Toracico Spinal Cord Emisezione Chirurgia e valutazione locomotoria a campo aperto nel ratto

La lesione del midollo spinale (SCI) è associata a gravi disturbi nella funzione motoria, sensoriale e autonomica. I modelli animali sperimentali di SCI sono strumenti preziosi per comprendere gli eventi anatomici e fisiologici coinvolti nella patologia SCI, per studiare i meccanismi neurali nella riparazione e nel recupero e per valutare l'efficacia e la sicurezza di potenziali terapie Interventi. Il ratto è la specie più comunemente utilizzata nella ricerca SCI¹. I modelli di ratto sono a basso costo, sono facili da riprodurre e una grande batteria di test comportamentali sono disponibili per valutare i risultati funzionali². Nonostante alcune differenze nelle posizioni del tratto, il midollo spinale del ratto condivide nel complesso funzioni sensomotorie simili con i mammiferi più grandi, compresi i primati^3,4. I ratti condividono anche conseguenze fisiologiche e comportamentali analoghe alla SCI che si riferiscono agli esseri umani⁵. I primati non umani e i grandi modelli animali possono fornire un'approssimazione più ravvicinata della SCI⁶ umana e sono essenziali per dimostrare la sicurezza e l'efficacia del trattamento prima della sperimentazione umana, ma sono meno comunemente utilizzati a causa del benessere etico e animale considerazioni, spese e requisiti normativi⁷.

I modelli SCI di transezione del ratto vengono eseguiti dall'interruzione mirata del midollo spinale con una lesione selettiva utilizzando un coltello di dissezione o forbici iridectomia dopo una laminectomia. Rispetto a una transsezione completa, la transezione parziale nel ratto si traduce in una lesione meno grave, una più facile cura degli animali postoperatori, un recupero locomotore spontaneo e modelli più strettamente spettrali di SCI negli esseri umani, che è prevalentemente incompleto con la parsimonia parziale tessuto che collega il midollo spinale e le strutture sovraspinali⁸. Un'emisezione unilaterale interrompe tutti i tratti ascendenti e discendenti da un solo lato e produce deficit locomotori quantificabili e altamente riproducibili, migliorando l'esplorazione dei meccanismi biologici sottostanti. La conseguenza funzionale più prominente dell'emisezione è una paralisi iniziale degli arti sullo stesso lato e al di sotto del livello della lesione con recupero spontaneo graduato della funzione locomotoria per diverse settimane^{9,10, 11 Del} sistema di ^{, 12.}Il modello dell'emisezione è particolarmente utile per studiare la plasticità neurale dei tratti e dei circuiti danneggiati e residui associati al recupero funzionale^{9,11,12, 13,14,15,16,17,18}. In particolare, l'emisezione eseguita a livello toracico, cioè sopra i circuiti spinali che controllano la locomozione degli arti posteriori, è particolarmente utile per studiare i cambiamenti nel controllo locomotore. Poiché esiste una relazione non lineare tra la gravità delle lesioni e il recupero locomotorio dopo SCI¹⁹, un test comportamentale appropriato per valutare i risultati funzionali è fondamentale nei modelli sperimentali.

Una batteria completa di test comportamentali sono disponibili per valutare aspetti specifici del recupero locomotore funzionale nel ratto^2,20. Molti test locomotori non forniscono misure affidabili nelle prime fasi successive alla SCI, in quanto i ratti sono troppo disabili per sostenere il loro peso corporeo. Una misura delle prestazioni postmotorie spontanee sensibili ai deficit precocemente dopo l'infortunio e non richiede un allenamento preoperatorio o attrezzature specializzate è utile per monitorare il recupero locomotore per i punti di tempo appropriati in cui integrare test comportamentali specializzati. Il punteggio di valutazione open-field Martinez¹⁰, originariamente sviluppato per valutare le prestazioni del locomotore dopo la SCI cervicale nel ratto, è un punteggio ordinale di 20 punti che valuta le prestazioni locomotorie globali durante la locomozione sotterranea spontanea in un campo aperto. Il punteggio viene condotto separatamente per ogni arto utilizzando una rubrica che valuta parametri specifici di una serie di misure locomotorie, tra cui il movimento degli arti articolari, il supporto del peso, la posizione della cifra, le capacità di stepping, la coordinazione degli arti anteriori e dell'arto posteriore e la coda posizione. Il punteggio di valutazione è derivato dalla scala di valutazione open-field Basso, Beattie e Bresnahan (BBB) progettata per valutare le prestazioni locomotorie dopo la contusione toracica²¹. È adattato per valutare in modo accurato e affidabile sia la funzione locomotore anteriore che quella degli arti posteriori, consente una valutazione indipendente dei diversi parametri di punteggio che non sono disponibili con il punteggio gerarchico della BBB e fornisce un recupero lineare profilo¹⁰. Inoltre, rispetto alla BBB, il punteggio di valutazione è sensibile e affidabile nei modelli di infortunipiù più gravi^10,11,20,22. Il punteggio di valutazione è stato utilizzato per valutare la compromissione locomotoria nel ratto dopo la sierzia^10,12 e la sola SCI toracica⁹ e in combinazione con lesioni cerebrali traumatiche²³.

Vi presentiamo qui un protocollo dettagliato passo-passo per l'esecuzione di un'emisezione toracica SCI a livello vertebrale T8 nel ratto femmina Long-Evans, e per valutare il recupero locomotore degli arti posteriori nel campo aperto.

Gli esperimenti descritti in questo articolo sono stati effettuati in conformità con le linee guida del Canadian Council on Animal Care e sono stati approvati dal comitato etico dell'Università di Montréal.

1. Chirurgia dell'emisezione toracica

1. Indossare attrezzature protettive adeguate (guanti, maschera e abito) per mantenere un ambiente asettico per la chirurgia. Pulire l'area chirurgica con salviette alcoliche e posizionare tende chirurgiche sterili sul campo chirurgico. Sterilizzare strumenti chirurgici e posizionare sul campo chirurgico.
2. Anestesizzare il ratto sotto una miscela di gas isoflurano (3% di induzione, 0,5,3% di manutenzione) e ossigeno (1 L/min). Confermare la corretta profondità anestetica chirurgica verificando l'assenza di pizzico di dita dei tempi e risposte riflesso corneale. Monitorare continuamente il ratto durante l'intera procedura e regolare la quantità di somministrazione anestetica necessaria per mantenere la profondità anestetica chirurgica.
3. Rasare il tronco dorsale tra l'anca e il collo, posizionare il ratto sul campo chirurgico, disinfettare il sito di incisione con salviette alcoliche e soluzione di suviodina e mantenere la temperatura corporea del nucleo a 37 gradi centigradi utilizzando un pad di riscaldamento a basso consumo di feedback monitorato da rettale termometro.
4. Posizionare unguento oftalmico sugli occhi per mantenerli idratati e riapplicare durante l'intervento chirurgico come richiesto.
5. Fai un'incisione di 2,5 cm nella pelle sovrapponendo le vertebre T6-T10 con un bisturi. Ritrarre la pelle e il grasso superficiale utilizzando forbici dissezione smussata.
   NOTA: I segmenti vertebrali T6-T10 possono essere identificati o di palpazione delicata dei segmenti dorsali spinali dalla base del cranio a partire dalla protuberanza evidente della 2^nd toracica vertebra^24,o caudalmente da palpazione della costola galleggiante più posteriore che indurrà il movimento nelle vertebre toraciche 13 thoracic.
6. Separare i muscoli paravertebrali inserendo l'aspetto dorsale delle vertebre T7-T9 utilizzando forbici dissezione contundente e un retrattore auto-trasteninte. Debride e cancellare qualsiasi tessuto rimanente utilizzando pinze sottili e applicatori ribaltati cotone per esporre i processi spinosi e laminae vertebrali.
   NOTA: Questo, e i seguenti passaggi sono molto aiutati dalla visualizzazione microscopica (5 x15x).
7. Tagliare con cura le sfaccettature (articolazioni zigofisici) bilateralmente sulle vertebre T7 e T8 con delicati trimmer ossei. Tagliare il tessuto connettivo dorsale tra la laminae vertebrale T8 e T9 superficialmente con un bisturi (profondità 1 mm) facendo attenzione a non ferire il cavo sottostante.
8. Rimuovere il processo spinoso della vertebra T8 con trimmer ossei. Con pinze emostatiche curve accuratamente bloccate sul processo spinoso T7, ruotare leggermente l'estremità caudale della laminae T8 ( s. 20), inserire i trimmer ossei sotto la lamina T8 e fare un taglio della linea mediana che si estende lungo la lamina. Continuare la laminectomia ripetendo i tagli sul lato sinistro e destro della lamina vertebrale mediale ai processi trasversali per esporre il midollo spinale.
   NOTA: Fare attenzione a rimuovere tutti i frammenti ossei creati dalla laminectomia.
9. Drip lidocaine (2%, 0,1 mL) nel canale spinale esposto e rimuovere la dura sovrapponendo il segmento spinale T8 utilizzando pinze sottili e forbici iridectomia. Ripetere la somministrazione di lidocaina al cavo esposto e identificare la linea mediana del cavo mediante la visualizzazione di una linea centrale creata tra i processi spinosi che si estendono tra le vertebre T7-T9 esposte.
   NOTA: Insieme ai processi spinosi su T7 e T9, i gangli della radice dorsale esposti su T8 possono essere utilizzati anche per facilitare l'identificazione della linea mediana e un ago da 30 G può essere posizionato nella linea mediana del cordone per facilitare la successiva emisezione.
10. Emisete il midollo spinale dalla linea mediana verso un lato con un coltello di santina. Fare attenzione a non tagliare l'arteria spinale anteriore sul lato ventrale (non applicare una pressione ferma al corpo vertebrale). Utilizzando forbici iridectomia, tagliare con attenzione qualsiasi tessuto rimanente sul lato lesionato del midollo spinale per garantire che il quadrante ventrolaterale sia opportunamente transecuato.
11. Posizionare la spugna emostatica sterile imbevuta di saline (6 x 2 mm) nella cavità esposta sopra il midollo spinale e suturare gli strati muscolari (4-0 polyglactin 910). Successivamente, suturare la pelle intorno al sito di incisione.
12. Fornire un'adeguata analgesica (buprenorphine 0,05 mg/kg sottocutanea [s.c.]), antibiotica (enrofloxacin, 10 mg/kg s.c.) e ricostituire i fluidi persi con la soluzione della suoneria lattante di 5 cc (intraperitoneale [i.p.]) immediatamente dopo l'intervento chirurgico.
13. Rimuovere il ratto dall'anestesia. Collocare il ratto in un ambiente caldo sotto una piastra di riscaldamento o una lampada (33 gradi centigradi) fino a quando l'animale non è completamente sveglio.
14. Fornire analgesia supplementare ogni giorno nel corso dei primi 3 giorni post-chirurgici e monitorare continuamente per i segni di dolore, perdita di peso, minzione impropria, infezione, problemi con la guarigione della ferita, o autofagia.

2. Procedura di test a campo aperto e punteggio delle prestazioni locomotore

1. Maneggiare i ratti ogni giorno per 1 settimana e abituarli all'arena per due sessioni di 5 minuti prima del test per acclimatarsi ad essere raccolti, delicatamente da metà del tronco, mentre si è in campo aperto e per garantire l'affidabilità di misurazione durante i test.
2. Posiziona una telecamera a livello del suolo di fronte all'arena circolare a campo in plexiglass per registrare le sessioni di test per l'analisi offline (minimo 30-60 fotogrammi/s).
3. Iniziare la registrazione video e posizionare il ratto al centro dell'arena in condizioni di scarsa illuminazione per incoraggiare l'attività locomotoria.
4. Continuare la sessione di prova per 4 min per garantire una quantità adeguata di bout locomotori per l'analisi. Raccogliere e sostituire i ratti al centro dell'arena quando rimangono fermi per più di 20 s per promuovere la locomozione.
5. Punteggio prestazioni locomotore della sessione di test registrata completando la rubrica fornita inTavola 1in base ai parametri nelle seguenti sottosezioni.
   NOTA: è utile assegnare un punteggio a ciascun parametro separatamente dalla visualizzazione ripetuta della sessione di test registrata utilizzando un software che consente la velocità di riproduzione variabile e l'analisi fotogramma per fotogramma (ad esempio, lettore multimediale VLC).
   1. Per i movimenti articolari degli arti, segnare movimenti articolari dell'arto posteriore durante la locomozione spontanea separatamente per la caviglia, il ginocchio e l'anca come normale (più della metà della gamma di movimento, punteggio assegnato n. 2), lieve (meno della metà della gamma di movimento, punteggio premiato 1) o assente (punteggio assegnato n. 0).
   2. Per il supporto del peso, valutare la capacità dei muscoli estensori dell'arto posteriore di contrarsi e sostenere il peso corporeo caricato quando l'arto è a terra separatamente per quando il ratto è fermo e durante la locomozione attiva. Assegnare un punteggio pari a 1 quando il supporto di peso è presente e un punteggio pari a 0 quando il supporto di peso è assente.
      NOTA: il supporto del peso stazionario è considerato un gateway per il supporto del peso attivo.
   3. Per la posizione della cifra, valutare la posizione delle cifre dell'arto posteriore mentre il ratto è fermo e durante la locomozione. Assegnare un punteggio di 2 quando le cifre dell'arto posteriore sono estese, distanziatele l'una dall'altra e toniche durante la locomozione in più del 50% del periodo di prova (considerate normali). Assegna un punteggio pari a 1 quando le cifre rimangono prevalentemente flesse e un punteggio pari a 0 quando le cifre rimangono prevalentemente atoniche.
   4. Per il stepping, completare questo parametro solo se il ratto è in grado di sostenere il peso corporeo durante il stepping. Valutare il passo valutando l'orientamento del posizionamento della zampa dell'arto posteriore al momento del contatto iniziale e al decollo da terra, oltre alla fluidità della fase di oscillazione durante il passo.
      NOTA: Ci sono 3 punteggi per questo parametro descritti nelle seguenti sottosezioni valutando separatamente: 1) l'orientamento assiale del posizionamento delle zampe al contatto degli arti (posizionamento dorsale/plantaro), 2) l'orientamento longitudinale del posizionamento delle zampe al contatto iniziale e durante il sollevamento (parallelo all'asse del corpo o ruotato internamente/esternamente) e 3) la qualità del movimento degli arti durante l'oscillazione (regolare o irregolare).
      1. Per il posizionamento della zampa a contatto con l'arto, segnare l'orientamento assiale del posizionamento della zampa al contatto dell'arto come 0 quando i posizionamenti dorsali si verificano in più del 50% dei passaggi.
         NOTA: il posizionamento Planttar è considerato un prerequisito per segnare l'orientamento della zampa al contatto e dell'ascensore (passaggio 2.5.4.2), il movimento dell'oscillazione (passaggio 2.5.4.3) e la coordinazione dell'arto posteriore (passaggio 2.5.5).
      2. Per l'orientamento della zampa al contatto e al sollevamento degli arti, assegnare un punteggio di 2 quando la zampa longitudinale e gli assi del corpo sono paralleli e un punteggio di 1 quando l'arto viene ruotato esternamente o internamente, separatamente sia per il contatto dell'arto che per il sollevamento.
      3. Per il movimento swing, assegnare un punteggio di 2 quando le articolazioni degli arti posteriori si muovono in modo armonioso e regolare durante lo swing e una score di 1 quando i movimenti a scatti o spasmodici delle articolazioni si verificano durante lo swing.
   5. Per la coordinazione dell'arto anteriore-zampe posteriore, completare questo parametro solo se si verificano 4 passaggi consecutivi durante i test e se gli arti possono sostenere attivamente il peso corporeo. Assegnare un punteggio pari a 3 quando il coordinamento è coerente (>90% dei passaggi), 2 quando frequenti (50-90% di passaggi), 1 quando sono occasionali (<50% di passaggi) o 0 quando è assente (0% dei passaggi).
      NOTA: La coordinazione dell'arto anteriore-zampe posteriore è definita come un'alternanza regolare nel passaggio tra l'arto posteriore segnato e l'arto anteriore sullo stesso lato del corpo.
   6. Per la posizione della coda, valuta la posizione della coda durante la locomozione come verso l'alto (da terra, con punteggio assegnato : 1) o verso il basso (toccando il terreno, assegnato punteggio : 0).
      NOTA: Una posizione elevata della coda durante la locomozione è un indicatore della stabilità del tronco nel ratto. Dopo l'emisezione, la coda viene normalmente tenuta vicino o toccata il suolo quando la stabilità del tronco è compromessa.
   7. Aggiungere i singoli punteggi di ogni parametro per fornire un totale per ogni limb posteriore di un massimo di 20 punti.
      NOTA: Un punteggio di 20 indica le normali prestazioni locomotorie. I punteggi <20 rappresentano quantità crescenti di compromissione locomotoria e un punteggio pari a 0 indica la paralisi degli arti.

Le lesioni riproducibili con un alto grado di coerenza possono essere generate con la tecnica dell'emisezione. Per valutare e confrontare le dimensioni delle lesioni tra gruppi sperimentali, l'area massima della lesione come percentuale della sezione trasversale totale del midollo spinale può essere facilmente calcolata con la colorazione istologica delle sezioni del midollo spinale. La figura 1 mostra una lesione rappresentativa dell'emicordone sinistra e una sovrapposizione della proporzione dell'area massima di lesione condivisa tra i ratti con una dimensione media della lesione del 47,3% - 4,0% dell'area del cavo trasversale (n - 6).

Figura 1: Lesioni spinali rappresentative. (A) Microfotografia di una sezione spinale coronale all'epicentro di lesioni di un ratto emimted macchiato di cresyl viola (corpi cellulari, viola) e blu veloce luxol (mielina, blu) che indica danni alla materia grigia e bianca concentrata a sinistra l'emicordo. D, dorsale; V, ventrale; L, a sinistra; R, giusto. Barra della scala:1 mm. (B ) Sovrapposizione schematica della proporzione condivisa dell'area massima delle lesioni in un gruppo di ratti (n - 6). La posizione del tratto corticospinale incrociato nel funicolo dorsale sul lato destro è ombreggiata in nero. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La conseguenza principale dell'emisezione è una paralisi iniziale dell'arto posteriore sul lato della lesione durante i primi due o tre giorni postoperatori. Le prestazioni locomotorie dell'arto posteriore più colpito migliorano rapidamente nel ratto dopo l'emisezione nelle prime settimane dopo l'infortunio. Piccoli deficit nell'arto posteriore opposto sono comunemente osservati inizialmente dopo l'emisezione che può riflettere la compensazione per l'arto più colpito, o deficit derivanti da una mancanza di stabilità posturale, supporto di peso, e passo coerente passo. Un grande deficit persistente nell'arto posteriore opposto indicherebbe una lesione bilaterale che si estende nell'emicordo opposto.

Nella tabella 1 viene fornita una rubrica di punteggio delle prestazioni locomotoria di esempio.

Tabella 1: Esempio di foglio di punteggio. Esempio di rubrica per il punteggio delle prestazioni locomotori. Per ogni parametro, i punteggi possibili sono indicati tra parentesi. I, interno; E, esterno; P, parallelo; FL-HL, arti anteriori-posteriori. Fare clic qui per scaricare questo file.

Il corso temporale delle variazioni rappresentative delle prestazioni locomotorie nello stato intatto e nelle prime cinque settimane dopo un'emisezione laterale sinistra in gruppi separati di ratti (n - 6 per gruppo) è raffigurato nella Figura 2.

Figura 2: Corso rappresentativo del tempo dei cambiamenti nelle prestazioni locomotorie degli arti posteriori all'aperto nello stato intatto e per cinque settimane dopo un'emisezione toracica laterale sinistra. Le prestazioni dell'arto posteriore sinistro (A) sono significativamente compromesse dai valori intatti durante le prime tre settimane dopo l'emisezione e dell'arto posteriore destro (B)durante la prima settimana dopo l'emisezione. I dati vengono tracciati come media del gruppo e deviazione standard (SD; n - 6 per gruppo). Le analisi statistiche sono state eseguite con test non parametrici Kruskal-Wallis integrati con i molteplici test di confronto di Dunn per valutare le differenze di gruppo tra i punti temporali. < 0,05, p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.