Articolo metodologico

Studio funzionale in vivo sulle varianti umane rare associate alla malattia utilizzando la Drosophila

DOI:

10.3791/59658

⸱

20 agosto 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience, Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, 5Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'obiettivo di questo protocollo è quello di delineare la progettazione e le prestazioni degli esperimenti in vivo nella Drosophila melanogaster per valutare le conseguenze funzionali delle varianti genetiche rare associate alle malattie umane.

Abstract

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I progressi nella tecnologia di sequenziamento hanno reso i set di dati dell'intero genoma e dell'intero esoma più accessibili sia per la diagnosi clinica che per la ricerca sulla genetica umana all'avanguardia. Sebbene siano stati sviluppati diversi algoritmi in silico per prevedere la patogenicità delle varianti identificate in questi set di dati, gli studi funzionali sono fondamentali per determinare come specifiche varianti genomiche influiscono sulla funzione delle proteine, in particolare per un errore Varianti. Nella rete di ricerca sulle malattie non diagnosticate (UDN) e in altri consorzi di ricerca sulle malattie rare, gli organismi modello (MO) tra cui la Drosophila, i c. elegans, ipesci zebra e i topi sono utilizzati attivamente per valutare la funzione di malattia umana putativa che causa Varianti. Questo protocollo descrive un metodo per la valutazione funzionale delle varianti umane rare utilizzate nel Centro di screening degli organismi modello Drosophila Core dell'UDN. Il flusso di lavoro inizia con la raccolta di informazioni umane e MO da più database pubblici, utilizzando la risorsa web MARRVEL per valutare se la variante potrebbe contribuire alle condizioni di un paziente e progettare esperimenti efficaci basati su quelli disponibili conoscenze e risorse. Successivamente, vengono generati strumenti genetici (ad esempio, linee CDNA T2A-GAL4 e UAS-umani) per valutare le funzioni delle varianti di interesse per la Drosophila. Dopo lo sviluppo di questi reagenti, è possibile eseguire analisi funzionali su due punte basate su esperimenti di salvataggio e sovraespressione per valutare la funzione di variante. Nel ramo del salvataggio, i geni della mosca endogena vengono "umanizzati" sostituendo il gene ortologo della Drosophila con transgeni umani di riferimento o variante. Nel ramo della sovraespressione, le proteine umane di riferimento e variante sono esogenamente guidate in una varietà di tessuti. In entrambi i casi, qualsiasi fenotipo setabile (ad esempio, letalità, morfologia degli occhi, elettrofisiologia) può essere utilizzato come lettura, indipendentemente dalla malattia di interesse. Le differenze osservate tra gli alleli di riferimento e varianti suggeriscono un effetto specifico della variante, e quindi probabilmente patogenicità. Questo protocollo consente valutazioni rapide e in vivo delle varianti putative che causano malattie umane di geni con funzioni note e sconosciute.

Introduzione

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I pazienti con malattie rare spesso subiscono un viaggio arduo indicato come "odissea diagnostica" per ottenere una diagnosi accurata1. Si ritiene che la maggior parte delle malattie rare abbia una forte origine genetica, rendendo critici gli elementi critici dell'elaborazione genetica/genomica dell'elaborazione clinica. Oltre all'analisi delle variazioni dei pannelli genici e dei numeri di copie candidati, oltre all'analisi delle variazioni dei numeri cromosomici, all'intero esoma (WES) e al sequenziamento dell'intero genoma sono diventati strumenti sempre più preziosi nell'ultimo decennio2, 3. Attualmente, il tasso diagnostico per identificare una variante patogena nota in WES e WGS è di 25% (superiore nei casi pediatrici)4,5. Per la maggior parte dei casi che rimangono non diagnosticati dopo WES/WGS clinici, un problema comune è che ci sono molti geni e varianti candidati. Il sequenziamento di nuova generazione spesso identifica varianti nuove o ultrarare in molti geni e interpretare se queste varianti contribuiscono ai fenotipi della malattia è difficile. Ad esempio, anche se la maggior parte delle mutazioni senza senso o frameshift nei geni sono ritenute come alleli di perdita di funzione (LOF) a causa del decadimento mediato da sciocchezze della trascrizione codificata, mutazioni troncanti trovate negli ultimi esoni sfuggono a questo processo e possono funzionare come benigni o gain-of-function (GOF) alleli6.

Inoltre, prevedere gli effetti di un allele missense è un compito scoraggiante, dal momento che può portare a una serie di diversi scenari genetici come descritto per la prima volta da Herman Muller negli anni '30 (cioè amorfi, ipomorfi, ipomorfi, antimorfi, antimorfi, neomorfi o isomorfi)7 . Numerosi programmi e metodologie in silico sono stati sviluppati per prevedere la patogenicità delle varianti missense basate sulla conservazione evolutiva, il tipo di cambiamento degli amminoacidi, la posizione all'interno di un dominio funzionale, la frequenza allele nella popolazione generale, e altri parametri8. Tuttavia, questi programmi non sono una soluzione completa per risolvere il complicato problema dell'interpretazione delle varianti. È interessante notare che, un recente studio ha dimostrato che cinque algoritmi di previsione della patogenicità variante ampiamente utilizzati (Polyphen9, SIFT10, CADD11, PROVEAN12, Mutation Taster) concordano sulla patogenicità 80% delle volte8 . In particolare, anche quando tutti gli algoritmi sono d'accordo, restituiscono una previsione errata della patogenicità fino all'11% del tempo. Questo non solo porta a un'interpretazione clinica imperfetta, ma può anche dissuadere i ricercatori dal seguire le nuove varianti elencandole falsamente come benigne. Un modo per completare l'attuale limitazione della modellazione in silico consiste nel fornire dati sperimentali che dimostrino l'effetto della funzione variant in vitro, ex vivo (ad esempio, cellule coltivate, organoidi) o in vivo.

Gli studi funzionali in vivo sulle varianti associate alle malattie rare nel MO hanno punti di forza unici13 e sono stati adottati da molte iniziative di ricerca sulle malattie rare in tutto il mondo, tra cui la Rete delle Malattie Non Diagnosi (UDN) negli Stati Uniti e Rara Malattie Modelli & Meccanismi (RDMM) Reti in Canada, Giappone, Europa e Australia14. Oltre a questi sforzi coordinati per integrare i ricercatori MO nel flusso di lavoro della diagnosi di malattie rare e degli studi meccanicistici su scala nazionale, una serie di studi di collaborazione individuale tra ricercatori clinici e MO hanno portato alla scoperta e caratterizzazione di molti nuovi geni e varianti che causano malattie umane82,83,84.

Nell'UDN, un Centro di screening centralizzato degli organismi modello (MOSC) riceve la presentazione di geni e varianti candidati con una descrizione delle condizioni del paziente e valuta se la variante è probabilmente patogena utilizzando strumenti informatici e in vivo Esperimenti. Nella Fase I (2015-2018) dell'UDN, il MOSC comprendeva un Drosophila Core [Baylor College of Medicine (BCM)] e il nucleo di pesce zebra (Università dell'Oregon) che ha lavorato in collaborazione per valutare i casi. Utilizzando l'analisi informatica e una serie di diverse strategie sperimentali in Drosophila e pesce zebra, il MOSC ha finora contribuito alla diagnosi di 132 pazienti, l'identificazione di 31 nuove sindromi55, scoperta di diversi nuovi i geni della malattia (ad esempio, EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) e l'espansione fenotipica della malattia nota (ad esempio, CACNA1A21, ACOX122).

Oltre ai progetti all'interno dell'UDN, i ricercatori del MOSC Drosophila Core hanno contribuito a nuove scoperte geniche della malattia in collaborazione con i Centers for Mendelian Genomics e altre iniziative (ad esempio, ANKLE223, TM2D3 24 , NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) utilizzando lo stesso insieme di informatica e genetica strategie sviluppate per l'UDN. Dato il significato degli studi di MO sulla diagnosi di malattia rara, il MOSC è stato ampliato per includere un C. elegans Core e un secondo nucleo di pesce zebra (entrambi alla Washington University di St. Louis) per la fase II (2018-2022) dell'UDN.

Questo manoscritto descrive un protocollo di studio funzionale in vivo che viene utilizzato attivamente nel nucleo di Drosophila UDN MOSC per determinare se le varianti missense hanno conseguenze funzionali sulla proteina di interesse utilizzando mosche transgeniche che esprimono l'uomo Proteine. L'obiettivo di questo protocollo è quello di aiutare i ricercatori MO a lavorare in collaborazione con gruppi di ricerca clinica per fornire prove sperimentali che una variante candidata in un gene di interesse ha conseguenze funzionali, facilitando così la diagnosi clinica. Questo protocollo è particolarmente utile in uno scenario in cui un ricercatore della Drosophila viene avvicinato da un ricercatore clinico che ha un paziente a malattia rara con una variante candidata specifica in un gene di interesse.

Questo protocollo può essere suddiviso in tre elementi: (1) raccogliere informazioni per valutare la probabilità che la variante di interesse sia responsabile del fenotipo del paziente e la fattibilità di uno studio funzionale in Drosophila, (2) raccolta strumenti genetici esistenti e stabilirne di nuovi, e (3) svolgere studi funzionali in vivo. Il terzo elemento può essere ulteriormente suddiviso in due sottoelementi in base al modo in cui può essere valutata la funzione di una variante di interesse (esperimento di salvataggio o strategie basate su sovraespressioni). È importante notare che questo protocollo può essere adattato e ottimizzato a molti scenari al di fuori della ricerca sulle malattie monogeniche rare (ad esempio, malattie comuni, interazioni genetico-ambiente e schermi farmacologici/genetici per identificare gli obiettivi terapeutici). La capacità di determinare la funzionalità e la patogenicità delle varianti non solo gioverà al paziente di interesse fornendo una diagnosi molecolare accurata, ma avrà anche un impatto più ampio sulla ricerca scientifica traslazionale e di base.

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Protocollo

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1. Raccolta di informazioni umane e MO per valutare: probabilità che una variante di interesse sia responsabile dei fenotipi della malattia e fattibilità degli studi funzionali nella Drosophila

  1. Eseguire ricerche approfondite nel database e nella letteratura per determinare se i geni specifici e le varianti di interesse sono buoni candidati per spiegare il fenotipo del paziente di interesse. In particolare, raccogliere le informazioni seguenti.
    1. Valutare se il gene di interesse è stato precedentemente implicato in altri disturbi genetici (espansione fenotipica del gene della malattia nota) o se si tratta di un gene candidato della malattia completamente nuovo [variante genica di significato incerto (GVUS)].
    2. Valutare la frequenza allele della variante di interesse nei database delle malattie o della popolazione di controllo.
    3. Valutare se esistono variazioni del numero di copie (CPV) che includono questo gene nelle banche dati sulle malattie o nel controllo della popolazione.
    4. Valutare quali sono i geni ortologhi in diverse specie di MO tra cui topo, pesce zebra, Drosophila, C. elegans, e lievito, quindi indagare ulteriormente le funzioni note e modelli di espressione di questi geni ortologhi.
    5. Valutare se la variante di interesse è presente in un dominio funzionale della proteina e se l'amminoacido di interesse è conservato evolutivamente.
      NOTA: le risposte a queste cinque domande (passaggi 1.1.1-1.1.5) possono essere ottenute accedendo singolarmente a numerosi database umani e MO oppure utilizzando la risorsa Web MARRVEL (Model organism Aggregated Resources for Rare Variant Exploration) (vedere Tabella 1 per le risorse online)30, che è descritto in modo approfondito in un articolo di accompagnamento31. Vedere la sezione dei risultati rappresentativi per esempi specifici. Anche il sitoweb 32 di Monarch Initiative e Gene2Function33 forniscono informazioni utili.
  2. Raccogliere informazioni aggiuntive per valutare ulteriormente se la variante è una buona malattia candidata da una funzione proteica e struttura punto di vista.
    1. Valutare se si prevede che la variante di interesse sia dannosa in base agli algoritmi di previsione del silico.
      NOTA: Gli algoritmi di patogenicità delle varianti sono stati sviluppati da molti gruppi di ricerca negli ultimi 15 anni, e alcuni sono visualizzati anche nei risultati di ricerca MARRVEL. Programmi più recenti, inclusi i due elencati di seguito, combinano algoritmi di ridisposizione della patogenicità a variante multipla e approcci di apprendimento automatico per generare un punteggio di patogenicità. Per ulteriori informazioni sugli algoritmi di previsione delle varianti e sulle relative prestazioni, fare riferimento a Ghosh, et al.8. (i) CADD (esaurimento combinato dipendente dalle annotazioni): strumento di annotazione integrativa costruito su più di 60 caratteristiche genomiche, che fornisce punteggi per SNV umani e brevi inserimenti ed eliminazioni11. (ii) REVEL (raro dime variante ensemble learner): combina algoritmi di patogenicità a variante multipla (MutPred, FATHMM, VEST, PolyPhen, SIFT, PROVEAN, MutationAssessor, MutationTaster, LRT, GERP, SiPhy, phyloP e phastCons) per fornire un punteggio integrato per tutte le possibili varianti di missense umano34.
    2. Determinare se il gene/proteina umana di interesse o i suoi ortologhi MO hanno dimostrato di interagire geneticamente o fisicamente con geni/proteine precedentemente collegati a malattie genetiche. Se è così, valutare se il paziente di interesse presenta fenotipi sovrapposti con questi disturbi.
      NOTA: Sono stati sviluppati diversi strumenti per analizzare le interazioni genetico e proteina-proteina sulla base di pubblicazioni MO e di proteomica su larga scala provenienti da schermi di specie multiple. STRING (strumento di ricerca per istanze ricorrenti di geni vicini)35: un database per le interazioni proteina-proteina note e previste. Integra l'interazione genetica e i set di dati di co-espressione, nonché strumenti di estrazione del testo per identificare geni e proteine che possono funzionare insieme in una varietà di organismi. MIST (strumento di ricerca dell'interazione molecolare)36: un database che integra i dati genetici e di interazione proteina-proteina dai principali STUDI genetici (lievito, C. elegans, Drosophila, pesce zebra, rana, ratto, topo) e gli esseri umani. Vengono inoltre visualizzate le previsioni delle interazioni dedotte da geni/proteine ortologhi (interlog).
    3. Determinare se la struttura 3D della proteina di interesse è stata risolta o modellata. In tal caso, determinare dove mappa della variante di interesse rispetto ai domini funzionali chiave.
      NOTA: Le strutture proteiche risolte dalla cristallografia a raggi X, dalla risonanza magnetica nucleare (NMR) e dalla microscopia crioelettronica possono essere trovate nelle banche dati pubbliche, tra cui il PDB (banca dati proteine) e EMDatabank37. Sebbene non esista un unico database per le strutture proteiche stimate/modellate, sono disponibili per gli utenti una serie di algoritmi (ad esempio, SWISS-MODEL38, Modeller39e Phyre240) per eseguire la modellazione delle proteine.
  3. Comunicare con i collaboratori clinici per discutere le informazioni raccolte dalle analisi informatiche nelle sezioni 1.1-1.2. Se i collaboratori clinici ritengono anche che la variante e il gene di interesse siano buoni candidati per spiegare i fenotipi visti nel paziente, procedere alla sezione 2. Se ci sono domande specifiche sul genotipo e sul fenotipo del paziente, discuteteli con i collaboratori clinici prima di andare avanti.
    NOTA: Se si ritiene che la variante di interesse non spiegherà il fenotipo di interesse (ad esempio, variante identica trovata in alta frequenza nella popolazione di controllo), discuterne con i collaboratori clinici per determinare se la variante è una buona candidato, in quanto potrebbe non esserci la competenza appropriata per interpretare i fenotipi clinici.

2. Raccolta di strumenti genetici esistenti e creazione di nuovi reagenti per studiare una variante specifica di interesse

NOTA: Una volta che la variante di interesse è stata determinata un buon candidato per perseguire sperimentalmente, raccogliere o generare reagenti per eseguire studi funzionali in vivo. Per gli studi funzionali descritti in questo protocollo, sono necessari alcuni reagenti chiave drosophila melanogaster: 1) ceppi transgenici cDNA umani regolati da una sequenza a monte che portano la sequenza di riferimento o variante, 2) una perdita di funzione allele di un gene di mosca di interesse, e 3) una linea GAL4 che può essere utilizzata per esperimenti di salvataggio.

  1. Generazione di costrutti cDNA umani UAS e mosche transgeniche
    1. Identificare e ottenere i costrutti cDNA umani appropriati. Molti cloni sono disponibili presso la MGC (collezione di geni mammiferi)43 e possono essere acquistati da venditori selezionati. Per i geni che sono alternativamente uniti, controllare quale cDNA isoforme corrisponde all'utilizzo di Ensembl o RefSeq.
      NOTA: Molti cDNA sono disponibili nei reagenti 44 compatibili con il sistema di clonazione con supporto ricombinano44, il che semplifica il passaggio di subclonazione. i cDNA possono essere disponibili in un formato "aperto (no stop codon)" o "chiuso (con codon di arresto endogeno o artificiale)". Mentre i cloni aperti consentono il marcatura C di proteine utili per i saggi biochimici (ad esempio, le macchie occidentali) e le cellule biologiche (ad esempio, immunostaining) per monitorare l'espressione della proteina di interesse, in alcuni casi può interferire con la funzione proteica.
    2. Sub-clone il riferimento e variante cDNA nel vettore transgenico Drosophila. Utilizzare il sistema di transgenesi mediata da C31, poiché ciò consente di integrare i cDNA di riferimento e variante nella stessa posizione nel genoma45. Per questo progetto, il MOSC Drosophila Core utilizza abitualmente il vettore pGW-HA.attB46.
      NOTA: Se il cDNA umano è in vettori compatibili con il sistema di clonazione mediato in ricombinante (ad esempio, pDONR221, pENTR221), passare alla sezione 2.1.4, che spiega le reazioni LR per sottoclonare i cDNA in pGW-HA.attB.
      1. Se il cDNA umano non si trova in un sistema di clonazione compatibile con ricombinasi compatibile, sottoclone dei cDNA umani in un vettore di ingresso Gateway utilizzando tecniche biologiche molecolari standard (un esempio di tale protocollo è documentato di seguito).
        1. Eseguire una pcR di sporgenza per introdurre i bracci attB1 e attB2. Il primer in avanti dovrebbe avere la sequenza attB1 5'-GGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCT-3', seguita dai primi 22 nucleotidi del cDNA target. Il primer inverso dovrebbe avere la sequenza attB2 5'-GGACCACTTGTACAAGAAAGCTGGCTCTCTCCTA-3' seguita dal complemento inverso degli ultimi 25 nucleotidi del cDNA di interesse. Escludere il codon di arresto del cDNA, quindi aggiungere un tag C' se si desidera "aprire" un clone o aggiungere un codone di arresto per "chiudere" un clone.
        2. Preparare una miscela PCR ad alta fedeltà composta da 50 -L di miscela master PCR ad alta fedeltà, 36 l di acqua distillata, 5 ll di ogni primer in avanti e inverso elencati al passo 2.1.2.1.1 di diluito a 10 m e 4 -L di bersaglio cDNA (150 ng/L).
        3. Eseguire la PCR utilizzando il protocollo di mutagenesi standard per aggiungere braccia attB1 e attB2 sul cDNA di interesse. Le condizioni variano a seconda del costrutto e delle varianti di interesse.
        4. Isolare il cDNA bersaglio con i bracci di omologia aggiunti tramite elettroforesi gel ed estrazione gel. Creare 1% gel di agarose ed eseguire l'elettroforesi utilizzando metodi standard. Asciso la banda che corrisponde alla dimensione del cDNA più la lunghezza aggiuntiva dei bracci di omologia. Estrarre il DNA dal gel attraverso i metodi standard95. Kit di estrazione gel commerciali sono disponibili da diverse aziende.
        5. Eseguire una reazione ricombinante in vitro basata sul protocollo di clonazione recombinano-mediato secondo il sistema utilizzato.
        6. Trasformare il mix di reazione BP in cellule E. coli chimicamente competenti. Le celle competenti possono essere fatte internamente o acquistate da fornitori commerciali. Coltura le cellule trasformate durante la notte su una piastra LB contenente antibiotici appropriati per la selezione della colonia. Il giorno successivo, selezionare diverse colonie e farle crescere in culture liquide indipendenti durante la notte.
        7. Isolare il DNA dalle culture notturne attraverso il miniprep. Sequenziare i cloni positivi per garantire che il cDNA abbia la sequenza corretta96. Mantenere le cellule delle colture che sono positive per la sequenza desiderata nel 25% glicerolo memorizzato a -80 gradi centigradi.
    3. Eseguire la mutagenesi diretta dal sito per introdurre la variante di interesse nel plasmide Gateway con il riferimento umano cDNA97. Un protocollo dettagliato per questo metodo è disponibile nel sito Web del fornitore48,49. Convalidare la presenza della variante nel plasmide mutato tramite sequenziamento di Sanger dell'intero frame di lettura aperto (ORF) per assicurarsi che non ci siano varianti aggiuntive introdotte attraverso questa fase di mutagenesi.
    4. Sottoclone i cDNA umani di riferimento e variante nel plasmide del donatore (plasmidi di porta con siti attL1 e attL2) nel plasmide transgenico (ad esempio, pGW-HA.attB con siti attR1 e attR2) attraverso una reazione di clonasi LR.
      NOTA: Ci sono vettori UASC31 progettati per la subclonazione basata su enzimi di restrizione convenzionali (ad esempio, pUAST.attB50) se si preferisce sottoclonare cDNA umani tramite metodi di enzimi di restrizione.
    5. Selezionare i siti di ancoraggio C31 in cui integrare i transgeni cDNA UAS-umani. Un certo numero di siti di attracco sono stati generati da diversi laboratori e sono disponibili pubblicamente dai centri di magazzinaggio50,52,53.
      NOTA: Poiché è conveniente avere il transgene umano su un cromosoma che non contiene l'ortologo fly del gene di interesse, si consiglia di utilizzare un secondo sito di aggancio cromosomi [VK37 (scorta BDSC #24872] quando l'ortologo fly è sulla X , terzo o quarto cromosoma, e utilizzare un terzo sito di attracco cromosomico [VK33 (stock BDSC #24871] quando l'ortologo fly è sul secondo cromosoma.
    6. Iniettare i costrutti di cDNA UAS-human nelle mosche che esprimono l'integrasi CC31 nella loro linea germinale (ad es. vas-C31, nos-C31).
      NOTA: La microiniezione può essere eseguita internamente o inviata a strutture di base o entità commerciali per la transgenesi. Il protocollo dettagliato per la generazione di mosche transgeniche può essere trovato nel capitolo51del libro citato.
    7. Stabilire ceppi transgenici stabili dagli embrioni iniettati. Iniettare 100-200 embrioni per costrutto94. Uno schema di attraversamento rappresentativo per l'inserimento di un transgene in un secondo sito di attracco cromosomico (VK37) è illustrato nella Figura 1A. Fare riferimento ai libri citati54,55 per informazioni di base sulla genetica della Drosophila.
  2. Ottenere o generare una linea T2A-GAL4 che facilita i saggi funzionali basati sul salvataggio (vedere la Figura 2 e la sezione 3.1).
    NOTA: Questa linea servirà a due scopi. In primo luogo, la maggior parte delle linee T2A-GAL4 testate si comportano come forti alleli LOF funzionando come un allele trappola genica. In secondo luogo, le linee T2A-GAL4 funzionano come un driver GAL4 che consente l'espressione di costrutti UAS (ad esempio UAS-GFP, UAS-human cDNA) in base agli elementi di regolazione endogeni del gene di interesse56,57 (Figura 2A-C).
    1. Cerca nelle raccolte di azioni pubbliche le linee T2A-GAL4 disponibili, tra cui il Drosophila Gene Disruption Project (PIL)58 in cui sono state generate 1.000 linee T2A-GAL459. Questi ceppi sono attualmente disponibili presso il Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) e sono ricercabili attraverso i siti web del PIL e BDSC.
    2. Se non è disponibile una linea T2A-GAL4 per il gene fly di interesse, verificare se una linea MiMIC intronica di codifica adatta(Minos-mediated integration cassette) è disponibile per la conversione in una linea T2A-GAL4 utilizzando lo scambio di cassette mediato ricombinante (RMCE )60 (Figura 2A).
      NOTA: RMCE consente di convertire gli elementi MiMIC intronici che si trovano tra due esoni di codifica in una linea T2A-GAL4 attraverso la microiniezione di un costrutto donatore (un esempio di schema di attraversamento è illustrato nella Figura 1B) o in una serie di come descritto nel dettaglio57,59.
    3. Se non è disponibile una linea T2A-GAL4 e non esiste un MiMIC di codifica appropriato, esplorare la possibilità di generare una linea T2A-GAL4 tramite il sistema59DELLA cassetta di integrazione mediata CRIMR (CRISPR).
      NOTA: Questa metodologia utilizza la scissione del DNA mediata da CRISPR e la riparazione diretta dall'omologia (HDR) per integrare una cassetta simile a MiMIC in un intron codificante in un gene di interesse.
    4. Se il gene di interesse manca di un grande intron (>150 bp) o non ha introni, tentare di inserire una transgene GAL4 nel gene fly con il sistema CRISPR/Cas9 utilizzando HDR come descritto20,61,62.
      NOTA: se la generazione di un allele A battesimo T2A-GAL4 o GAL4 è difficile, tentare di eseguire esperimenti di salvataggio utilizzando questi alleli preesistenti o linee RNAi e driver GAL4 onnipresenti o specifici del tessuto come descritto92 (REF).

3. Esecuzione di analisi funzionale della variante umana di interesse in vivo in Drosophila

NOTA: Eseguire un'analisi basata sul salvataggio (sezione 3.1) e studi di sovraespressione (sezione 3.2) utilizzando gli strumenti raccolti o generati nella sezione 2 per valutare le conseguenze della variante di interesse in vivo in Drosophila. Considerare l'utilizzo di entrambi gli approcci, dal momento che i due sono complementari.

  1. Esecuzione di analisi funzionali attraverso esperimenti basati sul salvataggio
    nota: Esperimenti eterologi basati sul salvataggioDrosophilal'uso di proteine umane determina se la funzione molecolare dei due geni ortologhi è stata conservata nell'arco di 500 milioni di anni di evoluzione. Valutano anche la funzione della variante nel contesto della proteina umana63. Sebbene non sia stata riportata un'analisi sistematica che ha studiato centinaia di coppie di geni, diverse decine di geni umani e mammiferi (ad esempio, il topo) sono in grado di sostituire la funzione diDrosophilaGeni13.
    1. Nell'approccio basato sul salvataggio, determinare innanzitutto se esistono fenotipi evidenti, scorable e riproducibili nei mutanti LOF nell'ortologo di mosca prima di valutare le funzioni delle varianti.
      NOTA: La letteratura precedente sul gene fly è un buon posto per estrarre i dati prima, e può essere trovato utilizzando database tra cui FlyBase e PubMed. Ulteriori database come MARRVEL, Monarch Initiative e Gene2Funcion sono utili anche per raccogliere queste informazioni.
    2. Eseguire un'indagine globale sui fenotipi setorosibili nell'omozigoma e nell'emizigoso (T2A-GAL4 allele su un gene cromosomico definito molecolarmente, soprattutto se l'allele T2A-GAL4 è la prima mutazione da caratterizzare per un gene specifico. Valutare fenotipi come letalità, sterilità, longevità, morfologica (ad esempio, dimensioni e morfologia dell'occhio) e comportamento (ad esempio, corteggiamento, volo, arrampicata e difetti di sensibilità bang).
      NOTA: Se non ci sono fenotipi principali identificati da questo schermo primario, possono essere utilizzati fenotipi più sottili come i difetti neurologici misurati dalle registrazioni elettrofisiologiche se sono altamente riproducibili e specifici. Ad esempio, gli studi funzionali che utilizzano l'elettroretinogramma (ERG) sono descritti nel passaggio 3.2.3. In caso di mancata rilevanza di fenotipo, passare alla sezione 3.2 ed eseguire lo studio funzionale basato sulla sovraespressione.
    3. Una volta identificato un fenotipo coroso nel mutante LOF volante, verificare se il cDNA umano di riferimento può sostituire la funzione dell'ortologo della mosca tentando di utilizzare il cDNA umano per salvare la linea di mosca mutante. Il saggio fenotipica da eseguire qui dipende dai risultati del passaggio 3.1.2 e sarà specifico del gene studiato.
      NOTA: Se l'"umanizzazione" del gene della mosca ha successo, ora esiste una piattaforma per confrontare l'efficienza del salvataggio per la variante di interesse rispetto alla controparte di riferimento. Il salvataggio visto con riferimento cDNA umano non deve essere perfetto. Il salvataggio parziale del fenotipo mutante di mosca utilizzando un cDNA umano fornisce ancora un punto di riferimento per eseguire studi comparativi utilizzando la variante ceppo cDNA umano.
    4. Utilizzando il sistema di analisi selezionato al passo 3.1.2, confrontare il salvataggio osservato con il cDNA umano di riferimento con il salvataggio osservato con la variante cDNA umano per determinare se la variante di interesse ha conseguenze sul gene di interesse.
      NOTA: Se la variante cDNA umana funziona peggio dell'allele di riferimento, ciò suggerisce che la variante di interesse è deleteria per la funzione proteica. Se la variante e il riferimento non possono essere distinti funzionalmente, allora 1) l'allele può essere un isomorfo (una variante che non influenza la funzione della proteina) o 2) l'analisi non è abbastanza sensibile per rilevare sottili differenze.
    5. Se la variante risulta essere un allele deleterio, valuta ulteriormente l'espressione e la localizzazione intracellulare delle proteine di riferimento e variante di interesse in vivo tramite macchia occidentale, colorazione immunofluorescenza o altri metodi93.
      NOTA: Se il cDNA umano UAS viene generato da un clone aperto in un vettore pGW-HA.attB, utilizzare un anticorpo anti-HA per eseguire questi saggi biochimici e cellulari. Se il clone originale è un clone chiuso, verificare se gli anticorpi commerciali contro le proteine umane possono essere utilizzati per questi saggi. Una differenza nei livelli di espressione e nella localizzazione intracellulare può rivelare come la variante di interesse influenzi la funzione proteica.
  2. Esecuzione di analisi funzionali attraverso studi di sovraespressione
    NOTA: la sovraespressione susida o specifica dei tessuti dei cDNA umani in mosche di tipo altrimenti selvatico può fornire informazioni complementari agli esperimenti basati sul salvataggio discussi nella sezione 3.1. Mentre i saggi basati sul salvataggio sono progettati principalmente per rilevare le varianti LOF (amorfiche, ipomofici), i saggi basati su sovraespressione possono anche rivelare varianti di guadagno-di-funzione (GOF) che sono più difficili da valutare (ipermorfico, antimorfico, neomorfico).
    1. Selezionare un set di driver GAL4 per sovraesprimere i cDNA umani di interesse. Un certo numero di driver GAL4 onnipresenti e specifici dei tessuti sono disponibili presso centri di stock pubblici (ad esempio, BDSC), alcuni dei quali sono più frequentemente utilizzati rispetto ad altri. In primo luogo concentrarsi su driver onnipresenti e fenotipi facilmente coetbuabili (letalità, sterilità, fenotipi morfologici), poi passare a driver specifici del tessuto e fenotipi più specifici.
      NOTA: convalidare l'espressione dei driver GAL4 con una linea reporter (ad esempio, UAS-GFP) per confermare i modelli di espressione prima dell'utilizzo negli esperimenti.
    2. Esprimere il riferimento e la variante di cDNA umani utilizzando lo stesso driver nelle stesse condizioni (ad esempio, temperatura) incrociando 3-5 femmine vergini dalla linea GAL4 (ad esempio, ey-GAL4 per l'espressione del disco visivo) con 3-5 moscerini maschi dalle linee UAS [ad esempio, UAS-TBX2() o UAS-TBX2(p.R305H) per l'esempio illustrato nella sezione 4.2] in una singola flaconcia.
      1. Trasferire le croci ogni 2-3 giorni per avere molti animali che si estacono da una singola croce.
    3. Esaminare la progenie e rilevare eventuali differenze tra i ceppi di riferimento e varianti (ad esempio, morfologia degli occhi) al microscopio di dissezione. Immagine delle mosche utilizzando una telecamera collegata a un microscopio di dissezione per documentare il fenotipo.
      NOTA: Se un fenotipo è visto solo nel riferimento ma non nella linea di variante, allora la variante può essere un allele amorfico o ipomorfico forte. Se il fenotipo è visto in entrambi i genotipi, ma il riferimento provoca un difetto più forte, allora la variante può essere un allele ipomorfico da lieve a debole. Se il riferimento non mostra un fenotipo o mostra solo un fenotipo debole, ma la variante mostra un forte difetto, allora la variante può essere un allele GOF.
    4. Se un fenotipo non si vede in condizioni di coltura standard (RT o a 25 gradi centigradi), impostare le croci a temperature diverse che vanno 18-29 gradi centigradi, poiché il sistema UAS/GAL4 è noto per essere sensibile alla temperatura64,65). Tipicamente, l'espressione dei transgeni UAS è più alta a temperature più elevate.
  3. Eseguire ulteriori studi funzionali relativi ai geni e alle proteine di interesse.
    nota: Oltre ad esaminare i difetti generali, è possibile selezionare un sistema di analisi per sondare le funzioni molecolari del gene e della variante. In un esempio discusso nei risultati rappresentativi (TBX2caso), le registrazioni ERG sono state utilizzate per determinare gli effetti della variante sulla funzione fotorettutto, poiché il gene a mosca di interesse (bifid) era stato studiato a fondo nel contesto dello sviluppo del sistema visivo. Protocolli dettagliati per ERG inDrosophilapuò essere trovato come pubblicato in precedenza66,67,68.
    1. Generare mosche per verificare la ricerca di difetti funzionali nel sistema visivo. Le femmine vergini incrociate della linea Rhodopsin 1 (Rh1)-GAL4 ai maschi con riferimenti o varianti transgeni cDNA umani UAS per esprimere le proteine umane di interesse nei fotorecettori R1-R6.
      NOTA: Cross 3-5 femmine vergini a 3-5 maschio vola in una singola fiala e trasferire le croci ogni 2-3 giorni per avere molti animali che si estavano da una singola croce. Tutte le croci devono essere tenute in un'incubatrice fissata alla temperatura sperimentale per ottenere risultati coerenti.
    2. Una volta che le mosche iniziano a chiudere (a 25 gradi centigradi, 10 giorni dopo aver impostato la croce iniziale), raccogliere la progenie (Rh1-GAL4 / s; UAS-umano cDNA / )in fiale fresche e rimetterli nell'incubatrice impostata alla temperatura sperimentale per altri 3 giorni per il sistema visivo a maturare.
      NOTA: Anche se ERG può essere eseguita su mosche di 1-2 giorni, le mosche appena echiuse possono avere grandi fluttuazioni nel loro segnale ERG. Se si desidera esaminare un fenotipo dipendente dall'età, queste mosche possono essere invecchiate per diverse settimane, purché siano regolarmente (ad es. ogni 5 giorni) trasferite in una nuova fiala per evitare l'annegamento negli alimenti umidi.
    3. Preparare le mosche per la registrazione ERG aerando prima le mosche utilizzando CO2 o mettendole in una fiala sul ghiaccio. Incollare delicatamente un lato della mosca su uno scivolo al microscopio di vetro per immobilizzarli.
      NOTA: Più mosche di riferimento e variante possono essere incollate su una singola diapositiva. Posizionare tutte le mosche nello stesso orientamento con un occhio accessibile per l'elettrodo di registrazione. Fare attenzione a non ottenere la colla sull'occhio e a lasciare la proboscide libera.
    4. Preparare gli elettrodi di registrazione e di riferimento. Mettere un capillare di vetro da 1,2 mm in un tiro ad ago e attivarlo. Rompere il tubo capillare per ottenere due elettrodi affettiti taglienti. Gli elettrodi risultanti devono essere vuoti e avere diametri finali di <0,5 mm.
    5. Riempire i capillari con soluzione salina (100 mM NaCl), assicurandosi che non ci siano bolle d'aria. Far scorrere i capillari di vetro sopra gli elettrodi di filo d'argento (sia l'elettrodo di registrazione che l'elettrodo di riferimento, vedi Figura 4) e fissare i capillari in posizione.
    6. Configurare lo stimolatore e l'amplificatore. Un set-up dettagliato può essere trovato a Lauwers, et al.67. L'USN Drosophila MOSC set-up è costituito da attrezzature elencate nella sezione materiali.
      1. Impostare l'amplificatore su un filtro a passaggio alto da 0,1 Hz, un filtro a passa-basso a 300 Hz e un guadagno di 100.
      2. Impostare lo stimolatore su 1 s periodo, 500 ms larghezza impulso, 500 ms ritardo impulso, modalità di esecuzione, e 7 Amp.
      3. Preparare la sorgente luminosa per la fotostimolazione. Utilizzare una fonte di luce alogena per attivare i fotorecettori di mosca.
      4. Preparare il software di registrazione su un computer collegato alla configurazione ERG. Creare un protocollo di stimolazione con il modello di acquisizione "eventi a lunghezza fissa" e la durata di 20 s.
    7. Acclimata le mosche per completare l'oscurità prima di iniziare le registrazioni ERG. Mettere le mosche nel buio completo per almeno 10 minuti prima di iniziare l'esperimento.
      NOTA: Poiché le mosche non sono in grado di rilevare la luce rossa, utilizzare una fonte di luce rossa durante il periodo di assuefazione scura.
    8. Posizionare il vetrino contenente le mosche sull'apparato di registrazione e spostare i micromanipolatori che trasportano gli elettrodi di riferimento e di registrazione in un punto vicino al volo di interesse sul vetrino. Osservare la punta dell'elettrodo e posizionare con attenzione l'elettrodo di riferimento nel torace della mosca (penetrare la cuticola). Una volta inserito stabilmente l'elettrodo di riferimento, posizionare l'elettrodo di registrazione sulla superficie dell'occhio.
      NOTA: La posizione esatta di questo elettrodo di riferimento non ha un impatto significativo sul segnale ERG. L'elettrodo di registrazione deve essere posizionato sulla superficie dell'occhio poiché ERG è una registrazione potenziale sul campo piuttosto che una registrazione intracellulare. La giusta quantità di pressione applicata all'elettrodo di registrazione provoca una piccola fossetta senza penetrare l'occhio.
    9. Spegnere tutte le luci per altri 3 min per acclimatare le mosche all'ambiente buio.
    10. Impostare il software di registrazione e iniziare la registrazione del segnale. Se si utilizza una sorgente luminosa alogena con otturatore manuale, accendere la sorgente luminosa con l'otturatore chiuso. Iniziare a registrare il segnale.
    11. Esporre gli occhi di mosca alla luce aprendo e chiudendo l'otturatore ogni 1 s per la durata di 20 s di una singola corsa.
      NOTA: L'accensione/spegnimento della sorgente luminosa alogena può essere controllata manualmente o programmata per diventare automatizzata utilizzando una sorgente luminosa LED bianca. ERG più robusto e affidabile può essere ottenuto utilizzando una fonte di luce alogeno rispetto a un LED a luce bianca, probabilmente a causa dello spettro di luce più ampio emesso dalla fonte di luce alogeno.
    12. Registrare gli ERG di tutte le mosche montate sullo scivolo di vetro. Eseguire eRG da 15 mosche per genotipo per condizione.
      NOTA: Alcuni parametri che possono essere modificati per trovare una condizione che mostra solide differenze tra i cDNA di riferimento e di variante possono includere la temperatura, l'età o le condizioni ambientali (ad esempio, allevati in ciclo luce-scuro o luce/oscurità costante).
    13. Eseguire l'analisi dei dati: confrontare gli ERG dal riferimento, variant e controlli per determinare se esistono differenze. Valutare i dati ERG per le modifiche apportate ai cambiamenti nei dati in relazione ai transitori, al depolorizzazione, ai cambiamenti e alla ripolarizzazione69 (Figura 4B).
      NOTA: La depolarizzazione e la ripolarizzazione riflettono l'attivazione e l'inattivazione della cascata di fototrasduzione all'interno dei fotorecettori, mentre i cambiamenti on e off-transienti sono misure delle attività delle cellule post-sinaptiche che ricevono segnali da fotorecettori. La diminuzione dell'ampiezza e la cinetica alterata della ripolarizzazione sono spesso associate in difetti con la funzione fotorecettore e la salute, mentre i difetti nei mutanti on e off-transienti si trovano nei mutanti con sviluppo di sinapsi difettose, funzione o manutenzione 70.
    14. Dopo l'identificazione delle differenze nei fenotipi ERG con sovraespressione dei cDNA umani di riferimento rispetto alle varianti, determinare se questo fenotipo elettrofisiologico è associato a difetti strutturali e ultrastrutturali nei fotorecettori e nei loro sinapsi eseguendo analisi istologiche e microscopia elettronica di trasmissione.
      NOTA: Un'ulteriore discussione sull'interpretazione dei difetti ERG e l'analisi strutturale/ultrastrutturale è stata descritta in precedenza69.

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Risultati

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Studio funzionale della variante missense de novo in EBF3 collegato ai fenotipi neurosviluppo
In un maschio di 7 anni con fenotipi di neurosviluppo tra cui ipotonia, atassia, ritardo dello sviluppo globale e disturbi del linguaggio espressivo, medici e genetisti umani presso il National Institutes of Health Undiagnosed Diseases Project (UDP) identificato una variante di errore de novo (p.R163Q) in EBF3 (Early B-Cell Factor 3)15, un gene che codifica u...

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Discussione

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Studi sperimentali che utilizzano la Drosophila melanogaster forniscono un robusto sistema di analisi per valutare le conseguenze delle varianti umane associate alla malattia. Ciò è dovuto al grande corpus di conoscenze e ai diversi strumenti genetici che sono stati generati da molti ricercatori nel campo del volo nel corso dell'ultimo secolo89. Proprio come qualsiasi altro sistema sperimentale, tuttavia, è importante riconoscere le avvertenze e le limitazioni che esistono.

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Jose Salazar, Julia Wang e la dottoressa Karen Schulze per la lettura critica del manoscritto. Riconosciamo i dottori Ning Liu e Xi Luo per la caratterizzazione funzionale delle varianti TBX2 discusse qui. Undiagnosed Diseases Network Model Screening Center è stato supportato attraverso il National Institutes of Health (NIH) Common Fund (U54 NS093793). H. T. C. è stato inoltre sostenuto dal NIH[CNCDP-K12 and NINDS (1K12 NS098482)], dall'American Academy of Neurology (Neuroscience Research grant), dal Burroughs Wellcome Fund (Career Award for Medical Scientists), dalla Child Neurology Society and Child Neurology Foundation ( PERF Elterman) e il NIH Director's Early Independence Award (DP5 OD026426). M. F. W. è stato inoltre sostenuto dalla Simons Foundation (Premio SFARI: 368479). S. Y. è stato inoltre sostenuto dalla NIH (R01 DC014932), dalla Simons Foundation (Premio SFARI: 368479), dall'Alzheimer(New Investigator Research Grant: 15-364099), dal Naman Family Fund for Basic Research e dal Caroline Wiess Law Fund for Research in Medicina molecolare. La microscopia confocale al BCM è supportata in parte da NIH Grant U54HD083092 al Nucleo di Neurovisualizzazione dell'Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (IDDRC).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Drosophila Stock per la transgenesi UAS-cDNA umano
Injection ceppi per la transgenesi (D. melanogaster)BDSC#24871Reagente specifico: VK33 (3° cromosoma) Linea di iniezione
Ceppi di iniezione per la transgenesi (D. melanogaster)BDSC#24872Reagente specifico: VK37 (2° cromosoma) Linea di iniezione
DNA plasmidico
Vettore di clonaggioThermo Fisher#12536-017Reagente specifico: pDONR221
Drosophila vettore di transgenesiDono dei dottori Johannes Bischof e Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS)Reagente specifico: pGW-HA.attB
Kit e reagenti per biologia molecolare
AgarosioSigma-Aldrich#A2790Reagente specifico: Agarosio (grado di biologia molecolare)
Cellule chimicamente competenti (E. coli)Thermo Fisher#18265017Reagente specifico: DH5&alfa;
Kit di estrazione del gel di DNAReagente specifico Thermo Fisher#K210012: Kit di estrazione del gel PureLink
Kit di isolamento e purificazione del DNAQiagen#27104Reagente specifico: Kit QIAprep Spin Miniprep
Polimerasi ad alta fedeltàNEB#M0491Reagente specifico: Kit polimerasi Q5
Sistema di clonazione mediato dalla ricombinasiThermo Fisher#11789020Reagente specifico: Kit Gateway BP Clonasi
di clonazione mediato dalla ricombinasiThermo Fisher#11791100Reagente specifico: Kit enzimatico Gateway LR Clonasi II
Kit per mutagenesi diretta al sitoAgilent#200523Reagente specifico: Kit per mutagenesi Quick Change II
Elettroretinogramma Attrezzatura relativa al rig
ERG AnalisiMolecular DevicesN/AReagente specifico: Axon pCLAMP 10 Data Software Package ERG Data
CollectionLabX#R150358 Reagente specifico: Amplificatore biologico isolato ISO-DAM
Reagente ERGAstro-Med#S48Reagente specifico: Stimolatore a impulsi quadrati
Sistema

Riferimenti

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