Qui, presentiamo un protocollo che utilizza coloranti Near-Infrared in combinazione con immunoistochimica e scansione ad alta risoluzione per analisi proteine nelle regioni cerebrali.
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Articolo metodologico
Utilizzo della fluorescenza Near-Infrared e scansione ad alta risoluzione per misurare l'espressione proteica nel cervello del roditore
In questo articolo
Sommario
Abstract
La neuroscienza è lo studio di come le cellule nel cervello mediare varie funzioni. Misurare l'espressione proteica nei neuroni e nella glia è fondamentale per lo studio delle neuroscienze poiché la funzione cellulare è determinata dalla composizione e dall'attività delle proteine cellulari. In questo articolo, descriviamo come l'immunocitochimica può essere combinata con la scansione ad alta risoluzione vicino infrarosso per fornire una misura semi-quantitativa di espressione proteica in regioni cerebrali distinte. Questa tecnica può essere utilizzata per un'espressione proteica singola o doppia nella stessa regione cerebrale. La misurazione delle proteine in questo modo può essere utilizzata per ottenere un cambiamento relativo nell'espressione proteica con una manipolazione sperimentale, la firma molecolare dell'apprendimento e della memoria, l'attività nei percorsi molecolari e l'attività neurale in diverse regioni cerebrali. Utilizzando le proteine corrette e l'analisi statistica, è possibile determinare anche la connettività funzionale tra le regioni cerebrali. Data la facilità di implementazione di immunocitochimica in un laboratorio, utilizzando l'immunocitochimica con scansione ad alta risoluzione vicino infrarosso può espandere la capacità del neuroscienziato per esaminare i processi neurobiologici a livello di sistemi.
Introduzione
Lo studio della neuroscienza riguarda un'indagine su come le cellule nel cervello mediano funzioni specifiche1. Questi possono essere di natura cellulare, come ad esempio il modo in cui le cellule glia conferiscono immunità nel sistema nervoso centrale o possono coinvolgere esperimenti che mirano a spiegare come l'attività dei neuroni nell'ippocampo dorsale conduce alla navigazione spaziale. In senso ampio, la funzione cellulare è determinata dalle proteine che si esprimono in una cellula e dall'attività di queste proteine2. Di conseguenza, la misurazione dell'espressione e/o dell'attività delle proteine nelle cellule ce....
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Protocollo
Il seguente protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università del Delaware. Maschi Sprague Dawley ratti circa 55 – 75 giorni di età sono stati utilizzati per questo protocollo.
1. estrazione del cervello e preparazione dei tessuti
- Anestetizzare ratto con isoflurano in anestesia camera di induzione fino a quando il ratto non presenta più una risposta al piede pizzico.
- Sacrifica i ratti attraverso una rapida decapitazione usando una ghigliottina.
- Tagliare la pelle sul cranio posteriore a anteriore e chiaro dalla parte superiore del cranio.
- ....
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Risultati
Prima di utilizzare la scansione ad alta risoluzione per l'immunoistochimica, si dovrebbe verificare che il protocollo funzioni. Questo può essere realizzato utilizzando un saggio di validazione in cui le sezioni cerebrali dello stesso animale sono incubate con anticorpi primari e secondari, anticorpo secondario da solo, o nessun anticorpo primario o secondario. I risultati di tale saggio di convalida sono illustrati nella Figura 2. In questa reazione stavamo.......
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Discussione
I risultati presentati in questo articolo dimostrano che l'immunocitochimica vicino all'infrarosso in combinazione con la scansione ad alta risoluzione può essere utilizzata per ottenere misure semi-quantitative dell'espressione proteica nel tessuto cerebrale. Può anche essere usato per etichettare due proteine contemporaneamente nella stessa regione del cervello. In precedenza abbiamo usato immunoistochimica vicino all'infrarosso per misurare l'immediata espressione genica precoce in più regioni cerebrali
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
La ricerca in questo rapporto è stata finanziata da una sovvenzione bersaglio dai NIGMS (1P20GM103653) assegnato a DK.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| induzione per anestesia | |||
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | utilizzato per rimuovere la parte posteriore del cranio |
| utilizzato per tagliare verso l'alto lungo la linea mediana del cranio | |||
| Micro Spatola | Fischer Scientific | 21-401-5 | utilizzato per estrarre il cervello |
| Vetrini per microscopio | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Reazione | |||
| Triton X-100 | Utilizzato come detergente delicato per permeabilizzare le cellule dopo il fissaggio in Paraformaldeide, utilizzato anche come detergente delicato in combinazione con siero ospite e anticorpi secondari. | ||
| Tween-20 | Utilizzato come una piccola quantità di detergente aggiunto a TBS per produrre TBS-T dopo vetrini coprioggetto con anticorpo primario | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Studio Immagine: | Licor Biotecnologia, Inc. |
Riferimenti
- Kandel, E. R. Principles of Neural Science. , McGraw Hill. New York. (2013).
- Byrne, J. H., Roberts, J. L. From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , Academic Press/Elsevier. (2009).
- Salami, A., et al.
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Ristampe e permessi
