Amputazione e rigenerazione delle cifre del mouse adulto: un modello semplice per indagare sulla formazione del Blastema mammario e sull'ossificazione intramembranosa

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo di amputazione della falange terminale dei topi adulti per studiare la formazione di blastema mammifero e l'ossificazione intramembranosa, analizzata dall'immunohistochimica fluorescente e dalla tomografia microcalcolata in vivo sequenziale.

Abstract

Qui, presentiamo un protocollo di amputazione terminale distale distale adulto (P3), un modello di mammifero procedurale semplice e riproducibile di rigenerazione epimorfica, che coinvolge la formazione di blastema e l'ossificazione intramembrana analizzata da immunohistochimica a fluorescenza e tomografia microcalcolata in vivo sequenziale (CT). La rigenerazione dei mammiferi è limitata alle amputazioni che trasmettono la regione distale della falange terminale (P3); le cifre amputate a livelli più prossimali non riescono a rigenerare e a subire la guarigione fibrotica e la formazione di cicatrici. La risposta di rigenerazione è mediata dalla formazione di un blastema proliferante, seguita dalla rigenerazione ossea tramite ossificazione intramembranosa per ripristinare la lunghezza scheletrica amputata. L'amputazione P3 è un modello preclinico per studiare la rigenerazione epimorfica nei mammiferi ed è un potente strumento per la progettazione di strategie terapeutiche per sostituire la guarigione fibrotica con una risposta rigenerativa di successo. Il nostro protocollo utilizza l'immunohistochimica a fluorescenza a 1) identificare le popolazioni di cellule di blastema precoce e tardiva, 2) studiare la rivascolarizzazione nel contesto della rigenerazione, e 3) studiare l'ossificazione intramembranosa senza la necessità di ossa complesse dispositivi di stabilizzazione. Dimostriamo anche l'uso di immagini sequenziali in vivo per creare immagini ad alta risoluzione per esaminare i cambiamenti morfologici dopo l'amputazione, nonché quantificare i cambiamenti di volume e lunghezza nella stessa cifra nel corso della rigenerazione. Crediamo che questo protocollo offra un'enorme utilità per studiare le risposte epimorfiche e rigenerative dei tessuti nei mammiferi.

Introduzione

I mammiferi, compresi gli esseri umani e i topi, hanno la capacità di rigenerare le punte delle loro cifre dopo l'amputazione distale della falange terminale (P3)^1,2^,3. Nei topi, la risposta di rigenerazione è dipendente dal livello di amputazione; amputazioni a cifre sempre più prossimal mostrano una risposta rigenerativa progressivamente attenuata fino al completo fallimento rigenerativo alle amputazioni che trasmettono e proximal alla matrice di unghie P3^{4,5,6 ,}

Protocollo

Tutti gli animali e le tecniche erano conformi alle procedure operative standard dell'Institutional Animal Care and Use Committee della Texas A&M University.

1. Amputazione P3 dell'artino posteriore del topo adulto

1. Anestesizzare un topo CD-1 da 8 a12 settimane utilizzando il gas isoflurano in ossigeno; inizialmente anestesizzare al 3% in una camera, seguita dal 2% isoflurane fornito da un nosecone per tutta la durata dell'intervento. Applicare unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
   NOT: Gli studi di amputazione P3 per adulti standardizzati nel nostro labor....

Risultati

I topo adulti che rigenerano le cifre P3 a 6/7 DPA (Figura 2A-D),9 DPA (Figura 2E-H)e 10 DPA (Figura 2I-L) sono stati immunostainse con anticorpi a Runx2, OSX e PCNA per visualizzare l'osso intramembranoso rigenerazione e immunostaincato con anticorpi a CXCR4 e vWF per visualizzare la formazione di blastema. I rendering di cFR rappresentativi delle cifre scansionate prima dell'amput.......

Discussione

Questo protocollo descrive una procedura standardizzata di amputazione P3 del topo adulto, colorazione immunohistochimica fluorescente per visualizzare e analizzare la formazione di blastema e l'ossificazione intramembranosa, e la scansione sequenziale in-vivo identificare i cambiamenti morfologici ossei, di volume e di lunghezza dopo l'amputazione. L'amputazione P3 è un modello unico, proceduralmente semplice e riproducibile per analizzare un ambiente di ferite pro-rigenerativo che innesca la formazione di blastema. Ino.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siero a blocchi proteici senza	DAKO	X0909	Pronto all'uso
Anticorpo anti-PCNA di topo	Abcam	ab29	Diluizione 1:2000
Anticorpo anti-CXCR4 di ratto	R& D Systems	MAB21651	diluizione 1:500
Anticorpo vWF XIII di coniglio	DAKO	A0082	Diluizione 1:800
Anti-osterix di coniglio, anticorpo SP7	Abcam	ab22552	diluizione 1:400
Anticorpo anti-Runx2 di coniglio	Sigma-Aldrich Co.	HPA022040	Diluizione 1:250
Alexa Fluor 647-capra coniugata anti-topo IgG (H+L)	Invitrogen	A21235	Diluizione 1:500
Alexa Fluor 488-capra coniugata anti-coniglio IgG (H+L)	Invitrogen	A11008	Diluizione 1:500
Alexa Fluor 568-capra coniugata anti-ratto IgG (H+L)	Invitrogen	A11077	Diluizione 1:500
Prolong Gold reagente	anti-dissolvenzaInvitrogen	P36930
Decalicificatore Surgipath	Leica Biosystems	3800400	Pronto all'uso
Z-Fix, Fissativo acquoso in formalina di zinco tamponato	Anatech LTD	174	Pronto all'uso
CD-1 Femmina di topo	Envigo	ICR(CD-1)	VivaCT 40 SCANCO
	Medical

pronto all'uso 1 di 8-12 settimane