Viene descritto un metodo enzimatico efficace per l'isolamento delle cellule endoteliali sui porcili primari (pAEC) dai suini in miniatura. I pAEC primari isolati possono essere utilizzati per studiare la risposta immunitaria e di coagulazione nello xenotrapianto.
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Articolo metodologico
Isolamento e cultura delle cellule endoteliali aortiche primarie dai suini in miniatura
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo xenotrapianto è un modo promettente per risolvere la carenza di organi umani per i pazienti con insufficienza d'organo allo stadio finale, e il maiale è considerato una fonte di organo adatta. Il rigetto immunitario e la coagulazione sono due ostacoli principali per il successo dello xenotrapianto. Le lesioni e disfunzioni delle cellule endoteliali (EC) sono importanti per lo sviluppo delle risposte di infiammazione e coagulazione nello xenotrapianto. Pertanto, l'isolamento delle cellule endoteliali aortiniche porcine (pAEC) è necessario per studiare il rigetto immunitario e le risposte di coagulazione. Qui, abbiamo sviluppato un semplice approccio enzimatico per l'isolamento, la caratterizzazione e l'espansione di pAEC altamente purificati da maiali in miniatura. In primo luogo, il maiale in miniatura è stato anestetizzato con chetamina, e una lunghezza di aorta è stata assortata. In secondo luogo, la superficie endoteliale dell'aorta è stata esposta allo 0,005% di collagenasi IV digestiva per 15 min. Terzo, la superficie endoteliale dell'aorta è stata raschiata in una sola direzione con un raschietto cellulare (<10 volte), e non è stata compressa durante il processo di Raschiare. Infine, i pAEC isolati del terzo giorno e dopo il passaggio 1 e il passaggio 2 sono stati identificati dalla citometria di flusso con un anticorpo anti-CD31. Le percentuali di cellule CD31-positive erano rispettivamente del 97,4% , 1,2%, 94,4% , 1,1% e 92,4% - 1,7% (media - SD). La concentrazione di Collagenasi IV, il tempo digestivo, la direzione e la frequenza e l'intensità della raschiatura sono fondamentali per ridurre la contaminazione fibroblasta e ottenere un'elevata purezza e un gran numero di EC. In conclusione, il nostro metodo enzimatico è un metodo altamente effctivo per isolare gli EC dall'aorta di maiale in miniatura, e le cellule possono essere espanse in vitro per studiare le risposte immunitarie e di coagulazione nello xenotrapianto.
Introduzione
La carenza di organi disponibili per i trapianti è un problema eccezionale in tutto il mondo1. Secondo la Croce Rossa della Cina, solo un piccolo numero di pazienti con insufficienza di organi allo stadio finale ha ricevuto un organo adatto in Cina nel 2018.
Lo xenotrapianto è un modo promettente per risolvere il problema della carenza di organi. Gli organi di maiale sono considerati gli organi più adatti per gli esseri umani a causa delle somiglianze anatomiche e fisiologiche2,3. Il fallimento di un xenotrapianto di suino è in gran parte legato al rigetto immunitario dei primati e alle risposte di coagulazione. Le cellule endoteliali dei porcini (EC) sono fondamentali poiché queste cellule sono le prime a interagire con il sistema immunitario dei primati, che include anticorpi, complementi, citochine e cellule immunitarie (ad esempio, cellule T, cellule B e macrofagi)4,5. Le EC suine svolgono un ruolo vitale nell'organodi maiale e nello xenotrapianto 6,7. Pertanto, le EC sono cellule importanti per studiare le risposte di rigetto e coagulazione a un innesto di suini. L'isolamento delle EC su suini di alta qualità è necessario per la ricerca sugli xenotrapianto.
Nel tentativo di isolare le EC da diversi organi (ad esempio, cuore, rene, fegato e aorta), diversi protocolli sono stati segnalati in un'impostazione xenotrapianto8,9,10,11,12. Tuttavia, mantenere una cultura ultrapura dei EC isolati è un problema eccezionale nei protocolli standard. L'aumento della concentrazione della soluzione digerita, il tempo di digestione inappropriato e l'intensità dei graffi possono contribuire all'aumento della contaminazione del fibroblasto negli studi attuali8,10,13. Inoltre, il metodo dei pAEC isolati dai maiali in miniatura è meno studiato. Qui, descriviamo un metodo enzimatico ottimizzato per isolare i pAEC altamente purificati dai maiali in miniatura (Wuzhishan o Bama). Diversi passaggi del protocollo sono stati progettati per ridurre la contaminazione da fibroblasti e ottenere EC ad alta purezza.
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Protocollo
L'uso degli animali è stato approvato dal Comitato di revisione etica dell'Ospedale del Secondo Popolo di Shenzhen, in conformità con i principi del benessere degli animali.
1. Preparazione di animali, medie e tamponi
- Preparare il maiale in miniatura.
NOTA: Tutti i maiali in miniatura erano maiali cinesi Wuzhishan o Bama (maschio). L'età e il peso dei suini erano rispettivamente di 100 giorni , 8 giorni e 5,7 kg , 1,0 kg (media , SD, n - 3). - Preparare il mezzo di coltura: mezzo di cellule endoteliali (ECM) integrato con 10% (v/v) siero bovino fetale inattivato (FBS), 1% (v/v) penicillina / streptomicina (P/S) e 1% (v/v) di crescita del supplemento di cellule endoteliali (ECGS).
- Preparare il buffer di lavaggio: 1x soluzione PBS (pH 7.4) con 1% (v/v) P/S.
- Preparare una soluzione digestiva 0.005% collagenae IV: 1 mg di polvere di collagenae IV in 20 mL di soluzione PBS. Preriscaldare la soluzione digestiva di collagena a 37 gradi centigradi prima della digestione.
- Preparare il buffer di arresto: il mezzo di Ala (DMEM) modificato di Dulbecco integrato con FBS inattivati per il 10% e 1% di P/S.
2. Chirurgia e preparazione per l'isolamento delle cellule endoteliali dei porci
- Disinfettare la sala operatoria con luce UV per 1 h e il liquido medico 84 (il contenuto di cloro disponibile è del 4,0% - 5,0%, tabella dei materiali) prima di eseguire un intervento chirurgico.
- Dopo che il maiale in miniatura ha ricevuto un'iniezione intramuscolare formata da 15 mg/kg di Ketamina, 15 mg/kg di cloruro di Xylazine e 0,05 mg/kg di idrocloruro di Fenacetin( Volumi: 100L/kg, Tabella dei materiali) ( Figura 1A ), confermano l'animale di idrocloruro( Volumi: 100L/kg, Tabella dei materiali ) ( Figura1A), confermano l'animale stato di anestesia con controllo dello stimolo doloroso porcina (ad esempio pizzicare un orecchio o scuotere un anteriore) e indice fisiologico (ad esempio pressione sanguigna, frequenza cardiaca e respiratoria).
NOTA: Un'altra iniezione di mezza dose potrebbe essere somministrata al maiale se mostra i segni di risveglio. - Tagliare l'addome con un bisturi, esporre la vena cava inferiore e di conseguenza iniettare eparina sodio (5.000 U, tavolo dei materiali) nella vena cava inferiore con siringa da 5 mL.
- Cinque minuti dopo, inserire un catetere nell'aorta addominale per sangue, tagliare la pelle del torace e incitare il diaframma con un bisturi e successivamente tagliare il ventricolo sinistro.
NOTA: Assicurarsi che il maiale sia eutanasia controllando l'impulso aortico dopo aver insanguinato e tagliato il cuore. - Accisa le costole con pinze ossee (Tabella dei materiali), ed espongono il cuore e i polmoni. Trova l'aorta posteriore al cuore e ai polmoni e blocca le due estremità. Lavare l'aorta una volta con tampone di lavaggio pre-raffreddato (Figura 1B,C).
- Tagliare l'aorta con le forbici e tenere l'aorta bloccata ad ogni estremità. Accise tessuto in eccesso intorno all'aorta con pinze sterili e forbici. Mettere l'aorta in un tubo di centrifuga di 50 mL, lavare l'aorta con tampone di lavaggio pre-raffreddato 3x (30 mL per lavaggio) e trasferire l'aorta al laboratorio (Figura 1D).
3. Isolamento delle cellule endoteliali aortiche porcine
- In condizioni asettiche, togliere l'aorta di maiale dal buffer di lavaggio e posizionarlo su un piatto Petri da 150 mm (Figura 2A).
- Tagliare delicatamente le due estremità dell'aorta e le accise in eccesso di tessuto intorno all'aorta con pinze sterili e forbici di nuovo (Figura 2B). Lavare l'esterno e l'interno dell'aorta (sopra il piatto di coltura a temperatura ambiente) con 20-50 mL di tampone di lavaggio.
NOTA: Cercare di tagliare solo l'area in cui sono stati posizionati i morsetti durante l'intervento chirurgico poiché alcune EC sono state danneggiate in questa zona e rimuovere i tessuti in eccesso e i rami laterali arteriosi. - Passare una sutura chirurgica attraverso l'aorta e poi legare un'estremità dell'aorta utilizzando la sutura chirurgica (5-0, 90cm, Tabella dei materiali). Mantenere la sutura chirurgica all'interno dell'aorta (Figura 2C,D).
- Fissare delicatamente l'aorta vicino all'estremità legata con pinze, quindi tirare lentamente la sutura chirurgica per invertire l'aorta fino a quando la superficie endoteliale dell'aorta è esposta (Figura 2E-G).
NOTA: Assicurarsi di fissare l'aorta vicino all'estremità legata e non fissare l'aorta ermeticamente, altrimenti l'aorta non può essere invertita tirando la sutura chirurgica. - Lavare la superficie endoteliale dell'aorta con il tampone di lavaggio 3x (10 mL per lavaggio), quindi scartare questa soluzione. Mettere l'aorta in un tubo di centrifuga di 15 mL e coprire l'aorta con 10 mL di 0,005% soluzione digestiva collagenae IV nel tubo (Figura 2H).
NOTA: Preriscaldare la soluzione digestiva di collagenasi IV dello 0,005% a 37 gradi centigradi prima della digestione. - Incubare a 37 gradi centigradi per 15 min. Mettere l'aorta digerita e la soluzione digestiva in un piatto di coltura di 100 mm e fermare gli effetti di 0,005% collagenasi IV con l'aggiunta di 10-15 mL di cuscinetto di arresto pre-raffreddato.
NOTA: il tempo di digestione consigliato è compreso tra 10 e 20 minuti. Assicurarsi che la superficie endoteliale dell'aorta sia coperta dal buffer di arresto. - Raschiare delicatamente i pAEC dalla superficie interna dell'aorta utilizzando un raschietto cellulare (Figura 2I). Lavare l'aorta raschiata 3x con tampone di lavaggio (5 mL per volta). Mettere la soluzione dal piatto di coltura in un tubo di centrifuga 50 mL. Lavare il fondo della coltura piatto 2x con tampone di lavaggio (5 mL per volta), e mettere la soluzione in un tubo di centrifugazione 50 mL di nuovo.
NOTA: Raschiare in una direzione delicatamente e non comprimere. Non toccare il tessuto vicino ai bordi e ai fori. Si raccomanda un raschio da 5-8x. - Centrifugare il tubo a 600 x g per 6 min a 4 gradi centigradi. Scartare il supernatante e lasciare 10 mL di soluzione sul fondo di un tubo di centrifuga 50 mL. Aggiungere 20 mL di buffer di lavaggio al tubo centrifuga da 50 mL e sospendere nuovamente i pellet. Evitare le bolle durante questa fase.
- Centrifuga a 600 x g per 6 min a 4 gradi centigradi. Scarta lentamente il super-natante. Risospendere i pellet cellulari con 1 mL di mezzo di coltura e mescolare bene.
NOTA: Il numero medio di EC per cm aorta è 1,9 x 105 x 1,4 x 104 (media : SD, n - 3). - Contare le celle con un contatore di celle. Piastra e coltura le cellule in un vaso senza rivestimento di alcun materiale in base al numero di cellulare. Se il numero di cella è minore o uguale a 1,0 x 106, le celle di coltura in un pallone da 25 cm2. Se il numero di cella è maggiore di 1,0 x 106, le cellule di coltura in diversi flaconi 25 cm2 (1,0 x 106 celle per fiaschetta). Posizionare il pallone in un'incubatrice (senza agitare) a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 e sostituire il mezzo ogni 2/3 giorni.
NOTA: Alcune celle sono danneggiate dal raschiatore cellulare. Un saggio di fattibilità cellulare ha rilevato che la percentuale di cellule vive è del 95,7% : 1,7% (media : SD, n - 3). Il tempo di raddoppio delle cellule isolate è di circa 1/2 giorni.
4. Raccolto e caratterizzazione delle cellule endoteliali pure
- Lascia che le cellule crescano per circa 4/5 giorni. Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza (Figura 3A), digerire le cellule con 0,25% trypsin e passare le cellule. Quindi, raccogliere alcune delle cellule isolate (Giorno 3, Passaggio 1 e Passaggio 2) e identificare dalla citometria di flusso (con un anticorpo anti-CD31).
- Etichetta pAEC isolati (numero di cellule: 1 x 105) (Giorno 3, Passaggio 1 e Passaggio 2) con anticorpo coniugale anti-porcina anti-porcina a 4 gradi centigradi per l'analisi della citometria di flusso.
- Cancello popolazione totale di cellule vive con un terreno sparso in avanti, campione incontaminato come controllo negativo. Poi presenta le cellule positive CD31 delle cellule gated con istogramma.
NOTA: l'efficacia delle cellule CD31-positive è del 97,4% , pari rispettivamente all'1,2% (giorno 3), al 94,4% (P1) e al92,4% (P2) (media - SD).
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Risultati
Il nostro metodo mira a fornire un modo efficace per isolare le EC altamente purificate dalle aorte dai maiali in miniatura. Il processo di chirurgia dell'aorta è illustrato nella figura 1. Il primo passo è che l'intera aorta viene espulsa dal maiale. Prevenire altre cellule o contaminazioni batteriche è molto importante. Pertanto, non ferire altri organi o tessuti nel caso in cui cellule o batteri non bersaglio contaminano l'aorta e lavano l'aorta con buffer di lavaggio pre-raffreddato 3x (...
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Discussione
Le cellule endoteliali sono comunemente utilizzate nella ricerca di disfunzione vascolare, diabete, rigenerazione tissutale, trapianto e cancro14,15,16,17,18. Per comprendere e caratterizzare la biologia e la funzione delle EC in queste malattie, sono stati riportati numerosi metodi per isolare le EC di diversi organi o tessuti malati8<...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Natural Science Foundation of Guangdong Province, Grant/Award Number: 2016A030313028; Medical Scientific Research Foundation della provincia del Guangdong, numero di sovvenzione/premio: B2018003; Shenzhen Foundation of Science and Technology, Numero di sovvenzione/premio: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJ-201703141713575556, JCYJ20160425103000011 e JCYJ2016042814204444545455 Shenzhen Longhua District Foundation of Science and Technology, Numero di sovvenzione/premio: 2017013; National Key R&D Program of China, Numero Grant/Award: 2017YFC1103704; Sanming Project of Medicine in Shenzhen, Numero di sovvenzione/premio: S201412020; Fondi speciali per la costruzione di ospedali di alto livello nella provincia del Guangdong (2019); Fondo per la costruzione di discipline mediche di alto livello di Shenzhen, numero di sovvenzione/premio: 2016031638; Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission, Grant/Award Number : S'XJ2017021 e S-XJ2018059. Ringraziamo Hancheng 'hang e 'hicheng 'ou dell'Università di Shenzhen per aver assistito nella preparazione del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Pechino HeLi KeChuang Technology Development CO., Ltd. Cina | HL-YGQ | |
| SIRINGA monouso BOON (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. Cina | ||
| CD31-FITC anticorpo | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Raschietto cellulare | Corning | 3010 # | |
| Collagenasi IV | Sigma-Aldrich | C5138 # -1G | |
| Composto ketamina iniezione | Fabbrica farmaceutica veterinaria di Shenyang, Cina | ketamina cloridrato?0,3 g / 2 ml, xilazina cloridrato: 0,3 g / 2 ml, fenacetina cloridrato? 1 mg / 2 ml | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-fenilidolo, dicloridrato) | Life Technologies | D1306 # | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118 # | |
| ECM | Sciencell | 1001 # | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Microprovetta con tappo a scatto (1,5 ml) | AXYGEN | MCT-150-C # | |
| Falcon 100mm Piatto per colture cellulari | Corning | 353003 # | |
| Siero fetale bovino | GIBCO | 10270-106 # | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Pincipe | ShangHai medical instruments Co., Ltd.China | ||
| Eparina sodica | Jiangsu WanBang biofarmaceutica Co., Ltd.Cina | ||
| Tintura di iodio | Guilin LiFeng Medical Supplies Co., Ltd.China | ||
| Maiale in miniatura (Bama o Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, Cina | ||
| Microscopio Mshot... | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicillina/Streptomicina | Life Technologies | 15070063# | |
| Pallone rettangolare per colture cellulari a collo inclinato con tappo di sfiato ? T25? | Corning | 3289 # | |
| Forbici | ShangHai strumenti medici Co., Ltd.China | ||
| Pipette di trasferimento sierologico (10 ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Pipetta sterile Pasteur | GeneBrick | GY0025 # | |
| Filtro siringa sterile (0,22 & micro; m) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Bisturi chirurgico | ShangHai medical instruments Co., Ltd.China | 22# | |
| Sutura chirurgica | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Siringa?5mL? | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0,25%), fenolo rosso | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Alcool medico | Guilin LiFeng Medical Supplies Co., Ltd.China | ||
| 20 x PBS soluzione (pH 7,4, senza nucleasi) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Disinfettante medico 84 liquido | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottiglia |
Riferimenti
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