Un metodo di congelamento-thawing per preparare idrogel chitosan-Poly (alcool vinile) senza agenti cross-linking e studi di rilascio diflunisali

Sommario

Il metodo di congelamento-scongelamento viene utilizzato per produrre idrogel chitosan-polio(alcool vinile) senza agenti intertrainanti. Per questo metodo, è importante considerare le condizioni di congelamento (temperatura, numero di cicli) e il rapporto polimerico, che possono influenzare le proprietà e le applicazioni degli idrogel ottenuti.

Abstract

Gli idrogel chitosan-polio(alcool vitile) possono essere prodotti con il metodo del congelamento-scongelamento senza l'uso di agenti antisciverba tossici. Le applicazioni di questi sistemi sono limitate dalle loro caratteristiche (ad esempio, porosità, flessibilità, capacità di gonfiore, carico di droga e capacità di rilascio di droga), che dipendono dalle condizioni di congelamento e dal tipo e dal rapporto dei polimeri. Questo protocollo descrive come preparare gli idrogel dal chitosan e dal polinoma alcool al 50/50 w/w % della composizione dei polimeri e a variare la temperatura di congelamento (-4 gradi centigradi, -20 gradi centigradi, -80 gradi centigradi) e cicli di congelamento (4, 5, 6 cicli di congelamento). Sono stati ottenuti dati di spettro FT-IR, micrografia SEM e porosimetria di idrogel. Inoltre, sono stati valutati la capacità di gonfiore e il carico di droga e il rilascio di diflunisal. I risultati delle micrografie SEM e della porosimetria mostrano che la dimensione dei pori diminuisce, mentre la porosità aumenta a temperature più basse. La percentuale di gonfiore era più alta alla temperatura di congelamento minore. È stato studiato il rilascio di diflunisal dagli idrogel. Tutte le reti mantengono il rilascio di droga per 30 h ed è stato osservato che un semplice meccanismo di diffusione regola il rilascio diflunisal secondo i modelli Korsmeyer-Peppas e Higuchi.

Introduzione

Recentemente, gli idrogel hanno attirato grande interesse nel campo biomedico perché sono reti tridimensionali ad alto contenuto di acqua e sono morbidi e flessibili, in modo da poter imitare facilmente i tessuti naturali¹. Inoltre, non si dissolvono in mezzo acquoso a temperatura fisiologica e pH, ma presentano un grande gonfiore². Gli idrogel possono agire come scaffold di ingegneria tissutale, prodotti per l'igiene, lenti a contatto e medicazioni per ferite; perché possono intrappolare e rilasciare composti attivi e farmaci, sono utilizzati come sistemi di somministrazione di farmaci³. A seconda della loro applicazione, gli idrogel possono essere fatti da polimeri naturali o sintetici, o una combinazione di entrambi, al fine di ottenere le migliori caratteristiche⁴.

Le proprietà degli idrogel sono una conseguenza di molti fattori fisici e chimici. A livello fisico, la loro struttura e morfologia dipendono dalla loro porosità, dimensione dei pori e distribuzione dei^{pori 5}. A livello chimico e molecolare, il tipo di polimero, il contenuto di gruppo idrofilo nella catena polimerica, il tipo di punto di intercollegamento e la densità di collegamento incrociato sono i fattori che determinano la capacità di gonfiore e le proprietà meccaniche^6,7.

A seconda del tipo di agente di collegamento incrociato utilizzato per formare la rete, gli idrogel sono classificati come idrogel chimici o idrogel fisici. Gli idrogel chimici sono uniti da interazioni covalenti tra le loro catene, che si formano attraverso l'irradiazione UV e gamma o utilizzando un agente intercollegato^7,8. Gli idrogel chimici di solito sono forti e resistenti, ma, in generale, l'agente intercollegato è tossico per le cellule e la sua rimozione è difficile, quindi la sua applicazione è limitata. D'altra parte, gli idrogel fisici si formano con la connessione delle catene polimeriche attraverso interazioni non covalenti, evitando l'uso di agenti di collegamento incrociato^4,9. Le principali interazioni non covalenti nella rete sono le interazioni idrofobiche, le forze elettrostatiche, i limiti complementari e di idrogeno⁷.

Poly(vinyl alcohol) (PVA, Figura 1a) è un polimero sintetico e solubile in acqua con eccellenti prestazioni meccaniche e biocompatibilità che può da idrogel senza agente crosslink attraverso il metodo di congelamento-scongelamento^10,11. Questo polimero ha la capacità di formare zone concentrate di legami di idrogeno tra -OH gruppi delle loro catene (zone cristalline) quando sono congelamento¹². Queste zone cristalline fungono da punti di interazione nella rete, e sono promosse da due eventi: l'avvicinamento delle catene polimeriche quando l'acqua cristallina si espande e il PVA conformazionale cambia da isotattico a sinoca PVA durante il congelamento¹³. A causa del congelamento, i cristalli d'acqua sono sublimati, lasciando spazi vuoti che sono i pori nell'idrogel¹⁴. Per ottenere idrogel con proprietà migliori, PVA può essere facilmente combinato con altri polimeri.

In questo senso, il chitosan costituisce un'opzione in quanto è l'unico biopolimero proveniente da fonti naturali con cariche positive. Si ottiene con la deacetlazione della chitina ed è composto da combinazioni casuali di D-glucosamina collegata (unità deacetilata) e N-acetyl-D-glucosamina (unità acetilata)^15,16 (Figura 1b). Chitosan è biodegradabile dagli enzimi umani ed è biocompatibile. Inoltre, per la sua natura cationica, può interagire con la carica negativa della superficie cellulare, e questa proprietà è stata associata alla sua attività antimicrobica¹⁷. Questo polimero è facile da elaborare; tuttavia, le loro proprietà meccaniche non sono sufficienti e alcuni materiali sono stati aggiunti per formare complessi con caratteristiche migliori.

Considerando caratteristiche specifiche del chitosan e del PVA, la produzione di successo di idrogel è stata raggiunta con il^metododi congelamento^2,18 per evitare l'uso di agenti antiscianti tossici. Negli idrogel chitosan-PVA si formano anche le zone cristalline di PVA, e le catene chitosane sono interpenetrate e formano semplici legami di idrogeno con -NH₂ gruppi e -OH gruppi in PVA. L'idrogel chitosan-PVA finale è meccanicamente stabile, con alti tassi di gonfiore e bassa tossicità, e con effetto antibatterico¹⁸. Tuttavia, a seconda delle condizioni di congelamento utilizzate nella preparazione (temperatura, tempo e numero di cicli), le caratteristiche finali possono cambiare. Alcuni studi riferiscono che aumentando il numero di cicli di congelamento diminuisce il grado di gonfiore e aumenta la forza di tensione^19,20. Al fine di rafforzare la rete, altri agenti come radiazioni gamma e UV e crosslinker chimici sono stati utilizzati in aggiunta dopo la preparazione congelata^21,22,23. Gli idrogel con una proporzione chitosana più alta hanno una rete più porosa e un'elevata capacità di gonfiore, ma meno resistenza e stabilità termica. In questo contesto, è importante considerare le condizioni di preparazione per ottenere idrogel adatti per l'applicazione di destinazione.

Lo scopo di questo lavoro è quello di presentare in dettaglio come le condizioni di congelamento (temperatura di congelamento e numero di cicli) influenzano le caratteristiche finali degli idrogel CS-PVA. Sono stati valutati spettri FT-IR, caratteristiche morfologiche e porosità e capacità di gonfiore, nonché il carico di droga e la capacità di rilascio. Negli studi di rilascio, diflunisal (Figura 1c) è stato utilizzato come farmaco modello, a causa delle sue dimensioni adatte alla struttura dell'idrogel.

Protocollo

1. Preparazione di idrogel chitosan-PVA

1. Preparare 2% (w/w) chitosan e 10% (w/w) soluzioni PVA. Sciogliere 0,2 g di chitosano in 10 mL di 0,1 M CH₃soluzione COOH (precedentemente filtrata) a temperatura ambiente e mantenere la continua agitazione meccanica durante la notte. Sciogliere 1 g di PVA in 10 mL di acqua distillata e mescolare a 80 gradi centigradi per 1 ora.
2. Mescolare entrambe le soluzioni 1:1 utilizzando un agitatore magnetico fino a quando non sono omogenei a temperatura ambiente, e versare le miscele sui piatti Petri. Lasciare i campioni per 2 h a pressione atmosferica a degas.
3. Congelano a -4 gradi centigradi, -20 o -80 gradi per 20 h e 4 cicli (campioni rispettivamente CP4-4, CP4-20 e CP4-80). Congel a -80 gradi centigradi per 20 h utilizzando 5 o 6 cicli di congelamento (campioni CP5-80 e CP6-80). Dopo il terzo ciclo di congelamento, lavare gli idrogel con acqua deionizzata. Alla fine, congelare gli idrogel a -46 gradi centigradi per 48 h e conservarli per un'ulteriore caratterizzazione (metodologia adattata da²).

2. Caratterizzazione FT-IR

1. Mettere un pezzetto (1 mm x 2 mm) di idrogel nello spettrometro FT-IR in modalità ATR. Prendere gli spettri FT-IR da 4000 a 600 cm^-1 (2 cm^-1 di risoluzione e media di 32 scansioni).

3. Saggi di gonfiore

1. Ritaglia i dischi (13 mm di diametro e 10 mm di altezza) dall'idrogel e pesali. Incubare i dischi in 50 mL di acqua deionizzata con agitazione a 25 gradi centigradi. Ripetere tre volte.
2. Ogni 30 min rimuovere il campione dal mezzo, blotter per eliminare l'eccesso di acqua, e pesare. Calcolare il grado di gonfiore utilizzando l'equazione 1 e calcolare lo stato di equilibrio del gonfiore, a 24 h utilizzando l'equazione 2.
   )
   Dove è il peso dell'idrogel secco ed è il peso dell'idrogel bagnato.
   

4. Microscopia elettronica

1. Coprire un pezzetto di idrogel con un sottile strato d'oro (30 s e 10 mA) in un rivestimento sputter.
2. Mettere il campione in un microscopio elettronico a scansione (SEM). Analizzare i campioni sotto vuoto a 20 kV e scattare le immagini con un ingrandimento 500x e 1500x.

5. Porosimetria

1. Posizionare i dischi di 15 mm di diametro del peso di circa 0,26 g nel penetrometro (un penetrometro solido, con un volume di massa di 0,3660 mL e 5,7831 mL di volume del gambo). Analizzare la porosità e la dimensione dei pori di Mercurio Intrusion Porosimetry (MIP).
2. Condurre l'esperimento in modalità isteresi (intrusione-estrusione). Misurare il volume totale di intrusione (mL/g), l'area totale dei pori (m²/g), il diametro dei pori (m), la porosità (%), la permeabilità (mDarcy) e la tortuosità. Ripetere due volte.

6. Carico e rilascio di farmaci

1. Prima del caricamento, preparare 4 L di 15 mg/L di soluzione diflunisale e mescolare durante la notte. Confermare la concentrazione della soluzione mediante spettroscopia UV-Vis (concentrazione iniziale). Infatti, gonfiare 400 mg di campioni liofilizzati di idrogel in 6 mL di acqua distillata per 24 h.
2. Per il caricamento, riempire un pallone con 50 mL di soluzione diflunisale e mantenersi a 25 gradi centigradi con agitazione costante. Immergere ogni idrogel gonfio nel pallone.
   1. Prendere aliquote di soluzione diflunisal rimanente (2 mL) in tempi diversi al fine di determinare la regione dell'altopiano della curva, per esempio: 3, 6, 24, 27, 30 e 48 h. Dopo 24 h sostituire la soluzione con una nuova.
3. Misurare l'assorbimento a 252 nm di ciascuno e determinare la concentrazione di diflunisal presente nella soluzione, utilizzando una curva di calibrazione didiflunisal. Calcolare la quantità di diflunisal trattenuta nell'idrogel a 24 e 48 h, come differenza di concentrazioni iniziali e finali, tenendo conto del volume totale (56 mL).
   1. Determinare l'efficienza di incapsulamento (EE) utilizzando l'equazione 3.
      
   2. Congel e liofilo liofilo a -50 gradi centigradi.
4. Per il rilascio di farmaci, immergere 300 mg di idrogel carichi diflunisili liofilisti liofili in 50 mL di tampone di fosfato (pH 7,4) a 25 gradi centigradi. Mantenere agitazione costante. Ritirare aliquote di 2 mL in tempi diversi e sostituirle con un nuovo mezzo per mantenere un volume costante.
   1. Determinate la diflunisal rilasciata spettrofotometricamente a 252 nm, secondo una curva di calibrazione.
5. Dedurre il meccanismo di rilascio di droga predominante negli idrogel che regolano i dati di rilascio del farmaco corrispondenti al primo 60%, al modello Korsmeyer-Peppas (Equazione 4), per ottenere le costanti cinetica (k) e la diffusione (n). I valori n indicano il meccanismo del rilascio farmacologico^24,25. Quindi, i valori n vicini allo 0,5 sono legati alla diffusione fickiana, nel frattempo valori di 0,5-1,0 per il trasporto anomalo, dove sono coinvolti catene di diffusione e rilassamento, e infine, i valori di 1,0 sono legati al trasporto caso II.
   
   1. Per confermare i risultati, utilizzare i modelli matematici Higuchi, First order e zero order (Equazioni da 5 a 7) e selezionare la misura migliore.
   2. 
      
      
      dove t rappresenta il tempo di rilascio, Mt la quantità di farmaco somministrato in un dato momento, e M_- la quantità totale di farmaco consegnato alla fine del processo.

Risultati

Preparazione idrogel
Gli idrogel Chitosan-PVA sono stati ottenuti a -4 gradi centigradi, -20 gradi centigradi e -80 gradi centigradi con 4 cicli di congelamento e a -80 gradi centigradi con 5 e 6 cicli di congelamento con il metodo di congelamento del congelamento²precedentemente riportato. Tutti gli idrogel erano omogenei, semitrasparenti, flessibili e resistenti contro la manipolazione.

Discussione

Il metodo di congelamento è un processo adatto per preparare idrogel biocompatibili focalizzati in applicazioni biomediche, farmaceutiche o cosmetiche^34,35,36. Il vantaggio più importante di questo metodo, rispetto ad altri metodi ben noti per preparare idrogel, è che l'uso di agente crosslinking è evitato, che potrebbe causare una risposta infiammatoria o effetti negativi nel corpo umano³⁴. Questo è un m...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Materiali:
Chitosano a medio peso molecolare	Sigma-Aldrich	448877	Mw determinato mediante viscosimetria capillare (637.000 Da) e grado di deacetilazione del 70%
Diflunisal (acido 2'-4'-difluoro-4-idrossi-3-bifenil-carbossilico)	Merck
Acido acetico glaciale	Sigma-Aldrich	1005706
Poli(alcool vinilico)	Sigma-Aldrich	341584	Mw 89.000-98.000, 99+% idrolizzato
Attrezzatura:
Cressington Sputter Coater 108 auto	TED PELLA INC
Cryodos Liofilizzatore	Telstar
Falcon tubi	Thermo Fisher Company
Spettroscopia FT-IR	Nicolet iS50	in modalità
Liofilizzatore	LABCONCO
Micromeritics Autopore IV 9500	Micromeritics
Microscopio elettronico a scansione	Pemtron SS-300LV
Spettrofotometro UV-visibile	Agilent 8453

ATR