Articolo metodologico

Un ormone e mezzo umano (PBMC) Un modello di Xenotrapianto umanizzato per la ricerca sull'immuno-oncologia traslazionale (I-O)

DOI:

10.3791/59679

⸱

15 agosto 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1BeiGene (Beijing) Co., Ltd.

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Descriviamo una cellula mononucleare del sangue periferico umano (PBMC), basato sul modello murino xenotrapianto umanizzato per la ricerca sull'immuno-oncologia traslazionale. Questo protocollo potrebbe servire come linea guida generale per stabilire e caratterizzare modelli simili per la valutazione della terapia I-O.

Abstract

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La scoperta e lo sviluppo della terapia immuno-oncologica (I-O) negli ultimi anni rappresenta una pietra miliare nel trattamento del cancro. Tuttavia, le sfide del trattamento persistono. Modelli animali robusti e rilevanti per le malattie sono risorse vitali per la continua ricerca e sviluppo preclinico al fine di affrontare una serie di ulteriori punti di controllo immunitari. Qui, descriviamo una cellula mononucleare del sangue periferico umano (PBMC), basato sul modello di xenotrapianto umanizzato. BGB-A317 (Tislelizumab), un anticorpo umanosa sperimentale anti-PD-1 nello sviluppo clinico in fase avanzata, viene utilizzato come esempio per discutere la configurazione della piattaforma, la caratterizzazione del modello e le valutazioni di efficacia dei farmaci. Questi topi umanizzati supportano la crescita della maggior parte dei tumori umani testati, consentendo così la valutazione delle terapie I-O nel contesto dell'immunità umana e dei tumori umani. Una volta stabilito, il nostro modello è relativamente conveniente e conveniente, e di solito produce risultati altamente riproducibili. Suggeriamo che il protocollo descritto in questo articolo potrebbe servire come linea guida generale per stabilire modelli murini ricostituiti con PBMC umano e tumori per la ricerca I-O.

Introduzione

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L'immuno-oncologia (I-O) è un campo di trattamento del cancro in rapida espansione. I ricercatori hanno recentemente iniziato ad apprezzare il potenziale terapeutico di modulare le funzioni del sistema immunitario per attaccare i tumori. I blocchi dei checkpoint immunitari hanno dimostrato attività incoraggianti in una varietà di tipi di cancro, tra cui melanoma, carcinoma a cellule renali, testa e collo, polmone, vescica e tumori della prostata1,2. Contrariamente alle terapie mirate che uccidono direttamente le cellule tumorali, le terapie I-O potenziano il sistema immunitario del corpo per attaccare i tumori3.

Ad oggi, sono stati istituiti numerosi modelli animali I-O pertinenti. Questi includono: 1) linee cellulari tumorali del topo o tumore ominofotra nei topi sinogenici; 2) tumori spontanei derivati da topo geneticamente ingegnerizzato (GEM) o induzione cancerogena; 3) GEM chimerici con l'abbattimenti di bersagli di droga umana in un sistema immunitario murino funzionale; e 4) topi con immunità umana ricostituita trapiantati con cellule tumorali umane o xenograforiti derivati dal paziente (PDX). Ognuno di questi modelli hanno evidenti vantaggi e limitazioni, che sono stati descritti e rivisti ampiamente altrove4.

La ricostituzione dell'immunità umana nei topi immunodeficienti è stata apprezzata come approccio clinicamente rilevante per la ricerca I-O traslazionale. Questo è di solito ottenuto attraverso 1) innesto di cellule immunitarie adulte (ad esempio, cellule mononucleari del sangue periferico (PMBC))5,6, o 2) innesto di cellule staminali ematopoietiche (HSC) da, ad esempio, sangue cordonale ombelicale o fetale fegato7,8. Questi topi umanizzati potrebbero sostenere la crescita dei tumori umani, consentendo così la valutazione delle terapie I-O nel contesto dell'immunità umana e dei tumori umani. Nonostante i vantaggi, le applicazioni dei topi umanizzati nella ricerca I-O sono state solitamente ostacolate da diverse preoccupazioni, come lunghi tempi di sviluppo del modello e costi notevolmente elevati.

Qui, descriviamo un modello umano basato su PBMC che potrebbe essere ampiamente applicato per gli studi I-O traslazionali. Questo modello è relativamente conveniente e conveniente con un'elevata riproducibilità negli studi di efficacia. È stato utilizzato internamente per le valutazioni di diverse terapie I-O attualmente in fase di sviluppo preclinico e clinico. BGB-A317 (Tislelizumab), un anticorpo umanoso sperimentale anti-PD-19 , viene utilizzato come esempio per discutere lo sviluppo del modello, la caratterizzazione e le possibili applicazioni per le analisi di efficacia anti-tumorale.

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Protocollo

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Tutte le procedure eseguite negli studi che hanno coinvolto partecipanti umani erano conformi agli standard etici di BeiGene e/o comitato nazionale di ricerca e con la dichiarazione di Helsinki del 1964 e le sue successive modifiche o norme etiche comparabili. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i singoli partecipanti inclusi nello studio. Tutte le procedure eseguite negli studi riguardanti animali sono state approvate dall'Internal Review Board di BeiGene. Questo protocollo è stato specificamente modificato per la valutazione del BGB-A317 (Tislelizumab) in topi UMD/SCID umanizzati.

1. Istituzione del modello umano basato su PBMC

  1. Mieloablazione dei topi NOD/SCID che utilizzano ciclofosfamide: determinazione delle dosi ottimali
    1. Acquista topi femmina NOD/SCID (6-8 settimane).
      NOT: Tutti i topi coinvolti in questo studio erano di sesso femminile.
    2. Preparare la ciclofosfore (CP) a dosi diverse (50, 100 e 150 mg/kg) in salina. Preparare il disulfiram (DS) in 0,8% Tween-80 in salina a 125 mg/kg.
      NOTA: diverse concentrazioni di CP sono state preparate per consentire la somministrazione di pari volumi di soluzione farmacologica ai topi che ottengono diverse dosi di CP.
    3. Trattare gli animali con CP (i.p.) e DS (p.o.) una volta al giorno per 2 giorni. Dare DS (p.o.) 2 h dopo ogni dose di CP.
      NOT: DS diminuisce l'urotossicità della CP nei topi, e CP combinato con DS è stato suggerito di avere neutropenia più duratura rispetto agli animali trattati con CP da solo10 Il regime di dose di CP potrebbe essere necessario pre-determinato prima di studi effettivi e si è scoperto che varia leggermente tra diversi ceppi di topo immunodeficienti.
    4. Raccogliere campioni di sangue dal seno venoso orbitale e trasferire ai tubi rivestiti EDTA-K sul ghiaccio il giorno 0 (1 h prima della dose di 1st), giorno 2 (24 h dopo la dose 2nd) e giorno 4 (72 h dopo la dose di 2nd).
    5. Esaminare l'effetto di mieloablazione dopo il trattamento CP e DS da parte di FACS. Utilizzare ratto anti-topo CD11b (M1/70), ratto anti-topo Ly6C (HK1.4, ) e ratto anti-topo Ly6G (1A8) per gating CD11b- Ly6Galto come neutrofili, CD11b-Ly6Calto come monociti11,12.
    6. Registrare il peso corporeo e le condizioni di salute dei topi ogni giorno per una settimana. La dose ottimale di CP e DS è determinata come il regime che si traduce nel massimo esaurimento di neutrofili e monociti senza causare una grave tossicità ai topi.
  2. Trapianto di PBMC umano e innesto tumorale: set-up del modello
    1. Isolare i PBMC salvici umani da donatori sani per centricizione del gradiente di densità secondo le istruzioni del produttore.
    2. Pretrattare i topi con CP e DS come indicato al punto 1.1.2 e 1.1.3 per aumentare l'efficienza dei trapianti.
    3. 20 a 24 h dopo la seconda dose di CP e DS, iniettare la linea cellulare tumorale umana come le cellule A431 (ATCC, 2,5 x 106) e 5 x 106 PBMC isolati (mescolato in un totale di 200L -fosfato-buffered saline (PBS) contenente il 50% Matrigel) , o frammenti tumorali (3 x 3 x 3 mm3, in un volume totale di 200 PBS contenenti il 50% di Matrigel) e 200 -L di 5 x 106 PBMC (100 ll'L ciascuno a sinistra e a destra del frammento tumorale innestato) (s.c.) sottocutaneamente nel fianco destro degli animali.
    4. Misurare il volume primario del tumore e registrare due volte a settimana per 4-6 settimane.
      NOT: I topi saranno eutanasia una volta che i loro pesi corporei perdono oltre il 20% o il loro volume tumorale raggiunge 2.000 mm3 o il tumore è ulcerato.
    5. Eutanasia i topi in camere a gas con anidride carbonica. Raccogliere tutti i tessuti tumorali in topi sacrificati con forbici oftalmiche ed elaborarli per l'analisi istologica e immunoistochimica (IHC). Esaminare le espressioni Human CD8, PD-1 e PD-L1 in questi tessuti. Vedere il passaggio 4 del protocollo.

2. Schermo del donatore PBMC

  1. Visualizzate lo schermo di un gruppo di donatori PBMC a causa delle variazioni previste derivanti dai PBMC raccolti da individui. Utilizzare le cellule A431 in co-iniettamento con PBMC di donatori diversi secondo le procedure indicate dal punto 1.2.
    NOT: Oltre 50 donatori PBMC sani sono stati sottoposti a screening nello studio per ottenere un numero sufficiente di donatori idonei. I ricercatori che desiderano adottare questo protocollo potrebbero decidere autonomamente quanti donatori pbMC sani devono essere sottoposti a screening, sulla base della progettazione degli studi pianificati.
  2. Monitorare il volume del tumore due volte a settimana misurando con una pinza.
    NOT: Il tasso di crescita del tumore può variare con PBMC da diversi donatori.
  3. Raccogliere i tessuti tumorali ad un volume medio di 200-500 mm3 e elaborarli per l'analisi istituiologia e immunoistochimica (IHC). Esaminare le espressioni umane CD8, PD-1 e PD-L1. Vedere il passaggio 4 per il protocollo dettagliato.
  4. Selezionare i donatori PBMC che provocano una crescita moderata del tumore (volume tumorale > 200 mm3 14 giorni dopo l'inoculazione) e espressioni PD-1, PD-L1 e CD8 relativamente alte (punteggi iHC significati > 2). Vedere il passaggio 4 per il protocollo di punteggio IHC dettagliato.

3. Linea cellulare del cancro umano e schermo PDX

  1. Linee cellulari dello schermo e PDX secondo le procedure indicate nel passaggio 1.2, per valutare il tasso di crescita del tumore, espressione umana PD-L1 dei tumori e infiltrazioni di cellule immunitarie.
    NOT: Gli autori hanno esaminato oltre 30 linee cellulari di cancro umano e oltre 20 PDX di diversi tipi di cancro. I dati dei modelli tumorali selezionati sono stati mostrati nella sezione dei risultati.

4. Immunoistochimica (IHC)

  1. Raccogliere come indicato dal punto 1.2.5 e fissare i tessuti tumorali immergendosi nella formalina. Disidratare e incorporare tessuti fissi in paraffina. Sezionare i tessuti fissi a 3 m e metterli su vetrini rivestiti in polilisina.
  2. Deparaffinizzare negli xileni tre volte 7 min ciascuno. Idratare le sezioni attraverso alcoli graduati: 100% etanolo due volte per 3 min ciascuno, seguito da 90%, 80% e 70% etanolo a sua volta per 3 min ciascuno. Risciacquare da deionizzato H2O tre volte e rimuovere il liquido in eccesso dai vetrini.
  3. Eseguire il recupero dell'antigene inserendo i vetrini in un contenitore e coprire con 10 mM di tampone di citrati di sodio (pH 6.0) o Tris-EDTA (pH 9.0). Riscaldare il contenitore dei vetrini a microonde per 3 min. Far bollire in un bagno d'acqua a 95 gradi centigradi per 30 minuti e poi raffreddare a temperatura ambiente. Risciacquare da deionizzato H2O tre volte e aspirare liquido in eccesso dai vetrini.
  4. Bloccare le sezioni del 3% di albumina di siero bovino in PBS per 1 h e 0,3% H2O2 soluzione in PBS per 10 min. Stain da anticorpi contro l'uomo CD8 (EP334), PD-1 (NAT105,) e PD-L1 (E1L3N) a 4 gradi centigradi, e HRP ha jugated 2nd antibodies a RT per 1 h. Far cadere il DAB del substrato (3,3'-diaminobenzidina) sui vetrini e controllare il tempo di reazione (secondi a minuti) monitorando il colore marrone dal microscopio.
  5. Coprire i vetrini con balsamo neutro dopo aver immerso i vetrini in alcool acido cloridrico dello 0,5% e 0,5% di acqua ammoniaca a sua volta per 5 s ciascuno, quindi in 80%, 90% e 100% etanolo in sequenza per 3 min ciascuno, e infine in xilene utilizzando tre modifiche per 5 min ciascuno. Rilevare gli anticorpi osservando il colore marrone del DAB al microscopio.
    NOT: L'espressione umana CD8 e PD-1 sui leucociti infiltrati da tumori (TIL) è stata valutata assegnando un punteggio di espressione su una scala di 5 punti (punteggio IHC, intervallo 0-4) con un ingrandimento obiettivo elevato (20x, 40x). 0, assente; 1, intensità debole / meno del 20% di cellule; 2, intensità da debole a moderata/ 20%-50% cellule; 3, intensità da moderata a forte/ 50%-80% cellule; 4, forte intensità / più di 80% cellule. La colorazione umana PD-L1 all'interno delle cellule tumorali è stata valutata utilizzando un sistema di punteggio regolato su una scala di 5 punti (punteggio IHC, intervallo 0-4) a causa del suo segnale relativamente diffuso. 0, assente; 1, intensità debole / meno del 10% di cellule; 2, intensità da debole a moderata/10%-30% cellule; 3, moderata/ 30%-50% cellule; 4, forte intensità / più del 50% di cellule.

5. In Vivo efficacia e studi di farmacodinamica in modelli umanizzati PBMC-NOD/SCID Xenograft

  1. Pre-trattare i topi NOD/SCID come indicato dal punto 1.1.3. In breve, trattare i topi con 100 mg/kg CP (i.p.) e 125 mg/kg DS (p.o.) una volta al giorno per 2 giorni.
  2. 20 a 24 h dopo la seconda dose, iniettare sottocutaneamente (s.c.) con il numero indicato di cellule tumorali umane e 2,5-5 x 106 PBMC (un totale di 200 - miscela di cellule L nel 50% Matrigel) nel fianco anteriore destro degli animali.
    NOT: Il numero di PBMC utilizzati per ogni singolo topo in un singolo studio dovrebbe essere lo stesso. Tuttavia, a causa delle variazioni nella disponibilità di PBMC completamente isolato al momento di ogni studio, gli autori hanno scelto di utilizzare 2,5 x 106, 4 x 106o 5 x 106 PBMC in diversi studi. Anche se questa differenza di due volte nella quantità somministrata di PBC potrebbe influenzare il grado di umanizzazione, gli autori non osservano differenze significative nella valutazione degli effetti anti-tumorali delle immunoterapie testate.
  3. Per l'innesto di PDX, iniettare frammenti tumoralisottocutaneamente (3 x 3 x 3 mm 3) nel fianco anteriore destro degli animali. Iniettare sottocutaneamente 200 luna di 5 x 106 PBMC (100 gradi l per lato) a sinistra ea destra del frammento tumorale innestato.
    NOT: I tessuti tumorali PDX sono stati somministrati in una soluzione Matrigel, come descritto per i modelli di linea cellulare.
  4. Il giorno dell'inoculazione cellulare, raggruppare casualmente gli animali e trattare come il protocollo di studio previsto.  Valutare l'attività anti-tumorale dei farmaci candidati, BGB-A317 (QW, i.p.) in questo caso, alle dosi indicate in vari modelli tumorali.
    NOT: Le tre linee cellulari del cancro umano (ad esempio, A431 (carcinoma epidemoid), SKOV3 (cancro ovarico) e SK-MES-1 (cancro del polmone)), così come due modelli PDX (cioè BCLU-054 (cancro al polmone) e BCCO-028 (cancro del colon)), sono considerati buoni modelli tumorali per la terapia I-O valutazione in questo modello murino umanizzato.
  5. Misurare il volume del tumore primario due volte alla settimana, utilizzando una pinza.
    NOT: Perdita di pesi corporei Gand sono stati osservati intorno 4-6 settimane post innesto PBMC nei nostri studi, permettendo una finestra di 1-2 mesi per valutazioni di efficacia terapeutica.
  6. Per l'analisi farmacodinamica delle cellule immunitarie infiltrate da tumore, tagliare i tessuti tumorali in piccoli pezzi e digerirli con tipo di collagenae I (1 mg/mL) e DNase I (100 g/mL) in RPMI1640 più il 5% del siero bovino fetale (FBS) per 30 min a 37 . Passare i tessuti digeriti attraverso ceppi cellulari da 40 m per ottenere sospensioni a cella singola.
  7. Lavare le cellule e regolare il numero di cellule ad una concentrazione di 1 x 107 celle / mL nel buffer FACS freddo ghiaccio (PBS, 1% FBS) in piastre inferiori rotonde 96-pozzo. Lavare le cellule centrifugiandole e bloccarle aggiungendo 20 G/mL di Ig umano per 30 min, seguito dalla colorazione con anticorpi anti-umani CD3 (HIT3a), CD8 (OKT8) e PD-1 (MIH4) a 4 gradi centigradi per 30 min. Quindi sottomettere i campioni macchiati a flusso di citometria e analizzare utilizzando guavaSoft 3.1.1.

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Risultati

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Seguendo le procedure qui presentate, è stato stabilito con successo un modello di xenotrapianto umanizzato basato su PBMC. In breve, gli effetti di mieloablazione CP nei topi NOD/SCID sono stati determinati dall'analisi della citometria di flusso delle popolazioni di neutrofili e monociti dopo il trattamento cp e DS (Figura 1). 100 mg/kg CP più 125 mg/kg DS è stato determinato come la dose ottimale e utilizzato negli studi successivi come il regime si traduce nel massimo esaurimento di neut...

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Discussione

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La nostra conoscenza dello sviluppo e della progressione del cancro è progredita in modo significativo negli ultimi anni, con particolare attenzione a una comprensione completa sia delle cellule tumorali che del suo stroma associato. Sfruttare i meccanismi immunitari ospiti potrebbe indurre un maggiore impatto sulle cellule tumorali, rappresentando una promettente strategia di trattamento. I modelli Murine con sistema immunitario murino intatto, come i modelli singenici e GEM, sono stati ampiamente utilizzati per studiar...

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Dichiarazioni

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Tutti gli autori hanno interesse di proprietà in BeiGene. Tong e Kang Li sono inventori di un brevetto che copre BGB-A317 descritto in questo studio.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo i membri dei nostri laboratori per discussioni utili. Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dal Biomedical and Life Science Innovation and Cultivation Research Program della Commissione Municipale di Scienza e Tecnologia di Pechino nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. -151100003915070 (progetto "Studio clinico su un nuovo farmaco antitumorale oncologico BGB-A317"), ed è stato anche parzialmente supportato da finanziamenti aziendali interni per la ricerca preclinica.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Separazione PBMC /coltura cellulare
Histopaque-1077Sigma10771Isolamento cellulare
DMEMCorning10-013-CVRColtura cellulare
DPBSCorning21-031-CVRColtura cellulare
FBSCorning35-076-CVColtura cellulare
Penicillina-Streptomicina,Gibco15140-163Coltura cellulare
Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenoloGibco25200-114Coltura cellulare
MatrigelCorning356237Inoculazione CDX
FACS
Desossiribonucleasi I da pancreas bovinoSigmaDN25Campione preparazione
Collagenasi Tipo ISigmaC0130Preparazione del campione
Anticorpo anti-topo/umano CD11b (M1/70)BioLegend101206FACS
Anticorpo anti-topo Ly-6C (HK1.4) BioLegend128008FACS
Anti-topo Ly-6G (1A8) anticorpoBioLegend127614FACS
Anti-umano CD8 (OKT8)Anticorpo Sungene BiotechH10082-11HFACS
Anticorpo CD279 (MIH4) anti-umanoeBioscience12-9969-42FACS
Anti-umano CD3 (HIT3a) anticorpo4A Biotech--FACS
Guava easyCyte 8HT Citometro a flusso da bancoMillipore0500-4008FACS
strong>Tumor/PDX impianto/dosaggio/misurazione
CiclofosfamideJ& KCat#419656, CAS#6055-19-2Efficacia in vivo
DisulfiramJ& KCat#591123, CAS#97-77-8Siringa di efficacia in vivo
BD300841Inoculazione CDX
Aghi ipodermici (14 G)Shanghai SA Mediciall & Strumenti di plastica Co., Ltd.Inoculazione 0,7*32 TW SBPDX
Calibro a corsoio (MarCal)Mahr16ERMisurazione del tumore
IVC gabbie ventilate individualiLingyunboji Ltd.IVC-128Struttura per animali
IHC
Leica ASP200 Processatore di tessuti sottovuotoLeicaASP200IHC
Leica RM2235 Microtomo rotativo manuale per il sezionamento di routineLeicaRM2235IHC
Leica EG1150 H Modulo di inclusione in paraffina riscaldataLeicaEG1150 HIHC
Ariol-Clinical IHC e scanner FISHLeicaAriolIHC
Anticorpo umano CD8 (EP334)ZSGB-BioZA-0508IHC
Anticorpo umano PD1 [NAT105]Abcamab52587IHC
Anticorpo umano PD-L1 (E1L3N)Tecnologia di segnalazione cellulare13684SIHC
Polink-2 plus Polimero HRP Sistema di rilevamentoZSGB-BioPV-9001/9002IHC
liquido <

Riferimenti

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