Articolo metodologico

Separazione dell'epidermide e del derma di ratto con termolisina per rilevare mRNA e proteine infiammatorie sito-specifiche

DOI:

10.3791/59708

⸱

29 settembre 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, Oklahoma State University Center for Health Sciences, 2Institute for Shock Physics, Washington State University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui è presentato un protocollo per la separazione dell'epidermide dal derma per valutare la produzione di mediatori infiammatori. A seguito dell'infiammazione, l'epidermide della zampa posteriore di ratto viene separata dal derma mediante termolisina a 4 °C. L'epidermide viene quindi utilizzata per l'analisi dell'mRNA mediante RT-PCR e la valutazione delle proteine mediante western blot e immunoistochimica.

Abstract

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Sono necessarie tecniche facili da usare e poco costose per determinare la produzione sito-specifica di mediatori infiammatori e neurotrofine durante lesioni cutanee, infiammazione e / o sensibilizzazione. L'obiettivo di questo studio è quello di descrivere un protocollo di separazione epidermico-dermica utilizzando la termolisina, una proteinasi attiva a 4 °C. Per illustrare questa procedura, i ratti Sprague Dawley vengono anestetizzati e le zampe posteriori destre vengono iniettate con carragenina. Sei e dodici ore dopo l'iniezione, i ratti con infiammazione e ratti ingenui vengono eutanasizzati e un pezzo di zampa posteriore, la pelle glabra viene posto nel freddo Dulbecco's Modified Eagle Medium. L'epidermide viene quindi separata dalla membrana basale dal derma dalla termolisina in PBS con cloruro di calcio. Successivamente, il derma è protetto da una pinca di microdissezione e l'epidermide viene delicatamente presa in giro. La colorazione blu toluidina delle sezioni tissutali mostra che l'epidermide è separata in modo pulito dal derma nella membrana basale. Tutti gli strati cellulari di cheratinociti rimangono intatti e le creste della rete epidermica insieme alle rientranze delle papille dermiche sono chiaramente osservate. La RT-PCR qualitativa e in tempo reale viene utilizzata per determinare il fattore di crescita nervoso e i livelli di espressione dell'interleuchina-6. Western blotting e immunoistochimica vengono infine eseguiti per rilevare quantità di fattore di crescita nervoso. Questo rapporto illustra che la digestione della termolisina fredda è un metodo efficace per separare l'epidermide dal derma per la valutazione dell'mRNA e delle alterazioni proteiche durante l'infiammazione.

Introduzione

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La valutazione dei mediatori infiammatori e dei fattori neurotrofici dalla pelle può essere limitata a causa dell'eterogeneità dei tipi di cellule presenti nel derma infiammato e nell'epidermide1,2,3. Diversi enzimi, tecniche chimiche, termiche o meccaniche che comportano la separazione dei due strati o per eseguire la dissociazione cellulare per la valutazione sono stati recentemente esaminati4. Acido, alcali, sale neutro e calore possono dividere rapidamente l'epidermide dal derma, ma il gonfiore cellulare ed extracellulare si verifica spesso5,6. Tripsina, pancreatina, elastasi, cheratinasi, collagenasi, pronasi, dispasi e termolisina sono enzimi che sono stati utilizzati per la separazione epidermico-dermica4,7. La tripsina e altri enzimi proteolitici su larga scala sono attivi a 37-40 °C, ma devono essere monitorati attentamente per prevenire la dissociazione degli strati epidermici. La dispasi fende l'epidermide alla lamina densa, ma richiede 24 ore per la separazione nel freddo4,8 o punti temporali più brevi a 37 °C4,9. Una caratteristica limitante di tutte queste tecniche è la potenziale interruzione della morfologia dei tessuti e la perdita di integrità di mRNA e proteine.

Per mantenere l'integrità dell'mRNA e delle proteine, è necessario eseguire un metodo di separazione cutanea al freddo per un breve periodo di tempo. Nella valutazione delle tecniche di separazione cutanea per gli studi sull'infiammazione, la termolisina è un enzima efficace per separare l'epidermide dal derma a basse temperature4. La termolisi è attiva a 4 °C, scinde gli emidesmosomi epidermici dalla lamina lucida e separa l'epidermide dal derma entro 1-3 h4,8,10. L'obiettivo di questo rapporto è ottimizzare l'uso della termolisina per la separazione dell'epidermide di ratto infiammata dal derma per rilevare i livelli di mRNA e proteine per mediatori infiammatori e fattori neurotrofici. Sono state presentate diverse relazioni preliminari11,12,13,14,15. L'obiettivo di questo manoscritto è descrivere una tecnica ottimale di separazione cutanea utilizzando la termolisina e dimostrare il rilevamento di 1) marcatori di infiammazione, 2) interleuchina-6 (IL-6) mRNA e 3) mRNA e proteine del fattore di crescita nervoso (NGF) nell'epidermide di ratti con infiammazione indotta da carragenina (C-II)16,17. Un rapporto preliminare che utilizza il modello adiuvante completo di Freund indica che i livelli di mRNA e proteine NGF aumentano precocemente durante l'infiammazione15. Nei topi, la sensibilizzazione cutanea con l'applicazione topica di oxazolone provoca un aumento precoce dell'mRNA IL-6 utilizzando l'ibridazione in situ36. Sia IL-6 che NGF sono stati implicati in C-II18,19, ma non ci sono state segnalazioni che descrivono livelli di mRNA o proteine per IL-6 o NGF specificamente dall'epidermide durante le fasi acute di C-II.

La tecnica della termolisina è economica e semplice da eseguire. Inoltre, la separazione termolitica dell'epidermide dal derma consente l'mRNA, il western blot e l'analisi immunoistochimica dei mediatori infiammatori e dei fattori neurotrofici durante il processo di infiammazione15. I ricercatori dovrebbero essere in grado di utilizzare facilmente questa tecnica in studi preclinici e clinici sull'infiammazione della pelle.

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Protocollo

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Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali dell'Oklahoma State University Center for Health Sciences IACUC (#2016-03).

1. Infiammazione indotta da carragenina (C-II)

  1. Anestetizzare ratti Sprague Dawley maschi e/o femmine (200-250 g; 8-9 settimane) con isoflurano (o anestetico iniettabile).
  2. Controllare la profondità dell'anestesia toccando la cornea e pizzicando leggermente la zampa posteriore sinistra. Quando l'animale è opportunamente anestetizzato, non si osserverà alcuna risposta corneale o della zampa.
  3. Iniettare per via sottocutanea la zampa posteriore glabra destra con 100 μL dell'1% (p/v) di λ-carragenina diluita in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)20.
    1. Assicurarsi che vengano utilizzati controlli appropriati, come i ratti ingenui senza isoflurano in questa relazione. Studi preliminari indicano che i ratti naïve con o senza isoflurano hanno la stessa espressione basale di IL-6 epidermico e NGF.
      NOTA: I ratti naïve sono i controlli preferiti per gli studi sull'infiammazione poiché la soluzione salina sottocutanea o pbS causano un'infiammazione locale23,37.
  4. Valutare l'edema dei ratti C-II per garantire l'efficacia della carragenina (Figura 1)20. Determinare la quantità di edema misurando lo spessore metatarsale della zampa posteriore con pinze.
  5. A 6-12 ore, eutanasizzare i ratti con CO2 (o sovradosaggio anestetico iniettabile) e tagliare pezzi di 1 mm x 2 mm di pelle glabra della zampa posteriore con bisturi affilato. Se si utilizza la pelle pelosa, raderla prima di tagliare i pezzi di pelle da 1 mm x 2 mm.
    NOTA: Assicurarsi che vengano scelti i timepoint appropriati in base agli studi specifici.
  6. Utilizzando una pinna per microdissezione, trasferire la pelle in 1 mL di Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco freddo in un tubo di microcentrifuga su ghiaccio e mantenere freddo per 15-60 minuti.

2. Separazione termolisina dell'epidermide e del derma

  1. Preparare e attivare la termolisina.
    1. Preparare una soluzione di termolisina, aggiungendo 5 mg di Geobacillus stearothermophilus a 10 ml di PBS, a pH = 8 (concentrazione 500 μg/mL).
    2. Preparare una soluzione 1 M di cloruro di calcio (CaCl2 anidro) aggiungendo 1,11 g in 10 ml di H2O distillato.
    3. Per prevenire l'autolisi della termolisi, aggiungere 10 μL di cloruro di calcio a 10 mL di soluzione di termolisina. La concentrazione finale di cloruro di calcio sarà di 1 mM.
    4. Aliquota 1 mL di termolisina attivata in 10 pozzetti di una piastra di coltura cellulare a 24 pozzi su ghiaccio.
  2. Utilizzare la digestione enzimatica termolisina per separare l'epidermide dal derma.
    1. Utilizzando una pinza per microdissezione, trasferire un campione di pelle in ciascun pozzetto di termolisina attivata. Assicurarsi di non immergere la pelle nella soluzione di termolisina.
    2. Picchiettare delicatamente la pelle sul lato del pozzo per aiutare a rilasciare il campione di pelle dalla pinza per galleggiare sulla soluzione di termolisina.
    3. Far galleggiare la pelle nella soluzione di termolisina con lo strato corneo (epidermide esterna) rivolto verso l'alto e il derma rivolto verso il basso. È fondamentale che il derma sia rivolto verso il basso, o l'effettiva separazione non avrà luogo.
      NOTA: La quantità di tempo per l'incubazione della termolisina deve essere determinata empiricamente dall'utente finale. La pelle glabra e posteriore dei ratti Sprague Dawley (200-250 g; 8-9 settimane) richiede spesso 2,0-2,5 ore per la separazione. Il tempo di incubazione dovrebbe variare con la specie e l'età.
    4. Dopo il tempo di incubazione appropriato in termolisina, utilizzare una pinza per microdissezione per trasferire un campione di pelle in un pozzetto di una piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti con 7-8 mL di DMEM freddo (4 °C). Ciò consente più spazio per la separazione dell'epidermide dal derma.
    5. Immergere la pelle nel DMEM.
    6. Spazzolare delicatamente l'epidermide con la pincia attorno al perimetro della pelle fino a quando l'epidermide quasi traslucida non viene osservata ai bordi. Se ciò non può essere ottenuto, riportare il campione di pelle alla soluzione di termolisina per altri 15-30 minuti.
    7. Una volta che l'epidermide si separa notevolmente dal derma, quindi tenere con attenzione sia l'epidermide che il derma con una pinca di microdissezione e molto lentamente estrarre l'epidermide dal derma.
    8. Valutare la traslucenza dell'epidermide isolata e assicurarsi che sia otticamente coerente. Vedere la Figura 2 per un esempio di un campione di 1 mm x 2 mm di epidermide di ratto. Se c'è una variazione nella traslucenza, allora non si è verificata una corretta separazione.
  3. Inattivare la termolisisina usando l'acido etilendiammitatotraacetico (EDTA) nei pezzi separati di epidermide e derma.
    ATTENZIONE: La termolisina che rimane nell'epidermide e nel derma è ancora attiva e può danneggiare gli strati se non inattivata.
    1. Preparare una soluzione stock EDTA da 0,5 M. Per fare ciò, aggiungere lentamente 0,93 g di EDTA in 5 ml di acqua a doppio distillato. Aggiungere idrossido di sodio alla soluzione fino a quando non si schiarisce. Assicurarsi che il pH della soluzione sia ~ 8,0.
    2. Crea una soluzione EDTA da 5 mM in DMEM. Aggiungere 0,25 mL di soluzione stock edTA da 0,5 M a 25 mL di DMEM.
    3. Posizionare l'epidermide e il derma separati nella soluzione edta/DMEM da 5 mM a 4 °C per 30 minuti per disattivare l'attività della termolisina.
  4. Valutare l'epidermide con istologia tintoriale8,9,10.
    1. Fissare una porzione dell'epidermide in una formalina neutra al 10%, paraformaldeide al 4% o paraformaldeide allo 0,25% con soluzione di acido picrico allo 0,8% per 1 ora a temperatura ambiente (RT) con agitazione.
    2. Posizionare l'epidermide fissa in saccarosio al 10% in PBS per 1 ora a RT con agitazione.
    3. Congelare l'epidermide in una matrice di incorporamento del tessuto per il sezionamento. Tagliare sezioni trasversali da 14 μm utilizzando un criostato e sezioni di montaggio del disgelo su vetrini per microscopio rivestiti di gelatina.
    4. Sezioni asciutte su uno scaldasalviette e macchia con una soluzione di lavoro di blu toluidina (TB; 10% TB in 1% cloruro di sodio) per 90 s. Appose coverslips con un mezzo di montaggio acquoso.
    5. Osservare l'epidermide con la microscopia a campo luminoso a 50x-250x.
      NOTA: Se si è verificata una corretta separazione, l'epidermide sarà divisa in modo pulito dal derma e verranno rilevati i cinque strati: strato basale, strato spinoso,strato granuloso, strato lucidum e strato corneo. Un esempio di epidermide separata della pelle di ratto può essere visto nella Figura 3.

3. Estrazione delle proteine e analisi western blot

  1. Eseguire western blotting sui campioni di tessuto separati utilizzando il protocollo21precedentemente pubblicato.
  2. Omogeneizzare l'epidermide in 50 μL di tampone di lisi (25mM Tris HCl, pH = 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% glicerolo e 1% Triton X-100) contenente un cocktail di fosfatasi e inibitore della proteasi.
  3. Centrifugare i campioni a una velocità massima per 15 minuti a 4 °C e valutare il surnatante per la concentrazione proteica utilizzando un kit di analisi proteica.
  4. Caricare concentrazioni uguali di proteine (30 μg) su gel SDS, eseguire l'elettroforesi e quindi trasferire le proteine alle membrane di nitrocellulosa o PVDF.
  5. Bloccare le membrane con il 5% di latte per 2 ore e incubare durante la notte in anticorpi primari (topo anti-NGF, E12, 1:1000).
  6. Lavare 3 volte con PBS con interpolazione dello 0,3% per 10 minuti ciascuno e incubare con un anticorpo secondario etichettato (ad esempio, fosfatasi alcalina etichettata coniglio anti-topo IgG).
  7. Utilizzare un sistema di scansione per valutare il segnale western blot (ad esempio, substrato ECF e una piattaforma di imaging).

4. Immunoistochimica

  1. Posizionare i campioni di tessuto in un fissativo per un'immunoreattività ottimale: 0,96% (p/v) di acido picrico e 0,2% (p/v) di formaldeide in tampone fosfato di sodio 0,1 M, pH = 7,321,22,23 per 4 ore a RT. Trasferimento al 10% di saccarosio in PBS durante la notte a 4 °C.
  2. Eseguire immunoistochimica standard sulle sezioni tissutali21,22,23.
  3. Incorporare l'epidermide degli animali in un singolo blocco congelato nella matrice di incorporamento e tagliare sezioni di 10-30 μm su un criostato. Montare le sezioni su vetrini rivestiti di gelatina e asciugare a 37 °C per 2 ore.
  4. Lavare sezioni per tre risciacqui di 10 minuti in PBS e incubare per 24-96 ore in antisieri primari, [ad esempio, anti-NGF di topo (E12, 1:2000)] e prodotto genetico antiproteico di coniglio 9,9 (PGP 9,5, 1:2000) diluito in PBS contenente 0,3% (p/v) Triton X-100 (PBS-T) PBS-T con 0,5% di albumina sierica bovina (BSA) e 0,5% di polivinilpirrolidone (PVP).
  5. Dopo l'incubazione primaria dell'antiserum, risciacquare le sezioni tre volte per 10 minuti in PBS e incubare 1 ora a RT in Alexa Fluor 488 asino anti-coniglio IgG (1:1000) e Alexa Fluor 555 asino anti-mouse IgG (1:1000) diluito in PBS-T.
  6. Risciacquare le sezioni tre volte in PBS per 10 minuti e apporre le coperture con mezzo di montaggio non sbiadito per ritardare lo sbiadimento dell'immunofluorescenza.

5. Isolamento dell'RNA e sintesi del cDNA

  1. Eseguire la reazione a catena standard della trascrittasi polimerasi (RT-PCR) sui campioni cutanei21. Isolare l'RNA totale utilizzando una soluzione di fenolo, guanidina isotiocianato.
  2. Effettuare la sintesi complementare del DNA mediante moloney virus della leucemia murina trascrittasi inversa.
  3. Utilizzare le seguenti sequenze di primer per l'amplificazione di NGF e IL-6:
    NGF (Senso) - GTGGACCCCAAACTGTTTAAGAAACGG
    NGF (Antisenso) – GTGAGTCCTGTTGAAGGAGATTGTACCATG
    IL-6 (Senso) - GCAATTCTGATTGTATGAACAGCGATGATGC;
    IL-6 (Antisenso) – GTAGAAACGGAACTCCAGAGAGAGAG
  4. Confronta i livelli di mRNA NGF e IL-6 con il gene di pulizia β-actina:
    β-ACTIN (Senso) - TGCGTGACATTAAAGAGAAGCTGTGCTATG
    β-ACTINA (Antisenso) – GAACCGCTCATTGCCGATAGTGATGA
  5. Valutare con RT-PCR qualitativa utilizzando thermal cycler e PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) utilizzando un sistema qRT-PCR.

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Risultati

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L'iniezione di carragenina nella zampa posteriore del ratto ha causato sintomi classici di infiammazione come arrossamento ed edema16,17. Il gonfiore della zampa posteriore è stato misurato con pinze meccaniche20. Un valore basale dello spessore della zampa è stato ottenuto per ciascun ratto prima del trattamento con carragenina e misurato di nuovo a 6 h e 12 h. Lo spessore della zampa è stato aumentato in modo significativo rispetto ai va...

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Discussione

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Lo studio ha determinato che l'epidermide della pelle glabra della zampa posteriore di ratto era facilmente separata dal derma usando termolisina (0,5 mG / mL) in PBS con 1 mM di cloruro di calcio a 4 ° C per 2,5 ore. La valutazione istologica ha indicato che l'epidermide era separata dal derma della membrana basale e che le creste della rete epidermica erano intatte. La termolisina è una metalloendopeptidasi extracellulare prodotta da Gram-positivo (Geo)Bacillus thermoproteolyticus24<...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno divulgazioni.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il finanziamento per questa ricerca è stato fornito dal National Institutes of Health NIH-AR047410 (KEM)

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
λ-carrageninaMillipore Sigma22049L'iniezione sottocutanea di carragenina induce infiammazione
7500 Sistema di PCR veloce in tempo realeThermo Fisher ScientificPer l'analisi RT-PCR
Cloruro di calcio (CaCl2), anidroMillipore SigmaPreviene l'autolisi della termolisina
Mezzodi montaggio acquoso con montaggio su cristalliMillipore SigmaC0612Terreno di montaggio acquoso dopo colorazione blu toluidina
Asino anti-Topo Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA-31570Anticorpo secondario per immunoistochimica
Asino anti-Coniglio IgG, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21206Anticorpo secondario per immunoistochimica
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermo Fisher Scientifico11966-025Per mantenere l'integrità dei tessuti
Acido etilendiamminotetraaceticoMillipore SigmaE6758Arresta la reazione della termolisina
Virus della leucemia murina Moloney (M-MLV) Trascrittasi inversaPromegaM1701Per la sintesi complementare del DNA
Anticorpo anti-NGF di topo (E-12)Santa Cruz Biotechnologysc-365944Per la neurotrofina immunoistochimica
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36930Per ritardare l'estinzione in immunofluorescenza
Coniglio anti-PGP 9.5Cedarlane LabsCL7756APPer la colorazione del nervo intraepidermico
SAS Sprague Dawley RatCharles RiverStrain Code 400Animale utilizzato per studi sull'infiammazione
Shandon M-1 Embedding MatrixThermo Fisher Scientific1310TSMatrice di inclusione tissutale per tintoria e immuno-istochimica
SimpliAmp TermociclatoreThermo Fisher ScientificA24811Per analisi RT-PCR
SYBR Select Master MixThermo Fisher Scientific4472908Per analisi RT-PCR
TermolisinaMillipore SigmaT7902Da Geobacillus stearothermophilus
Toluidina BluMillipore Sigma89640Per la colorazione tintoriale per microscopia in campo chiaro
Reagente TRIzolThermo Fisher ScientificPer l'estrazione dell'RNA totale per RTPCR
4351107 499609 15596026

Riferimenti

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