressione con una mano per evitare che i vetrini si muovano durante lo smontaggio del panino. Rimuovere il supporto, assicurandosi che tutti i pezzi di plastica siano ancora sulla maschera e non attaccati al supporto.
   8. Aggiungere ddH₂O sopra i chip e staccare delicatamente i trucioli dalla fotomaschera.
      NOTA: Se il chip di plastica è attaccato alla fotomaschera, staccare il chip utilizzando una punta di pipetta di plastica per spingere il chip tenendo le pinzette leggermente sopra il chip nel caso in cui il chip si stacchi improvvisamente.
   9. Infine, posizionare i chip fotomodellati all’interno della camera di deposizione a matrice.
      NOTA: Assicurarsi che il lato illuminato del chip sia rivolto verso l’alto.
3. Depositare la matrice.
   NOTA: Tutte le procedure descritte in questa sezione devono essere eseguite in una cappa di coltura tissutale.
   1. Filtrare la soluzione poloxamer 407 con un filtro in poliethersulfone (PES) da 0,22 m.
   2. Preparare la soluzione di rivestimento ECM mescolando 500 g/mL di poloxamer filtrato sterile 407 e 1 mg/mL di gelatina.
      NOTA: Vedere anche la Tabella 1 per ulteriori informazioni su altre possibili molecole ECM.
   3. Aggiungere 200 l della soluzione di rivestimento su ogni chip illuminato. La pellicola di laboratorio impedirà che la caduta cada al di fuori del chip.
   4. Aggiungere un piatto di Petri di 3 cm confortato con ddH₂O per limitare l’evaporazione e posizionarlo con il chip a 4 gradi centigradi durante la notte.

3. Procedura di seeding

NOTA: i passaggi descritti di seguito sono stati ottimizzati per le cellule staminali embrionali del tono CGR8 (mESC)²⁴ utilizzando il supporto mESC standard (vedi anche la Tabella dei Materiali). Tuttavia, in linea di principio è possibile adattare la procedura per qualsiasi tipo di cellula. Si noti inoltre che la coltura cellulare convenzionale delle cellule staminali embrionali del topo non è descritta qui come una documentazione approfondita può essere trovata altrove²⁵.

1. Aspirare la soluzione di rivestimento e incubare i trucioli due volte per almeno 5 min con PBS sterile.
2. Nel frattempo, preparare una sospensione cellulare di 5,5 x 10⁵ celle / mL nel mezzo caldo.
3. Pipet 200 – L di sospensione cellulare su ogni chip (100.000 celle/cm²).
4. Chiudere la camera di semina e lasciare che le cellule aderiscano per 1 h nell’incubatrice.
5. Dopo 1 h, riempire i pozzetti di una piastra multiwell (4-bene o 24-bene a seconda del numero di trucioli) con 500 l/pozzedi di mezzo caldo e trasferire i trucioli nella piastra con una pinzetta sterile.
6. Agitare vigorosamente la piastra per staccare le cellule non aderenti. Aspirare il mezzo e sostituire immediatamente con un mezzo caldo fresco. Controllare al microscopio per verificare se la modellistica è visibile (Figura 2a).
   NOTA: potrebbe essere necessario ottimizzare il tempo di adesione quando si utilizzano linee cellulari diverse da mESC o altre proteine a matrice (vedere anche tabella 2).
7. Ripetere questo passaggio fino a quando i modelli diventano chiaramente visibili come illustrato nella Figura 2a.
   NOTA: questo passaggio è fondamentale e determina l’esito positivo della procedura. Una procedura di lavaggio troppo intensa può staccare le cellule, al contrario un lavaggio insufficiente può causare la permansi di cellule tra i modelli (Figura 2c,d).

4. Fissazione

NOTA: Dopo 48 h in coltura le cellule dovrebbero formare colonie dense che seguono rigorosamente la forma dei modelli (come mostrato nella Figura 2b).

1. Lasciando i trucioli nella piastra, rimuovere il 90% del mezzo, lasciando abbastanza mezzo per evitare che i trucioli si asciughino.
   NOTA: È importante che il chip non si asciughi mai per evitare artefatti colorazione e per evitare il distacco cellulare dalla superficie. A causa dell’idrofobicità della superficie del chip tra modelli adesivi, il chip può avere una tendenza a de-umido. In questa fase, il fissativo può causare il distacco di grandi colonie a cupola dal chip. I fusti dovrebbero essere molto delicati, eseguiti idealmente pipetting liquid sul lato del pozzo e non direttamente sul chip.
2. Aggiungere almeno 500 l di paraformaldeide (PFA)-soluzione di fissazione a base di bene e incubare per 10 min.
   NOTA: Se le colonie appaiono particolarmente spesse (più di 5 strati cellulari), potrebbe essere necessario regolare il tempo di fissaggio a 20 min.
3. Dopo la fissazione, lavare 3 volte con la soluzione di lavaggio (PBS con 0.01% poloxamer 407). Un lavaggio supplementare con 50 mM NH₄Cl diluito in soluzione di lavaggio può essere intercalato per disinnescare l’attività residua di collegamento incrociato PFA.
4. Incubare i campioni per almeno 30 min nella soluzione di blocco.
   NOTA: In questa fase, i campioni possono essere conservati a 4 gradi centigradi per circa una settimana prima della colorazione. In tal caso, sigillare la piastra con pellicola di laboratorio per evitare l’evaporazione.

5. Immunostaining

1. Preparare una camera di colorazione posizionando un foglio di pellicola da laboratorio nella parte inferiore di un piatto Petri di 10 cm quadrati.
2. Preparare le soluzioni anticorpali (vedere la tabella 3 per un elenco di anticorpi e diluizioni utilizzate in questo articolo).
3. Posizionare il chip nella camera di colorazione con il lato che sostiene le cellule rivolte verso l’alto e aggiungere immediatamente 100 l di soluzione anticorpale primaria sul chip.
   AVVISO: In questa fase, i chip non dovrebbero essere facilmente de-umidi come nel passaggio 4.1. Tuttavia, la cura dovrebbe ancora essere presa perché è importante che i chip non si asciughino. Se è necessario elaborare più chip, applicare il passaggio 5.3 a ogni chip in sequenza.
4. Incubare per 1 h su una piattaforma rotante a temperatura ambiente.
   NOTA: Se le cellule hanno formato grandi strutture 3D, può essere necessario un tempo di incubazione più lungo per consentire una colorazione uniforme del campione. Il tempo di incubazione può essere aumentato fino a 24 h. Tuttavia, la camera di colorazione deve contenere un piatto di 3 cm riempito con acqua e la camera di colorazione deve essere sigillata con pellicola di laboratorio per evitare l’evaporazione.
5. Trasferire le patatine in un piatto multiwell fresco e lavare 3 volte con la soluzione di lavaggio.
6. Eseguire l’incubazione con anticorpi secondari come descritto nei passaggi 5.3 e 5.4.
7. Montare il chip su una diapositiva di microscopia utilizzando 20 -L di qualsiasi supporto di montaggio standard (ad esempio Mowiol).

6. Imaging

NOTA: l’imaging può essere eseguito su un microscopio confocale standard. In questo caso forniamo solo raccomandazioni per garantire una qualità dell’immagine che sarà sufficiente per la successiva analisi quantitativa.

AGGIORNAMENTO: Per evitare qualsiasi distorsione dell’operatore, le colonie di immagine devono essere scelte solo utilizzando il segnale di involucro nucleare (per vedere se una colonia segue correttamente la forma del modello). Evitare di controllare il segnale dei marcatori di interesse, tranne quando si regolano le impostazioni del microscopio.

1. Assicurarsi che la profondità del bit di acquisizione sia 12 o 16 bit.
2. Identificare le impostazioni appropriate per massimizzare l’intervallo dinamico per ogni canale di immagine. In particolare, evitare il ritaglio dell’immagine.
3. Includere un canale per l’immagine dell’autofluorescenza del micropattern (vedere la figura3).
4. Regolare le dimensioni dell’immagine e il fattore di zoom per ottenere dimensioni voxel comprese tra 0,1 e 0,6 m negli assi x e y e comprese tra 0,2 e 2 m nell’asse z.
   NOTA: Ad esempio, in questo studio, abbiamo utilizzato un microscopio confocale a scansione invertita con un obiettivo 40x (apertura numerica uguale a 1,3), una dimensione dell’immagine di 1024 x 1024 pixel senza zoom digitale e una dimensione a z di 0,5 m. Ciò ha portato ad una dimensione voxel di 0,38 m x 0,38 m x 0,5 m.
5. Per ogni colonia, definire la posizione minima e massima lungo l’asse z per garantire che l’intera colonia venga acquisita. Almeno un aereo con segnale basso o nessun dovrebbe essere incluso sotto e sopra la colonia.
6. Assicurarsi che gli orientamenti z-stack siano acquisiti in modo coerente (sempre dall’alto verso il basso o sempre dal basso verso l’alto)
7. Regola la velocità di scansione, la risoluzione dell’immagine, la media dei fotogrammi e i vantaggi del rivelatore per identificare un valore ottimale tra la qualità dell’immagine e il tempo di imaging. Come indicazione, il tempo di imaging per una colonia come mostrato nella Figura 3 è stato di circa 2-3 min. Eseguire l’acquisizione dell’immagine.
   AVVISO: Tutte le immagini, per essere comparabili, devono essere acquisite sullo stesso microscopio con le stesse impostazioni oggettive e di acquisizione.
8. Al termine dell’acquisizione, salvare tutte le immagini e assegnare una convenzione di denominazione univoca per identificare la condizione sperimentale che ogni immagine rappresenta.
   NOTA: Vedere Figura 4 come esempio, questa convenzione verrà utilizzata in un secondo momento durante la procedura di analisi. Si noti che le immagini possono essere salvate in qualsiasi formato supportato da BioFormats ²⁶. Se le colonie sono più grandi del campo visivo, il plugin di cucitura di ImageJ può essere utilizzato²⁷. Si noti inoltre che in caso di cucitura, potrebbe essere necessaria una correzione di roll off dell’illuminazione.

7. Analisi dell’immagine

NOTA: le specifiche del computer consigliate per questa procedura sono: 16 GB di RAM, una CPU multi-core da 3,33 GHz e almeno 50 GB di spazio su disco (o più a seconda del numero di chip che sono stati imageizzati). Il software è stato testato su Linux, Windows e MacOS. PickCells è un’applicazione di analisi delle immagini multipiattaforma con un’interfaccia utente grafica dedicata all’analisi dell’organizzazione collettiva delle cellule in complesse immagini multidimensionali (Blin et al, in preparazione). Si noti che ulteriori informazioni su PickCells così come la documentazione per i moduli specifici menzionati qui possono essere trovati online: https://pickcellslab.frama.io/docs/. Si noti inoltre che l’interfaccia è soggetta a modifiche mentre continuiamo a migliorare il software. Se l’interfaccia differisce da ciò che è mostrato nella figura o video, si prega di fare riferimento al manuale online.

1. Installare ed eseguire PickCells seguendo la documentazione disponibile online.
2. Importare immagini e verificare l’accuratezza delle informazioni fornite (Figura 4-1).
3. Documentare il nome di ogni canale.
4. Nuclei di segmento basati sul segnale di inviluppo nucleare utilizzando il modulo Nessys²⁸ (Figura4-2) e fornire un prefisso (“nuclei” per esempio) che verrà utilizzato per denominare le immagini segmentate generate.
   NOTA: la documentazione sull’utilizzo e le regolazioni dei parametri è reperibile in https://framagit.org/pickcellslab/nessys.
5. Esaminare e modificare le segmentazioni, se necessario, utilizzando il modulo dell’editor di segmentazione (Figura 4-3)
   NOTA: se per qualsiasi motivo il processo di segmentazione non ha fornito risultati soddisfacenti, eliminare manualmente le immagini nella cartella del database ed eliminare anche il nodo ‘risultato di segmentazione’ nella vista MetaModel. Ripetere quindi i passaggi 7.4 e 7.5. Se la segmentazione di un solo sottoinsieme di immagini non ha fornito risultati soddisfacenti, utilizzare l’applicazione autonoma Nessys (vedere il collegamento nella 7.4), tentare la segmentazione sulle “immagini difettose” e sostituire il file corrispondente nella cartella del database).
6. Segmentare il segnale di autofluorescenza del modello utilizzando il modulo di segmentazione di base (Figura 4-4)
   1. Fornire un prefisso (“modello”, ad esempio) che verrà utilizzato per denominare le immagini segmentate generate.
   2. Selezionare il canale contenente il segnale di autofluorescenza.
   3. Applicare la riduzione del rumore; generalmente utilizzando un filtro gaussiano con una dimensione del kernel di 10 x 10 x 0,5 voxel dà risultati soddisfacenti.
   4. Impostare la soglia inferiore in modo che lo sfondo venga visualizzato in blu mentre il primo piano appare bianco. Impostare anche la soglia superiore sul valore massimo per evitare che intensità elevate vengano escluse dal risultato finale (aree rosse).
   5. Selezionare Salta per l’ultimo passaggio.
   6. Fare clic su Fine e attendere l’elaborazione di tutte le immagini.
7. Per quanto riguarda i nuclei, i risultati della segmentazione possono ora essere ispezionati visivamente e corretti se necessario utilizzando il modulo dell’editor di segmentazione (Figura 4-5).
8. Creare oggetti nuclei e calcolare le funzioni di base degli oggetti.
   1. Avviare il modulo delle funzionalità intrinseche dalla barra delle applicazioni a sinistra dell’interfaccia principale (Figura 4-6).
   2. Chiudete i pannelli Sistema ellissoide ed Estrattore superficie per mantenere aperto solo il pannello Funzioni di base.
   3. Scegliere Nucleus come tipo di oggetto e scegliere il prefisso indicato nel passaggio 7.4 per le “immagini segmentate”.
   4. Premere Calcolo e attendere che tutte le immagini siano state elaborate.
      NOTA: Dopo questo passaggio, non sarà possibile modificare nuovamente le segmentazioni dei nuclei.
9. Creare oggetti pattern e calcolare le funzioni oggetto di base. Ripetere i passaggi da 7.8.1 a 7.8.4, solo questa volta scegliere Tipo personalizzato come tipo di oggetto e il prefisso specificato nel passaggio 7.6.1 per le immagini segmentate.
   NOTA: dopo questo passaggio, non sarà possibile modificare nuovamente le segmentazioni del modello.
10. Memorizzare il nome dell’immagine a cui appartiene ogni nucleo come attributo del nucleo.
    1. Fare clic su Dati > Nuovo attributo e selezionare Nucleus nella finestra di dialogo popup e fare clic su OK.
    2. Selezionare Raccogli dati da altri oggetti connessi al nodo e fare clic su Avanti.
    3. Nel pannello a sinistra, selezionare Immagine, quindi fare doppio clic sul segno di interrogatorio sotto il flag Fine nel pannello Definizione percorso per impostare il nodo dell’immagine come destinazione del percorso.
    4. Espandere il riquadro Attributi disponibili nel riquadro sinistro e selezionare l’attributo name.
    5. Espandere il riquadro Operazione di riduzione e selezionare Ottieni uno, quindi fare clic sul pulsante di modifica e fare clic su Avanti.
    6. Digitare “Nome immagine”, premere TAB e fare clic su OK.
11. Creare un attributo “coordinata normalizzata” negli oggetti nuclei (Figura 4-7).
    1. Adattare i passaggi da 7.10.1 a 7.10.6 per memorizzare le coordinate del modello centroide come attributo del nucleo. Denominare questo nuovo attributo “Coordinata modello”.
    2. Quindi, fare clic su Dati > Nuovo attributo, selezionare Nucleus e fare clic su Ok.
    3. Selezionare Definisci una funzione tra vettori spaziali o direzionali del nodo e fare clic su Avanti.
    4. Per Tipo di funzione selezionare Operazione di matrice, per V1 selezionare Vettore elemento, quindi Centroide, quindi V2 selezionare Vettore elemento, quindi Coordinato motivoe.
    5. Fare clic su Avanti, digitare “Coordinata normalizzata” nel campo Nome e fare clic su Fine.
12. Esportare i dati in un file con valori separati da tabulazioni.

8. Analisi R

1. Scaricare e installare Rstudio.
   NOTA: le informazioni sul software e i link per il download sono disponibili https://www.rstudio.com/.
2. Scaricare gli script R necessari per questa analisi.
   NOTA: gli script possono essere scaricati dal repository GitLab: https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr.
3. Aprire Rstudio.
   NOTA: se si eseguono gli script per la prima volta, installare i pacchetti R necessari (ggplot2 e scale).
4. Da Rstudio, aprire il modello di mappaina. Script R.
5. Impostare la directory di lavoro sul percorso del file di origine.
6. Seguire le istruzioni fornite nello script per adattare lo script a qualsiasi set di dati specificato per ottenere mappe spaziali, come illustrato nella Figura 5.
7. Eseguire lo script per generare mappe di densità.

Representative Results

Discussion

Qui descriviamo un metodo per analizzare i modelli emergenti nelle colture di cellule. Un approccio di micropatterning semplificato viene utilizzato per standardizzare la forma e le dimensioni delle colonie cellulari, e presentiamo strumenti di analisi delle immagini e script R che consentono il rilevamento e la quantificazione dei modelli all’interno di queste colonie.

La pipeline che proponiamo è simile in una certa misura con un metodo precedentemente pubblicato³¹ in cui gli autori si concentrano sulle condizioni di coltura, utilizzando micromodelli disponibili in commercio, per ottenere la formazione di strato germinale riproducibile nelle colonie ESC per il studio dei primi eventi di gastrulazione in vitro. Il nostro obiettivo è più mirato a fornire una pipeline generalizzabile per la scoperta della formazione di modelli in vitro dove l’organizzazione collettiva delle cellule può diventare evidente solo dopo l’analisi statistica. Per questo motivo, forniamo un robusto flusso di lavoro di analisi delle immagini che consente l’identificazione e l’analisi accurata della posizione nucleare nello spazio 3D su più colonie (vedi anche la sezione “Vantaggio e limitazioni del metodo di rilevamento dei pattern” di questo discussione). Abbiamo anche deciso di sviluppare un semplice approccio di micropatterning interno che offra un’alternativa più flessibile ed economica alle soluzioni disponibili in commercio a lungo termine che speriamo siano utili alla comunità.

Infine, notiamo che durante la revisione di questo manoscritto, è stato rilasciato un nuovo pacchetto per l’analisi del patterning in vitro simile ai nostri script R³². Questo nuovo pacchetto accetta tabelle di funzionalità delle celle come input che possono essere ottenute da piattaforme di imaging ad alta velocità effettiva. Crediamo che la tabella delle caratteristiche dei nuclei generata al punto 7 del nostro protocollo potrebbe in linea di principio servire come input a questo nuovo pacchetto anche se non abbiamo testato questa possibilità noi stessi.

Adattabilità del metodo ad altri tipi di cellule e geometrie di colonia

Vi presentiamo questo approccio nel contesto dello studio dell’emergere di fattori di trascrizione mesodermici nelle colture di cellule pluripotenti in presenza di siero. Tuttavia, il metodo è facilmente adattabile ad altri tipi di cellule e alle colture senza siero, anche se potrebbe essere necessario ottimizzare le concentrazioni di ECM/poloxamer 407 (cfr. tabella 1 per le concentrazioni testate e Tabella 2 per una guida alla risoluzione dei problemi). Il metodo può anche essere adattato a dimensioni più grandi o più piccole di micromodelli e ad una vasta gamma di forme in base alle esigenze dell’utente. Tuttavia, mentre si stabilisce il metodo, è importante essere consapevoli del fatto che non tutte le combinazioni di forma/tipo di cella sono ottimali. Ad esempio, mESC esprime alti livelli di E-cadherin^33,34 consentendo a queste cellule di formare strutture collettive che si estendono su aree prive di ECM. Queste celle non seguono rigorosamente le geometrie con angoli acuti o che includono piccoli fori nel modello. Si noti, ad esempio, che sull’anello della figura 3B, le celle sono in fase di colonizzazione dell’area centrale. Nelle nostre mani una zona centrale più piccola non ha costretto mESC a formare colonie ad anello. Si consiglia quindi di includere una varietà di geometrie durante la progettazione della fotomaschera per poter testare e identificare le dimensioni e le curve ottimali che saranno adatte al tipo di cella scelta.

Un altro fattore importante da prendere in considerazione è la lunghezza dell’esperimento e il tasso di proliferazione delle cellule. Per alcuni tipi di cellule che proliferano rapidamente (comprese le cellule pluripotenti) può essere difficile mantenere le cellule su micromodelli per molti giorni (Per mESC tre giorni è un massimo). Inoltre, la semina di cellule su micromodelli non sempre avviene in modo ottimale per ogni colonia, quindi è consigliabile seminare un eccesso di colonie per avere pezzi di ricambio.

Vantaggio e limitazioni del metodo di rilevamento dei pattern

Un particolare vantaggio del metodo è la capacità di rilevare modelli “medi” combinando i risultati dell’analisi delle immagini da più colonie di replica (Figura 5). Questo può rivelare eventi di patterning che non sono evidenti dall’ispezione di singole colonie. Uno svantaggio di questo approccio di “media” è che può mancare alcuni tipi di modelli ripetitivi, ad esempio piccole macchie o strisce strette. Tuttavia, questi tipi di pattern possono invece essere rivelati con una combinazione di dimensioni del modello scelte con cura⁸. Inoltre, la pipeline di analisi delle immagini qui descritta fornisce dati quantitativi sia a singola cellula che a risoluzione della colonia che offrono la possibilità di studiare il livello di variabilità tra le composizioni (Figura5) o di eseguire l’analisi dei vicini a più bilance¹⁰.

Un altro importante vantaggio del metodo di media è che offre l’opportunità di mappare la posizione preferenziale di molti marcatori senza essere limitato da fluorofori disponibili dei canali di rilevamento. Infatti, anche se ci avvalemo solo di due marcatori di differenziazione nel lavoro qui presentato, la capacità di standardizzare le colonie ed estrarre modelli “mediati” consente di confrontare insieme le mappe di distribuzione di diverse serie di colonie per per rivelare le relazioni spaziali generalizzate dei marcatori l’uno all’altro.

Inoltre, anche se il nostro obiettivo è stato quello di studiare i marcatori di differenziazione, il metodo di analisi può essere esteso per studiare altri processi biologici per i quali sono disponibili marcatori nucleari. Ad esempio, la microdoratura di una linea cellulare contenente un indicatore del ciclo cellulare dell’ubiquitazione a fluorescenza a fluorescenza³⁵ (FUCCI) consentirebbe di studiare in che modo la geometria a livello di colonia può influenzare gli eventi del ciclo cellulare nel gruppo.

Indicazioni future

Il metodo è suscettibile di analisi delle immagini a media velocità effettiva, tuttavia, l’acquisizione di immagini non è attualmente completamente automatizzata e può diventare limitante per esperimenti di grandi dimensioni. Le disposizioni regolari delle colonie dovrebbero rendere possibile creare routine di acquisizione completamente automatizzate simili a quelle sviluppate per una singola cellula media^{di 20}. Tuttavia, poiché le dimensioni del campo necessario per immaginare una colonia sono grandi, probabilmente richiedono mosaici, e poiché le colonie sono tridimensionali, è altamente auspicabile ridurre sia le dimensioni del set di dati che il tempo di acquisizione mediante l’imaging solo di colonie pertinenti. Pertanto, gli sforzi futuri potrebbero essere dedicati a sviluppare un microscopio “intelligente” in grado di identificare le colonie rilevanti e adattare le coordinate di imaging per ogni campione. Ciò non solo ridurrà i tempi e gli sforzi, ma previene anche potenziali distorsioni dell’operatore.

Le pipeline di analisi possono anche essere rese più efficienti riducendo il numero di passaggi che l’utente deve eseguire. Abbiamo in programma di costruire un meccanismo di costruzione di tubazioni e di integrare R direttamente nel nostro software (vedi anche problemi pickcells-api-3 e pickcells-rjava1 nel tracker di problemi dei nostri repository di codice [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues]). La completa automazione della procedura di analisi ridurrà i tempi e gli sforzi e limiterà i potenziali errori degli utenti.

Infine, notiamo che il nostro metodo di analisi non cattura ancora completamente la natura dinamica del patterning cellulare. Alcune informazioni dinamiche limitate possono essere estratte esaminando una serie temporale di immagini istantanee^8,10,36. Tuttavia, essere in grado di registrare la storia della popolazione cellulare è altamente auspicabile se vogliamo capire meglio come emerge il modello. Una limitazione è che il tracciamento accurato delle singole cellule in una popolazione di cellule dense 3D rimane un compito molto impegnativo³⁷. Il nostro metodo di rilevamento cellulare utilizza l’involucro nucleare e si comporta particolarmente bene su popolazioni cellulari dense e sovrapposte²⁸. I giornalisti vivi dell’involucro nucleare sono prontamente disponibili^28,38 e uno dei vantaggi della tecnica di micropatterning è che può essere utilizzato per impedire alle cellule di muoversi al di fuori del campo visivo durante l’imaging a lungo termine. Nel complesso, siamo fiduciosi che il monitoraggio automatizzato delle celle sarà realizzabile utilizzando una combinazione di strumenti di recente creazione^28,39,40 e che questo dovrebbe portare nuove intuizioni nel fondamentale principi di auto-organizzazione.

Materials

2-mercaptoethanol	Gibco	31350-010	handle in fume hood
1× Master quartz anti-reflective chromium photomask	Toppan Photomask	Custom design
24-well plates	Corning	3526
4-well plates	Nunclon Delta	176740
5% Donkey Serum	Sigma	D9663
Anti Nuclear pore complex	Abcam	ab24609	Mouse monoclonal, use 1:1000
Anti-Id1	Biocheck	37-2	Rabbit polyclonal, use 1:200
Anti-Lamin B1	Abcam	ab16048	Rabbit polyclonal, use 1:1000
Anti-Tbra	R&D	AF2085	Goat ployclonal, use 1:400
Blocking Solution	NA	NA	0.1% TritonX-100<br/> 0.01% Pluronic F-127<br/> 5% Donkey Serum<br/> 0.003% Sodium Azide<br/> In PBS
CGR8 mESC	NA	NA	Reference: Mountford et al. PNAS, 1994
Fixation solution	NA	NA	4% PFA diluted in washing solution
Foetal bovine serum	Gibco	10270-106	Serum batches must be tested to ensure compatibility with ESC maintenance
Gelatin	Sigma	G1890
Glasgow Minimum Essential Medium	Sigma	G5154
Laboratory Film	VWR	291-1212
Layout Editor Software	LayoutEditor	NA	https://layouteditor.com/
Layout Editor Software	Klayout	NA	https://www.klayout.de/
L-glutamine	Gibco	25030-024
LIF	Millipore	ESG1107
MEM NEAA	Gibco	11140-035
mESC Culture medium	NA	NA	GMEM<br/> 10% FCS<br/> 100 U/ml LIF<br/> 100 nM 2-mercaptoethanol<br/> 1&times; non-essential amino acids,<br/> 2 mM L- glutamine<br/> 1 mM sodium pyruvate
NH4Cl 50mM	Sigma	9718
Paraformaldehyde	Sigma	158127	CAUTION: Toxic, handle undiluted stocks in fume hood and wear protective equipment
PBS (immunostaining)	Sigma	P4417	Dilute in 200ml of ddH<sub>2</sub>O
PBS (tissue culture)	Gibco	11140-035
Plastic slides	Ibidi	IB-10813
Poloxamer 407	Sigma	P2443
ProLong Gold Antifade Mountant	Molecular Probes	P36930
Sodium Azide	Sigma	8591	CAUTION: Toxic, handle in fume hood and wear protective equipment
Sodium pyruvate	Gibco	11360070
TritonX-100	Sigma	T8532
Trypsin	Gibco	25200056
UVO cleaner	Jetlight, USA	42-220	CAUTION: Follow manufacturer&rsquo;s safety recommendations
Washing Solution	NA	NA	0.1% TritonX-100<br/> 0.01% Pluronic F-127<br/> In PBS