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Articolo metodologico

Valutare la vitalità cellulare e la morte nelle colture di sferoidi 3D delle cellule tumorali

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⸱

DOI:

10.3791/59714

⸱

16 giugno 2019

 ,  , 
1Section for Cell Biology and Physiology, Department of Biology, Faculty of Science, University of Copenhagen

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo diversi semplici metodi per valutare la vitalità e la morte negli sferoidi delle cellule tumorali 3D, che imitano i gradienti fisico-chimici dei tumori in vivo molto meglio della cultura 2D. Il modello sferoide, quindi, consente di valutare l'efficacia del farmaco controilcancro con una migliore traduzione in condizioni in vivo.

Abstract

Gli sferoidi tridimensionali delle cellule tumorali sono strumenti importanti sia per gli schermi di farmaci per il cancro che per ottenere informazioni meccanicistiche sulla biologia delle cellule tumorali. Il potere di questa preparazione sta nella sua capacità di imitare molti aspetti delle condizioni in vivo dei tumori pur essendo veloce, economico e versatile abbastanza per consentire uno screening relativamente ad alto throughput. Le condizioni di coltura degli sferoidi possono ricapitolare i gradienti fisio-chimici in un tumore, tra cui la crescente acidità extracellulare, l'aumento della lattato e la diminuzione della disponibilità di glucosio e ossigeno, dalla periferia sferoide al suo nucleo. Inoltre, le proprietà meccaniche e le interazioni cellula-cellula dei tumori in vivo sono in parte imitate da questo modello. Le proprietà specifiche e di conseguenza le condizioni ottimali di crescita, degli sferoidi 3D, differiscono ampiamente tra i diversi tipi di cellule tumorali. Inoltre, la valutazione della vitalità cellulare e della morte negli sferoidi 3D richiede metodi che differiscono in parte da quelli impiegati per le colture 2D. Qui descriviamo diversi protocolli per la preparazione di sferoidi 3D delle cellule tumorali e per l'uso di tali colture per valutare la vitalità e la morte delle cellule nel contesto della valutazione dell'efficacia dei farmaci anticancro.

Introduzione

L'uso di modelli di sferoide multicellulari nella biologia del cancro è di diversi decenni1,2, ma ha guadagnato uno slancio sostanziale negli ultimi anni. In gran parte, ciò riflette una maggiore consapevolezza di quanto fortemente il fenotipo delle cellule tumorali dipenda dal loro microambiente e dalle condizioni di crescita specifiche. Il microambiente nei tumori solidi è fondamentalmente diverso da quello nei tessuti normali corrispondenti. Questo include condizioni fisico-chimiche come pH, tensione di ossigeno, così come la pressione interstiziale, gradienti di concentrazione di fattori solubili come sostanze nutritive, prodotti di scarto, e composti di segnalazione secreted (fattori di crescita, citochine). Inoltre, include l'organizzazione della matrice extracellulare (ECM), le interazioni cellula-cellula e la segnalazione intercellulare, e altri aspetti della particolare architettura tridimensionale (3D) del tumore3,4, 5,6. Le condizioni specifiche dei microambientali in cui esistono le cellule tumorali, influenzano profondamente il loro profilo di espressione genica e le proprietà funzionali, ed è chiaro che, rispetto a quello delle cellule coltivate in 2D, il fenotipo degli sferoidi 3D imita molto più da vicino quella dei tumori in vivo7,8,9,10,11. I modelli 2D, anche se impiegano ipossia, pH acido e alte concentrazioni di lattati per imitare aspetti noti del microambiente tumorale, non riescono ancora a catturare i gradienti dei parametri fisico-chimici che sorgono all'interno dei tumori, così come il loro tumore 3D architettura. D'altra parte, i modelli animali sono costosi, lenti ed eticamente problematici, e in generale hanno anche carenze nella loro capacità di ricapitolare le condizioni del tumore umano. Di conseguenza, gli sferoidi 3D sono stati applicati come modello di complessità intermedia negli studi di una vasta gamma di proprietà della maggior parte dei tumori solidi9,11,12,13, 14,15,16,17.

Un uso ampiamente impiegato di sferoidi 3D è nello screening dei saggi di efficacia della terapia anticancro9,18,19,20. Le risposte al trattamento sono particolarmente sensibili al microambiente tumorale, riflettendo sia l'impatto della tortuosità, la diffusione limitata, l'alta pressione interstiziale e il pH ambientale acido sulla somministrazione di farmaci, sia l'impatto dell'ipossia e di altri aspetti del microambiente sulla risposta alla morte cellulare9,17. Poiché l'ambiente all'interno di sferoidi 3D sviluppa intrinsecamente tutte queste proprietà7,8,9,10,11, impiegando colture di cellule 3D può migliorare sostanzialmente la traduzione dei risultati in condizioni in vivo, pur consentire uno screening efficiente e conveniente ad alto consumo della crescita netta. Tuttavia, la grande maggioranza degli studi sulla risposta farmacologica delle cellule tumorali sono ancora effettuati in condizioni 2D. Questo probabilmente riflette che, mentre alcuni saggi possono essere implementati relativamente facilmente per le colture cellulari 3D, molti, come i saggi di fattibilità, il gonfiore occidentale e l'analisi dell'immunofluorescenza, sono fatti molto più convenientemente in 2D che in 3D.

L'obiettivo del presente lavoro è quello di fornire saggi facilmente disponibili e protocolli precisi per l'analisi dell'effetto del trattamento con farmaci anticancro sulla vitalità e la sopravvivenza delle cellule tumorali in un ambiente di imitazione del tumore 3D. In particolare, forniamo e confrontiamo tre diversi metodi per la formazione di sferoidi, seguiti da metodi per analisi qualitative e quantitative di crescita, vitalità e risposta ai farmaci.

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Protocollo

1. Generazione di Spheroids

  1. Preparazione delle sospensioni cellulari per la formazione di sferoidi
    NOTA:     diverse linee cellulari hanno proprietà di adesione molto diverse e il protocollo di formazione degli sferoidi più adatto deve essere stabilito in ogni caso. Abbiamo scoperto che le cellule MCF-7 e BxPC-3 sono adatte per la formazione spontanea di sferoidi, mentre MDA-MB-231, SKBr-3, Panc-1 e MiaPaCa richiedono l'aggiunta di membrana seminterrato ricostituita per formare con successo sferoidi. Solo le cellule MDA-MB-231 e BxPC-3 sono state impiegate per il protocollo di sospensione, tuttavia altre linee cellulari sono certamente applicabili.
    1. Coltiva le cellule come monostrato fino alla confluenza del 70-80%.
    2. Lavare le cellule con fosfato bufferizzato salina (1x PBS, 5 mL per un 25 cm2 o 10 mL per un flacone da 75 cm 2), aggiungere l'enzima di dissociazione della cellula (0,5 mL per un 25 cm2 o 1 mL per un flacone da 75 cmda 2 cm) e incubare le cellule per 2-5 min a 37 gradi centigradi 5% di CO2 e 95% di umidità.
    3. Controllare il distacco cellulare al microscopio e neutralizzare l'enzima di dissociazione cellulare aggiungendo mezzo di crescita (6-10% siero a seconda della linea cellulare) ad un volume totale di 5 mL in un 25 cm2 o 10 mL per un flacone 75 cm2.
    4. Utilizzare una camera di Bérker per contare le celle e contare 8 quadrati nella preparazione della camera per cellula per ottenere un'elevata riproducibilità delle dimensioni degli sferoidi.
      NOT: Di seguito sono riportati tre protocolli che descrivono un metodo diverso per la formazione di sferoidi. Protocollo 1.2 e 1.3 può essere utilizzato per tutti i successivi protocolli analitici presentati, mentre il protocollo 1.4 è più adatto per l'incorporamento e preparazione lisata. A seconda della linea cellulare, la formazione di sferoidi richiede 2-4 giorni, indipendentemente dal metodo utilizzato.
  2. Formazione spontanea di sferoidi
    1. Eseguire i passaggi 1.1.1-1.1.4.
    2. Diluire la sospensione cellulare in un tubo da 15 mL per ottenere 0,5-2 x 104 celle/mL (è necessario determinare la densità ottimale delle celle per ogni linea cellulare) (Figura 1A (ii)).
    3. Riempire l'anello esterno dei pozzetti con 1x PBS o mezzo di crescita per ridurre l'evaporazione dai pozzi rimanenti. Trasferire la sospensione cellulare in un serbatoio sterile e, utilizzando una pipetta multicanale, erogare 200 l/well in un attacco ultra-basso 96 pozze inferiori rotonde (Figura 1A (iii)).
    4. Incubare la piastra in un'incubatrice a 37gradi centigradi con il 5% di CO 2, il 95% di umidità.
    5. Ogni 2-3 giorni acquisiscono immagini microscopiche leggere degli sferoidi.
      NOT: Le immagini in questo articolo sono prese all'ingrandimento 11.5x, che è appropriato per la maggior parte degli sferoidi preparati utilizzando questi protocolli.
    6. Ogni 2-3 giorni (dopo l'acquisizione delle immagini) sostituiscono 100 luna di mezzo (rimuovere 100 lofdeli del mezzo esaurito e sostituire con 100 luna di mezzo fresco.
      NOT: Per evitare di rimuovere sferoidi durante la sostituzione del mezzo, si consiglia di inclinare un po 'la piastra rimuovendo lentamente il mezzo e ispezionare il mezzo aspirato nelle punte per gli sferoidi visibili prima di scartarlo.
  3. Ricostituito la formazione di sferoidi mediata dalla membrana sotterranea.
    NOTA:     è stata utilizzata la membrana di elevazione (LDEV) senza lattosioe prosciacqua (LDEV). rBM è sensibile alla temperatura e deve sempre essere tenuto sul ghiaccio, in quanto si coagula se raggiunge i 15 gradi centigradi. Scongelare il rBM sul ghiaccio sia durante la notte a 4 gradi centigradi o 2-4 h a temperatura ambiente (RT) prima della placcatura.
    1. Scongelare rBM sul ghiaccio (vedi Tabella dei materiali).
    2. Conservare piastre e serbatoi (se avvolti singolarmente) sul ghiaccio prima dell'uso.
    3. Eseguire i passaggi 1.1.1-1.1.4.
    4. Riempire l'anello esterno dei pozzetti con 1x PBS o mezzo di crescita per ridurre l'evaporazione dai pozzi rimanenti. Diluire la sospensione cellulare in un tubo da 15 mL per ottenere 0,5-2 x 104 celle/mL (è necessario determinare la densità ottimale delle celle per ogni linea cellulare) (Figura 1A (ii)).
    5. Posizionare il tubo da 15 mL contenente la sospensione cellulare diluita sul ghiaccio (ad esempio, nel bicchiere di vetro) (Figura 1A (iia)).
    6. Trasferire le piastre refrigerate e i serbatoi sul cofano. Sciacquare i contenitori di plastica, riempirli di ghiaccio e trasferirli nel cofano per consentire alle piastre e ai serbatoi di essere posizionati sul ghiaccio durante l'intera procedura.
    7. Risospendere delicatamente rBM per garantire un gel omogeneo.
    8. Aggiungere 1-2% rBM (è necessario determinare la concentrazione ottimale per ogni linea cellulare) alle sospensioni cellulari refrigerate (Figura 1A (iib)).
    9. Invertire il tubo da 15 mL per garantire la corretta miscelazione di rBM e sospensioni cellulari prima di erogare la sospensione nella piastra.
    10. Trasferire la sospensione cellulare contenente rBM in un serbatoio sterile e erogare 200 .l/well in un attacco ultra-basso refrigerato a olio combustibile mediante una pipetta multicanale (Figura 1A (iii)).
      NOT: Se si lavora con diverse sospensioni cellulari (ad esempio, più di una linea cellulare), è essenziale erogare ogni sospensione cellulare immediatamente dopo l'aggiunta di rBM per evitare gelling prematuro.
    11. Centrifugare la piastra per 15 min a 750 x g utilizzando 'soft decent'/no frenata (se possibile, centrifugare a 4 gradi centigradi più a lungo, ma non un requisito per la formazione di sferoidi di successo), per garantire che le cellule siano raggruppate insieme quando il rBM indurisce, facilitando la formazione di un singolo sferoide.
    12. Incubare la piastra in un'incubatrice (37gradi centigradi, 5% CO 2, 95% di umidità).
    13. Ogni 2-3 giorni acquisiscono immagini microscopiche leggere per la valutazione della crescita degli sferoidi.
    14. Ogni 2-3 giorni sostituire 100 lofun (rimuovere 100 L e con 100 lofoni di mezzo fresco).
  4. Spheroids goccia appesa.
    1. Eseguire il passaggio 1.1.1-1.1.4.
    2. Diluire le cellule per ottenere una diluizione adeguata. Una diluizione pratica è di 50.000 cellule/mL.
    3. Rimuovere il coperchio di un piatto di coltura cellulare 10 cm2 e posizionarlo in modo che si affaccia verso l'alto. Aggiungere 6 mL di 1x PBS al piatto (Figura 1B (i)).
    4. Versare la sospensione cellulare in un serbatoio sterile e posizionare con cura fino a 30 gocce di 40 -L di sospensione cellulare sul coperchio del pinto di coltura cellulare utilizzando una pipetta multicanale (Figura 1B (ii)), con conseguente concentrazione di 2.000 cellule / goccia. Evitare di posizionare le gocce troppo vicino al bordo del coperchio in quanto queste gocce hanno maggiori probabilità di perdere tensione superficiale quando si inverte il coperchio nel passaggio successivo.
    5. Invertire il coperchio in un movimento rapido ma controllato e posizionarlo sopra il 1x piatto di coltura cellulare contenente PBS (Figura 1B (iii)).
    6. Mettete il piatto in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 e il 95% di umidità senza disturbare le gocce e lasciatele crescere per 4-6 giorni.
    7. Se da utilizzare per le tali proteine o l'incorporamento, sferoidi da piscina rimuovendo il coperchio e inclinarlo, al fine di lavare le gocce con 1 mL di mezzo riscaldato. Trasferire il mezzo risultante contenente sferoidi in un tubo da 1,5 mL e lasciarli depositare sul fondo del tubo. Procedere come descritto in 4.4 e 6.2.2 per i lismi proteici e l'incorporamento, rispettivamente.

2. Trattamento farmacologico degli sferoidi

NOT: Il trattamento farmacologico a lungo termine può essere applicato agli sferoidi al fine di verificare gli effetti di un farmaco di interesse. Prima di iniziare il trattamento farmacologico, si consiglia di eseguire un esperimento di risposta alla dose del farmaco(dei) al fine di trovare una dose appropriata per il trattamento sperimentale. Le dosi devono essere basate sulla determinata IC50/Ki del farmaco e variano da circa 0.2x-10x di questo valore.

  1. Impostare 6-12 sferoidi per la condizione desiderata come descritto in 1.2 o 1.3 e collocare nell'incubatrice (37 C, 5% CO2, 95% di umidità) per 2 giorni.
  2. Il secondo giorno, scatta immagini microscopiche degli sferoidi.
  3. Preparare le prime dosi di trattamento (dopo l'acquisizione delle immagini).
    NOT: La prima concentrazione di trattamento deve essere due volte la concentrazione finale desiderata in quanto la soluzione sarà diluita 1:2 oltre al pozzo contenente 100 . Intervalli di trattamento farmacologico suggeriti (dipenderà dall'emivita della droga): Giorno 2, 4 e 7.
  4. Utilizzando una pipetta multicanale, rimuovere delicatamente 100 l'l di mezzo e sostituirlo con 100 - L di farmaco contenente mezzo.
  5. Rimettere la piastra di 96 pozzeri nell'incubatrice a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 e 95% di umidità e ripetere 2,3 e 2,4 nei giorni di trattamento scelti, ma ora senza raddoppiare la dose per ottenere la dose finale corretta.
  6. L'ultimo giorno del programma di protocollo/trattamento, è possibile eseguire uno o più dei seguenti saggi.

3. Esempio di realizzo per la vitalità delle cellule per gli sferoidi

  1. Impostare 4-6 sferoidi per la condizione desiderata, come descritto in 1.2 o 1.3 e collocare nell'incubatrice a 37 gradi centigradi con 5% di CO2 e 95% di umidità.
    NOT: In questo caso, il saggio di fattibilità cellulare è stato eseguito il giorno 7 o 9, dopo aver monitorato la crescita dello sferoide ogni 2-3 giorni con microscopia leggera come descritto sopra (punto 1.2.5 e 1.3.13).
  2. Scongelare il reagente di saggio di fattibilità (vedi Tabella deimateriali) e lasciarlo equilivitare a RT prima dell'uso.
  3. Mescolare delicatamente invertendo per ottenere una soluzione omogenea.
  4. Prima di eseguire il pesimo, rimuovere il 50% del mezzo di coltura dagli sferoidi (100 l).
  5. Aggiungere il reagente di fattibilità delle cellule a ogni pozzo con un rapporto 1:3 alla quantità di mezzo presente nel pozzo (Figura 2A (i)) Per una piastra di 96 pozze, aggiungere 50 l di reagente a 100 .
  6. Mescolare vigorosamente il contenuto per 5 min per indurre la lisi cellulare (Figura 2A (ii)).
  7. Incubare per 25 min a RT per stabilizzare il segnale luminescente (Figura 2A (iii)).
  8. Registrare il segnale luminescente (Figura 2A (iv)).

4. Preparazione di proteine lisates per Western Blotting da 3D Spheroid Cultures

NOT: Quando si raccolgono gli sferoidi, si consiglia di utilizzare una pipetta P200 e tagliare la fine della punta per consentire un'apertura più grande e quindi una cattura più facile degli sferoidi senza disturbare la loro struttura.

  1. Per ogni condizione, piscina un minimo di 12, idealmente 18-24 sferoidi (a seconda delle dimensioni dello sferoide) in un tubo da 1,5 mL (evitare tubi da 2 mL, come i prossimi passi diventeranno più difficili a causa del loro fondo meno punta).
    NOT: Se la quantità di mezzo supera 1,5 mL prima di aver raccolto tutti gli sferoidi, lasciare che gli sferoidi raccolti si stabiliscano sul fondo (accade molto rapidamente, la centrifugazione non necessaria) e scartare la metà del volume del tubo prima di continuare a raccogliere il sferoidi rimanenti.
  2. Posizionare i tubi sul ghiaccio e lasciare che gli sferoidi si depositino sul fondo del tubo da 1,5 mL.
  3. Passare dal laboratorio di cellule sterili al laboratorio regolare.
  4. Lavare gli sferoidi due volte in 1 mL di 1x PBS ghiacciato. Lasciare che gli sferoidi si stabilizzino prima di rimuovere 1x PBS tra ogni passo di lavaggio.
  5. Aspirare il più 1x PBS possibile senza disturbare o rimuovere gli sferoidi.
  6. Aggiungere 5 l'l ofst lis (LB) con inibitori di fosforo e proteasi, per sferoide (ad es., 10 sferoidi - 50 LB).
  7. Ripetere gli intervalli di vortice seguiti da spin down fino a quando gli sferoidi non vengono sciolti. Eseguire un ciclo di vortice per 30 s seguito da centrifugazione (un giro rapido utilizzando una centrifuga tavolo è sufficiente) per 10 s per circa 5-10 min a seconda delle dimensioni e la compattezza degli sferoidi.
    NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Mantenere i lisati a -20 gradi centigradi fino a procedere con la sonicazione, l'omogeneizzazione e la determinazione delle proteine come in un protocollo di lisato di proteine 2D standard, seguito da gonfiore occidentale utilizzando protocolli standard.

5. Iodide propidio (PI) Colorazione degli Sferoidi

  1. Impostare 3-6 sferoidi per condizione desiderata come descritto in 1.2 o 1.3 e posizionare nell'incubatrice a 37 sC con 5% di CO2 e 95% umidità.
  2. In un laboratorio sterile di coltura cellulare, riscaldare 1x PBS a 37 gradi centigradi.
  3. Fare una soluzione PI di 4 M diluindo la soluzione stock in 1x PBS: Diluire uno stock di 1 mg/mL aqueous di PI 1:350 in 1x PBS.
    NOT: Questa concentrazione sarà ulteriormente dimezzata dopo l'aggiunta della soluzione ai pozzi dando una concentrazione finale di 2 M. 100 L di questa soluzione è necessaria per ogni pozzo contenente uno sferoide.
    ATTENZIONE: Propidium iodide (PI) deve essere maneggiato in un cofano fumatore e indossare guanti. PI è sensibile alla luce. Proteggere dalla luce durante la manipolazione.
  4. Rimuovere 100 l' del mezzo da ogni pozzo nella piastra del pozzo 96 senza rimuovere gli sferoidi.
  5. Lavare il mezzo rimanente aggiungendo 100 luna di 1x PBS riscaldata a tutti i pozze seguite dalla rimozione di 100 l del liquido nei pozze. Ripetere questo passaggio di lavaggio 3 volte.
  6. Aggiungete 100 l della soluzione PI ad ogni pozzo, coprite la piastra in un foglio di alluminio e mettetela in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con 5% di CO2 e 95% di umidità per 10-15 min.
  7. Ripetere i 3 passaggi di lavaggio descritti in 4.5 per lavare la soluzione PI, al fine di ridurre il segnale di fondo durante l'imaging.
  8. Utilizzare un microscopio a epifluorescenza per immaginare gli sferoidi. Per valutare la vitalità delle cellule nel nucleo sferoide prendere z-stacks per ottenere immagini con profondità variabili dello sferoide.
    NOT: Si consiglia una dimensione di passo di circa 18-35 m tra ogni fetta a seconda delle dimensioni dello sferoide, dando circa 11-18 pile per sferoide. Gli stack z possono essere elaborati in ImageJ utilizzando la funzione z-projection, che può combinare tutti gli z-stack in un'unica immagine finale, fornendo una panoramica della colorazione in tutto lo sferoide (per ulteriori linee guida sull'uso di ImageJ a questo scopo, vedi (https://imagej.net/Z-functions).

6. Incorporamento di Spheroid 3D

  1. Preparare il gel di agarose in cui sono incorporati gli sferoidi (necessario solo la prima volta che si esegue il protocollo).
    1. Mescolare 1 g di bactoag in 50 mL di ddH2O.
    2. Riscaldare lentamente in forno a microonde fino a quando il bactoagar si è dissolto e si è formato un gel omogeneo. Non far bollire il gel.
    3. Mantenere il bactoragar caldo in un bagno d'acqua a 60 gradi centigradi.
    4. Mantenere a 4 gradi centigradi tra un esperimento e l'altro.
  2. Incorporamento di sferoidi.
    1. Il primo giorno per ogni condizione, mettere in piscina un minimo di 12 sferoidi in un tubo da 1,5 mL.
    2. Lavare una volta con 1 mL di 1x PBS ghiacciato.
    3. Per riparare gli sferoidi, aggiungere 1 mL del 4% di paraformaldeide.
      NOT: La manipolazione della paraformaldeide deve essere eseguita in una cappa di fumi.
    4. Lasciarli incubare per 24 h a RT.
    5. Il giorno 2, riscaldare con cura il gel di agarose mettendolo in un becher pieno d'acqua in un forno a microonde. Assicurarsi che il gel non bolle! Mantenere caldo in una piastra di riscaldamento panca, a 60 gradi centigradi fino all'uso.
    6. Lavare gli sferoidi due volte con 1 mL di 1x PBS ghiacciato.
    7. Aspirate la maggior parte del 1x PBS (lasciando circa 100 L a questo punto è pratico per la gestione degli sferoidi).
    8. Preparare una pipetta da 20 l,l tagliando la punta della pipetta in pendenza, per ottenere una punta più puntista con un foro più grande (vedi figura).
      NOT: La parte successiva deve essere fatta rapidamente per garantire un trasferimento ottimale dello sferoide ed evitare la solidificazione della caduta di gel. Se non è disponibile alcun blocco di riscaldamento, si consiglia di catturare prima gli sferoidi e poi far cadere l'agarose (cioè, cambiando l'ordine dei punti 6.2.9 e 6.2.10).
    9. Fare una goccia di gel agarose su un vetrino del microscopio. Posizionare il vetrino su un blocco riscaldante caldo per evitare che l'agarose si solidifica.
    10. Utilizzando la punta della pipetta modificata (vedi 6.2.8), prendi il maggior numero possibile di sferoidi in un volume di 15-20 l.
    11. Iniettare con cura il 1x PBS contenente sferoide da 15 20 litri al centro della goccia di gel di agarose senza toccare il vetrino del microscopio.
      NOT: Questo è un punto un po' difficile. Gli sferoidi andranno persi se la punta della pipetta tocca il vetrino del microscopio quando si iniettano gli sferoidi nella goccia di gel. Si consiglia di praticare l'intero processo di fare la goccia di agarose e iniettare gli sferoidi iniettando un liquido colorato nella goccia. Ciò consentirà la visualizzazione di una potenziale penetrazione attraverso la goccia, in quanto il liquido colorato fuoriesce sulla diapositiva.
    12. Lasciare indurire il gel di agarose incubando per 5-10 min a RT o a 4 gradi centigradi. Una volta che la goccia di gel si è solidificata un po '(ma è ancora piuttosto morbido), spingere con attenzione la goccia di gel dal vetrino del microscopio in una cassetta di tessuto di plastica con un bisturi.
    13. Coprire le cassette dei tessuti plastici nel 70% di etanolo.
      NOT: A questo punto gli sferoidi possono essere utilizzati direttamente o conservati per mesi.
    14. Incorporare lo sferoide incorporato in paraffina, la sezione in scivoli di strato spessi 2-3 m e la macchia con ematossialina ed eosina o soggetti a colorazione immuno-istologica.

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Risultati

I saggi di crescita dello spheroid basati sul protocollo di formazione degli sferoidi schematicamente illustrati nella Figura 1A e nella Figura 1Bsono stati utilizzati come punto di partenza per l'analisi degli effetti dei trattamenti farmacologici anti-cancro in un tumore 3D imitando l'impostazione. La facilità con cui si formano sferoidi è specifica della linea cellulare, e alcune linee cellulari richiedono il completamento co...

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Discussione

L'uso di sferoidi delle cellule tumorali 3D si è dimostrato uno strumento prezioso e versatile non solo per lo screening farmacologico anticancro, ma anche per ottenere informazioni meccanicistiche sulla regolazione della morte e della vitalità delle cellule tumorali in condizioni che imitano quelle nel tumore Microambiente. Ciò è particolarmente importante in quanto l'accessibilità, l'assorbimento cellulare e gli effetti intracellulari dei farmaci chemioterapici sono profondamente influenzati dalle condizioni fisico-chi...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Siamo grati a Katrine Franklin Mark e Annette Bartels per l'eccellente assistenza tecnica e ad Asbjàrn N'hr-Nielsen per l'esecuzione degli esperimenti in Figura 1D. Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione Einar Willumsen, dalla Novo Nordisk Foundation e dalla Fondation Juchum (tutti a SFP).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2-(4-amidinofenil)-1H-indolo-6-carbossamidina (DAPI)Invitrogen# C10595 Per la colorazione dei nuclei
5-Fluorouracile (5-FU)Sigma-Aldrich#F6627Componente nel trattamento chemioterapico
5-(N-etil-isopropil) amiloride (EIPA)Life Technologies#E3111Inibitore dell'anticorpo NHE1
contro PARP e cPARPSegnalazione cellulare#9542Utilizzato nel western blotting
Anticorpo contro Ki-67Segnalazione cellulare#9449Utilizzato per IHC
Anticorpo contro lasegnalazione cellulare#2524 Utilizzato per IHC
Anticorpo contro la β-actinaSigma A5441Utilizzato nel western blotting
BactoagarBD Bioscience#214010Utilizzato per la preparazione di gel di agarosio
Scala proteica di riferimentoInvitrogen#10747-012Utilizzato per SDS-PAGE
Kit di analisi delle proteine Bio-Rad DC Bio-RadLaboratories#500-0113, #500-0114, #500-0115   Utilizzato per la determinazione delle proteine dai lisati
Bü camera di raffreddamentoMarienfeld610311Per il conteggio delle cellule 
Microscopio per epifluorescenza BX63OlympusUtilizzato per l'imaging fluorescente
CellTiter-Glo 3D Cell Viability AssayPromega#G9681Utilizzato per il test di vitalità cellulare
CisplatinoSigma-Aldrich#P4394 Componente nel trattamento chemioterapico
Micropiastra sferoidale Corning, 96 pozzetti, nera con fondo rotondo trasparente,  Attacco ultra-basso, con coperchio, Corning sterile#4520Utilizzato per la coltivazione di sferoidi con misure di luminescenza come punto finale
Corning 96 bene, fondo rotondo chiaro,  Micropiastra a bassissimo attacco, Con coperchio, SterileCorning#7007Sufficiente per la crescita di sferoidi senza misurazioni della luminescenza come punto finale
Criterion TGX Precast GelsBio-Rad5671025Utilizzato per SDS-PAGE
DoxorubicinaAbcam#120629Componente nel trattamento chemioterapico
FLUOStar Optima Lettore di micropiastreBMG LabtechUtilizzato per la registrazione della luminescenza 
Formaldeide VWR Chemicals #9713.1000 Utilizzato per la fissazione cellulare
Matrice della membrana basale a fattore di crescita ridotto senza Geltrex LDEVGibco#A1413202mantenere a 4 ° C per prevenire la solidificazione. Indicato come rBM nel protocollo.
FBSSigma#F9665a caldo per terreni di crescita
ImageJNIHScientific Analisi delle immagini
Medim Uni-safe casetteMedim Histotechnologie10-0114Utilizzato per la conservazione di sferoidi incorporati
Mini compresse da cocktail di inibitori della proteasiRoche Diagnostics GmBH # 11836153001Utilizzato per la preparazione del tampone di lisi
Microscopio MZ16LeicaUtilizzato per immagini al microscopio ottico
NuPAGE LDS 4x Sample Buffer Invitrogen#NP0007Utilizzato per il western blotting
Pierce ECL Substrato western blottingThermo scientific#32106Utilizzato per il western blotting
Ponceau SSigma-Aldrich#P7170-1LUtilizzato per la colorazione delle bande proteiche
Prism 6.0GraphpadSoftware scientifico per grafici e statistici
Ioduro di propidio (soluzione 1mg/ml in acqua)Invitrogen P3566Sensibile alla luce 
Serbatoi sterili,multicanale SPL lifesciences21002Utilizzato per la semina di cellule per la formazione di sferoidi
Superfrost Ultra-Plus Scivolo di adesioneMenzel-Glä ser#J3800AMNZVetrino per microscopio utilizzato per l'inclusione
TamoxifenSigma-Aldrich#T5648Utilizzato come trattamento chemioterapico
Trans-blot Turbo 0.2 µ m membrane in nitrocellulosaBio-Rad#170-4159Utilizzato per il western blotting
Tris/Glycine/SDS running buffer Bio-Rad #161 0732Utilizzato per la soluzione SDS-PAGE
Tripsina-EDTASigma#T4174 Enzima di dissociazione cellulare
p53 Siero inattivato di

Riferimenti

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