Generazione di organidi tumorali da modelli murini geneticamente ingegnerizzati del cancro alla prostata

Sommario

Mostriamo un metodo per la necropsia e la dissezione dei modelli di cancro alla prostata del topo, concentrandosi sulla dissezione del tumore alla prostata. Viene inoltre presentato un protocollo passo-passo per la generazione di organoidi tumorali della prostata del topo.

Abstract

I metodi basati sulla ricombinazione omologa per modificare i geni hanno notevolmente favorito la ricerca biologica. I modelli murini geneticamente ingegnerizzati (GEMM) sono un metodo rigoroso per studiare lo sviluppo e la malattia dei mammiferi. Il nostro laboratorio ha sviluppato diverse GEMM di cancro alla prostata (PCa) che non sono espressione di uno o più geni soppressori tumorali utilizzando il sistema ricombinase Cre-loxP site-specific e un promotore specifico della prostata. In questo articolo, descriviamo il nostro metodo per la necropsia di questi GEMM PCa, concentrandoci principalmente sulla dissezione dei tumori della prostata del topo. Nuovi metodi sviluppati nell'ultimo decennio hanno facilitato la coltura delle cellule derivate epiteliali per modellare i sistemi di organi in vitro in tre dimensioni. Inoltre, dettagliamo un metodo di coltura cellulare 3D per generare organoidi tumorali dai GEMM PCa del topo. La ricerca pre-clinica sul cancro è stata dominata dalla coltura cellulare 2D e dai modelli di xenotrapianto derivati dalla linea cellulare o derivati dal paziente. Questi metodi mancano di microambiente tumorale, una limitazione dell'utilizzo di queste tecniche negli studi pre-clinici. Le GEMM sono più rilevanti dal livello fisiologico per comprendere la tumorigenesi e la progressione del cancro. La coltura organoide tumorale è un sistema di modelli in vitro che riassume l'architettura del tumore e le caratteristiche di lignaggio cellulare. Inoltre, i metodi di coltura cellulare 3D consentono la crescita di cellule normali per il confronto con le colture cellulari tumorali, raramente possibile utilizzando tecniche di coltura cellulare 2D. In combinazione, l'uso delle GEMM e della coltura cellulare 3D negli studi preclinici ha il potenziale per migliorare la nostra comprensione della biologia del cancro.

Introduzione

Dalla fine degli anni '80, la capacità di alterare i geni con la ricombinazione omologa ha notevolmente avanzato lo studio dei sistemi biologici¹. Sistemi promotori inducibili, tissutali o specifici delle cellule e ricombinazioni site-specific, come Cre-loxP, ha avanzato studi genetici facilitando il controllo sulle modifiche genetiche sia dal punto di vista temporale che spaziale^{2,3, 4}. La combinazione di queste strategie genetiche ha creato una vasta gamma di sistemi di modelli sperimentali^5,6

Protocollo

Le procedure sugli animali qui descritte sono state eseguite con l'approvazione dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso il Department of Laboratory Animal Resources, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, New York.

NOT: I topi maschi da sezionare per isolare prostati o tumori alla prostata per la generazione di organoidi dovrebbero aver almeno raggiunto l'età della maturità sessuale - circa 8-10 settimane di età. Età specifiche dei topi possono variare tra gli studi. Alcuni fattori da considerare quando si sceglie l'età includono cambiamenti dipendenti dall'età nelle popolazioni di cellule....

Risultati

Le immagini di necropsia rappresentative di un topo con un grande tumore alla prostata primario pieno di liquidi nella regione della prostata anteriore sono mostrate nella Figura 2A. Al contrario, Figura 2B, mostra immagini necroscopia rappresentative di un topo con un grande tumore alla prostata primaria solido per il quale le singole regioni della prostata sono indistinguibili. Le immagini di dissezione fluorescente mostrano l.......

Discussione

Passi critici all'interno del protocollo per la dissezione del tumore alla prostata e la generazione di organoidi
La rimozione del tessuto non prostatico e la dissezione fine del tumore alla prostata del topo è cruciale per la generazione ottimale di organoidi tumorali poiché sia le cellule epiteliali non prostata che le normali cellule epiteliali della prostata genereranno organoidi. Per i tumori della prostata solida in particolare, è fondamentale isolare aree di tumore vitale per rimuovere la conta.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,25% tripsina+2,21 mM EDTA	Sigma	25-053
1 1/4 di pollice, 23 G, aghi per siringa monouso	Becton Dickinson	Z192430
10% formalina tamponata neutra	Sigma	HT501128
32% paraformaldeide	Servizi di microscopia elettronica	15714
A83-01	MedChemExpress	HY-10432
Advanced DMEM/F12+++	Gibco	12634
Bilancia analitica	Mettler Toledo	30216623
B27 (50x)	Gibco	17504044
Collagenase II	Gibco	17101015
Tavola da dissezione	Thermo-Fisher	36-1
EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10	Prodotto da Trevigen	Richiesto dal National Cancer Institute presso il Frederick National Laboratory	Il titolare di sovvenzioni dal National Cancer Institute può richiedere la matrice
HEPES (1 M)	Sigma	25-060
umano ricombinante Fattore di crescita epidermico umano (EGF)	PeproTech	AF-100-15
L-glutammina (200 mM)	Sigma	25-005
N-Acetil-L-Cisteina	Sigma	A9165
Penicillina-Streptomicina	Sigma	P4333
Bilancia di precisione	Mettler Toledo	30216561
Bisturi #23	World Precision Instruments	504176
Manico per bisturi #7, 16 cm	World Precision Instruments	500238
Lama di rasoio in carbonio a taglio singolo	Fisherbrand	12-640
Forbici da dissezione in acciaio inossidabile, 10 cm, diritte	World Precision Instruments	14393
Pinza a iride in acciaio inossidabile, 10 cm, punta curva, seghettata	World Precision Instruments	15915
Pinza multiuso Nugent in acciaio inossidabile, punta diritta, seghettata	World Precision Instruments	504489
Y-276632 (Inibitore di roccia)	APExBIO	A3008