Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) e Immunofluorescence (IF) di prodotti genici specifici nelle cellule infette da KSHV

Sommario

Descriviamo un protocollo che utilizza la fluorescenza nell'ibridazione situ (FISH) per visualizzare più RNA herpesvirali all'interno di cellule umane lytically infette, sia in sospensione che aderenti. Questo protocollo include la quantificazione della fluorescenza producendo un rapporto nucleocitoplasmatica e può essere esteso per la visualizzazione simultanea di proteine ospite e virali con immunofluorescenza (IF).

Abstract

Le informazioni meccanicistiche arrivano da un attento studio e quantificazione di RNA e proteine specifici. Le posizioni relative di queste biomolecole in tutta la cellula in momenti specifici possono essere catturate con la fluorescenza nell'ibridazione situ (FISH) e l'immunofluorescenza (IF). Durante l'infezione da herpesvirus littico, il virus dirotta la cellula ospite per esprimere preferibilmente geni virali, causando cambiamenti nella morfologia cellulare e nel comportamento delle biomolecole. Le attività littiche sono incentrate in fabbriche nucleari, definite compartimenti di replicazione virale, che sono distinguibili solo con FISH e IF. Qui descriviamo un protocollo adattabile delle tecniche RNA FISH e IF per le cellule infettate associate al sarcoma (KSHV) di Kaposi, sia aderenti che in sospensione. Il metodo include passaggi per lo sviluppo di specifici oligonucleotidi anti-senso, doppio RNA FISH, RNA FISH con IF, e calcoli quantitativi di intensità di fluorescenza. Questo protocollo è stato applicato con successo a più tipi di cellule, cellule non infette, cellule latenti, cellule littiche, corsi temporali e cellule trattate con inibitori per analizzare le attività spatiotemporali di RNA specifici e proteine sia dall'ospite umano che il kSHV.

Introduzione

Nella loro fase litetica (attiva), gli herpesvirus dirottano la cellula ospite, causando cambiamenti nella morfologia cellulare e nella localizzazione delle molecole biologiche, per produrre virioni. La base delle operazioni è il nucleo, dove il genoma virale del DNA a doppio filamento viene replicato e confezionato in un guscio proteico, chiamato capside¹. Per cominciare, il virus esprime le proprie proteine, dirottando i macchinari ospiti e impedendo l'espressione di geni ospiti non essenziali, un processo chiamato effetto di chiusura dell'ospite. La maggior parte di questa attività è localizzata in specifiche regioni nucleari prive di 4,6-di....

Protocollo

1. Progettazione di oligonucleotidi antisenso a fluorescenza in situ (FISH) per rilevare una specifica trascrizione dell'herpesvirale

1. Selezionare da 25 a 40 nt segmenti dalla sequenza di RNA di interesse e convertire in modo anti-senso. Una strategia FISH di successo può contenere da uno fino a dieci o più oligonucleotidi anti-senso diversi. Quando si selezionano le sequenze, tenere presente quanto segue:
   1. Se l'RNA di interesse contiene una regione di ripetizione unica, sfrutta questa funzione e progetta un oligonucleotide antisenso per indirizzare la sequenza di ripetizione.
      NOTA: Tycowski e colleghi⁵ forniscono un esempio ....

Risultati

I metodi FISH e IF descritti in questo manoscritto sono illustrati nella Figura 1 insieme alla quantificazione dei risultati per traccia di linea di intensità fluorescente. I risultati qui presentati sono semi-quantitativi e offrono una visione della localizzazione, piuttosto che nel confronto tra intensità di diverse macchie fluorescenti perché gli esperimenti non includevano una perla fluorescente nella preparazione del vetrino. La figu.......

Discussione

Il protocollo descritto in questo rapporto può essere adattato a diversi tipi di cellule e include passi per raddoppiaRE RNA FISH e RNA FISH con IF utilizzando anticorpi primari monoclonali e policlonali. Anche se i vetrini preparati sono tipicamente immagini con un microscopio confocale, l'imaging può essere eseguito con un microscopio STED (esaurimento delle emissioni stimolato) dopo le modifiche di una maggiore concentrazione di anticorpi e di un diverso mezzo di montaggio. Per un'analisi avanzata delle singole cellul.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
AlexaFluor594-5-dUTP	Life Technologies	C1100
ATTACCO anti-DIG	Jackson Lab Immunologicals	200-092-156
Anticorpo secondario anti-coniglio AlexaFluor594 Anticorpo monoclonale	Invitrogen	A-11037
Anticorpo anti-SSB	di capra N/A	N/A	Ref. Chiou et al. 2002
BLASTn	NIH NCBI	N/A	Software di allineamento di sequenze libere
destrano solfato	Sigma Aldrich	D8906	Grado di biologia molecolare
Kit di coda DIG-Oligonucleotide	Sigma Roche	#03353583910	2nd Gen
Vetrini a otto camere	Nunc Lab Tek II	#154453	La guarnizione blu favorisce la tensione superficiale, ma è disponibile anche la separazione con gel trasparente.
Formamide	Sigma Aldrich	F9037	Sonde
	Stellaris	SMF-2019-1	Compatibile con il protocollo, Quasar 670
ImageJ	NIH, Bethesda, MD	N/A	Software gratuito per l'analisi delle immagini, [http:rsb.info.nih.gov/ij/]
OligoAnalyzer	IDT	n/A	Analizzatore di oligonucleotidi gratuito
pcDNA3	Invitrogen	A-150228
pmaxGFP	Amaxa	VDF-1012
Poly L-Lysine	Sigma Aldrich	P8920
Terminal Transferasi	Sigma Roche	#003333574001
Vanadil Ribonucleoside Complexes	NEB	S1402S
Vectashield	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	DAPI all'interno del supporto di montaggio disperde la luce e riduce il contrasto.