Articolo metodologico

Micromanipolazione delle cellule tumorali circolanti per l'analisi molecolare a valle e la valutazione del potenziale metastatico

DOI:

10.3791/59677

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14 maggio 2019

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1Cancer Metastasis Laboratory, Department of Biomedicine, University of Basel and University Hospital Basel, 2SIB Swiss Institute of Bioinformatics

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo un flusso di lavoro integrato per identificare le caratteristiche fenotipiche e molecolari che caratterizzano le cellule tumorali circolanti (CTC). Combiniamo l'immunocolorazione dal vivo e la micromanipolazione robotica di CTC singoli e cluster con tecniche a singola cellula per l'analisi a valle e la valutazione dell'abilità di metastasi-semina.

Abstract

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La metastasi ematica rappresenta la maggior parte dei decessi correlati al cancro e coinvolge le cellule tumorali circolanti (CTC) che hanno successo nella creazione di nuovi tumori in siti lontani. I CTC si trovano nel flusso sanguigno dei pazienti come cellule singole (CTC singole) o come aggregati multicellulari (cluster CTC e cluster di globuli bianchi CTC), con questi ultimi che mostrano una maggiore capacità metastatica. Oltre all'enumerazione, l'analisi fenotipica e molecolare è straordinariamente importante per dissezionare la biologia CTC e per identificare le vulnerabilità perseguibili. Qui, forniamo una descrizione dettagliata di un flusso di lavoro che include l'immunocolorazione CTC e la micromanipolazione, la cultura ex vivo per valutare le capacità proliferativa e di sopravvivenza delle singole cellule e i saggi in vivo di formazione di metastasi. Inoltre, forniamo un protocollo per raggiungere la dissociazione dei cluster CTC in singole celle e l'analisi dell'eterogeneità intra-cluster. Con questi approcci, per esempio, quantifichiamo con precisione la sopravvivenza e il potenziale proliferativo dei singoli CTC e delle singole cellule all'interno dei cluster CTC, che ci portano all'osservazione che le cellule all'interno dei cluster mostrano una migliore sopravvivenza e proliferazione in ex rispetto ai singoli CTC. nel complesso, il nostro flusso di lavoro offre una piattaforma per dissezionare le caratteristiche dei CTC a livello di singola cellula, puntando all'identificazione di percorsi rilevanti per la metastasi e a una migliore comprensione della biologia CTC.

Introduzione

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La manifestazione clinica della metastasi negli organi distanti rappresenta la fase finale della progressione del cancro e costituisce oltre il 90% dei decessi correlati al cancro1. La transizione dalla malattia localizzata a quella metastatica è un processo a più fasi, spesso mediato da cellule tumorali circolanti (CTCs)2,3,4. Queste cellule sono sparate dal tumore primario nella circolazione sanguigna e vengono trasportate in organi distanti, dove possono stravasare e stabilire lesioni metastatiche5,

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Protocollo

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Tutte le procedure che coinvolgono i campioni di sangue dei pazienti sono state eseguite previo consenso informato dei partecipanti. Le procedure sono state eseguite secondo i protocolli EKNZ BASEC 2016-00067 e EK 321/10, approvati dal comitato di revisione etico-istituzionale (Commissione etica nord-occidentale/Svizzera centrale [EKNZ]), e in conformità con la dichiarazione di Helsinki.

Tutte le procedure relative agli animali sono state eseguite nel rispetto delle direttive istituzionali e cantonali (protocollo approvato del mouse #2781, ufficio veterinario cantonale di Basilea città).

1. preparazione del campion....

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Risultati

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Il flusso di lavoro presentato consente la preparazione di singoli CTC, sia da singoli CTC che separati da cluster CTC. I CTC di pazienti o topi affetti da tumore sono arricchiti da sangue intero con metodi di arricchimento CTC disponibili e poi macchiati con anticorpi contro marcatori associati al cancro (ad esempio, EpCAM, verde) e marcatori specifici di WBC (ad esempio, CD45, rosso) (Figura 1a ). Il prodotto CTC macchiato viene poi trasferito alla stazione.......

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Discussione

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La caratterizzazione molecolare dei CTC contiene la promessa di migliorare la nostra comprensione del processo metastatico e di guidare lo sviluppo di nuove terapie anti-metastasi. Qui forniamo una descrizione dettagliata di quei protocolli che consentono la micromanipolazione CTC e l'analisi a valle, compresi i saggi funzionali basati su singola cellula, l'analisi dell'espressione genica e il trapianto in vivo per il potenziale metastatico valutazione20.

Tra l.......

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Dichiarazioni

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N.A. e BMS sono elencati come inventori nelle domande di brevetto che riguardano le cellule tumorali circolanti e il trattamento del cancro. N.A. è un consulente a pagamento per le aziende farmaceutiche e assicurative con un interesse per la biopsia liquida.

Ringraziamenti

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Ringraziamo tutti i pazienti che hanno donato il sangue per il nostro studio, così come tutti i medici coinvolti e gli infermieri di studio. Ringraziamo Jens Eberhardt, Uwe Birke e Dr. Katharina Uhlig di ALS Automated Lab Solutions GmbH per il supporto continuo. Ringraziamo tutti i membri del laboratorio aceto per il feedback e le discussioni. La ricerca nel laboratorio di aceto è sostenuta dal Consiglio europeo della ricerca, dall'Unione europea, dalla Fondazione Nazionale Svizzera per la scienza, dalla Lega Svizzera per il cancro, dalla lega di cancro di Basilea, dai due Cantoni di Basilea attraverso il Politecnico federale di Zurigo e dall'Università di Basilea.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tecnologia di segnalazione cellulareEpCAM-AF488 anti-umanoCST5198clone: VU1D9
1X DPBSInvitrogen14190169senza calcio, senza magnisio
Piastra di fissaggio a 6 pozzettiCorning3471
Anti-umano CD45-BV605Biolegend304041clone: HI30
Anti-umano EGFR-FITC Clonedi GeneTex GTX11400: ICR10
Anti-umano HER2-AF488 Clone di Biolegend324410: 24D2
Anti-mouse CD45-BV605Clone di 103139 Biolegend: 30-F11
BD Vacutainer K2EDTABD366643per la raccolta di sangue umano
Unità centrale Cell CelectorALSCC1001 
Software CellDALSversione 3.0
Cultrex PathClear Fattore di crescita ridotto BME, Tipo 2R& D Systems3533-005-02
Microprovetta 1,3 mL K3EDTASarstedt41.3395.005per provette PCR per prelievo di sangue nel topo
CorningPCR-02-L-C
RLT PlusQuiagen1053393
SUPERase  In inibitore della RNasiThermo FisherAM2696  1 U/µ L 

Riferimenti

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  1. Talmadge, J. E., Fidler, I. J. AACR centennial series: the biology of cancer metastasis: historical perspective. Cancer Research. 70 (14), 5649-5669 (2010).
  2. Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168

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Tag

Tecnica di micromanipolazioneisolamento delle CTCprelievo di singole cellulecluster di CTCcoltura ex vivometastasi in vivodissociazione delle CTCeterogeneit intra clustersequenziamento dell RNA di singola cellula

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