Misurazione di BK-poliomavirus Non-Coding Control Region Guidato Attività Trascrizionional Via Flusso Cytometry

Summary

In questo manoscritto, viene presentato un protocollo per eseguire la misurazione basata su FACS dell'attività trascrizionale BK-poliomavirus utilizzando cellule HEK293T trascate da un plasmide reporter bidirezionale che esprime tdTomato ed eGFP. Questo metodo permette inoltre di determinare quantitativamente l'influenza di nuovi composti sulla trascrizione virale.

Abstract

I poliomavirus, come il BK-poliomavirus (BKPyV), possono causare gravi patologie nei pazienti immunocompromessi. Tuttavia, poiché attualmente non sono disponibili antivirali altamente efficaci, sono necessari metodi che misurano l'impatto di potenziali agenti antivirali. Qui, è stato costruito un reporter a doppia fluorescenza che consente l'analisi dell'attività di promotrice bKPyV basata sulla regione di controllo non codificante (NCCR) in anticipo e in ritardo per quantificare l'impatto di potenziali farmaci antivirali sull'espressione genica virale tramite tdTomato ed eGFP espressione. Inoltre, clonando gli amplificatori BKPyV-NCCR che in questo protocollo sono stati esemplificati dal DNA derivato dal sangue dei pazienti trapiantati renali immunocompromessi, è possibile determinare l'impatto dei riarrangiamenti NCCR sull'espressione genica virale. Dopo la clonazione del paziente derivato amplicons, le cellule HEK293T sono state trascate con il reporter-plasmidi e trattate con potenziali agenti antivirali. Successivamente, le cellule sono state sottoposte all'analisi FACS per misurare le intensità medie di fluorescenza 72 h dopo la trasfezione. Per testare anche l'analisi dei farmaci che hanno un potenziale effetto di inibizione del ciclo cellulare, vengono utilizzate solo cellule trasfette e quindi fluorescenti. Poiché questo saggio viene eseguito in grandi cellule che esprimono l'antigene T, l'impatto dell'espressione precoce e tardiva può essere analizzato in modo reciprocamente indipendente.

Introduction

I poliomavirus rappresentano una famiglia indipendente di piccoli virus di DNA a doppio filamento (dsDNA) con il virus Simian 40 (SV40) come specie prototipo. L'infezione primaria si verifica principalmente durante l'infanzia, che di solito procede senza sintomi di malattia e di solito causano infezioni latenti in ospiti immunitari competenti. Il BK-poliomavirus (BKPyV) persiste principalmente nelle cellule dei tubuli renali senza causare nefropatologie, tuttavia, in caso di compromissione della competenza immunitaria dopo il trapianto renale il virus può riattivarsi e causare gravi danni e alterati innesti quando si raggiunge una viremia alta (1 x 10⁴ BKPyV copie di DNA/mL)^1,2. In circa il 10% dei destinatari del trapianto di rene, la riattivazione del bK-poliomavirus (BKPyV) si traduce in un poliomavirus associato a nefropatia (PyVAN), che è stato fino all'80% associato ad un alto rischio di fallimenti di allotrapianto renale^3,4 . Poiché non sono disponibili agenti antivirali approvati, la terapia attuale si basa sulla riduzione dell'immunosoppressione. È interessante notare che gli inibitori di mTOR sembrano avere un effetto antivirale; pertanto, il passaggio della terapia immunosoppressiva all'immunosoppressione a base di mTOR potrebbe rappresentare un approccio alternativo per prevenire la progressione della viremia BKPyV^5,6,7. Tuttavia, il meccanismo antivirale basato su mTOR è attualmente ancora incompleto. Pertanto, sono necessari metodi che misurano l'impatto di potenziali agenti antivirali in concentrazioni clinicamente rilevanti.

Il genoma circolare del BKPyV è costituito da circa 5 kb che ospitano una regione di controllo non codificante (NCCR) che funge da origine della replicazione e concomitante un promotore bidirezionale che guida l'espressione di trascrizioni di mRNA di fase precoce e tardiva. Poiché si verificano spontaneamente riarrangiamenti, delezioni e duplicazioni di NCCR si trovano in BKPyV⁸ patogeni e significativamente accumulati in pazienti affetti da PVAN^5,9, un confronto di archetipico (wt) e ri-organizzato (rr) NCCR-attività sono utili per caratterizzare la forma replicativa virale.

Come riassunto nella Figura 1, questo protocollo descrive un metodo comunemente usato per misurare l'attività trascrizionale BKPyV NCCR quantificando la fluorescenza di due fluorofori tdTomato ed eGFP espressi da un plotone reporter^{5, 9,10,11}. La procedura viene eseguita in presenza del grande antigene T SV40 (lTAg), che permette di analizzare separatamente l'impatto di potenziali agenti antivirali sulla attività NCCR precoce e tardiva 5 . Questo analisi analizza ulteriormente l'impatto dei riarrangiamenti sull'attività della NCCR e il confronto con wt-NCCR^5,9. Il plotone reporter ospita il segnale di poliadenilazione tardiva SV40 a valle di ogni telaio di lettura aperto del fluoroforo per garantire un'elaborazione comparabile ed efficiente di entrambe le trascrizioni per tdTomato ed eGFP, rispettivamente. Rispetto ai metodi basati su qRT-PCR^5,12, questo approccio basato su FACS rappresenta un'alternativa compatibile a basso costo e ad alta velocità effettiva poiché nessun protocollo di estrazione complicato per la coltura cellulare infetta e non costoso anticorpi per la colorazione della fluorescenza immunitaria. Inoltre, poiché una quantità definita di cellule fluorescenti viene analizzata tramite la citometria di flusso, l'analisi degli agenti inibitori del ciclo cellulare è possibile anche in modo quantitativo.

Protocol

Questo protocollo segue le linee guida della ricerca umana, come approvato dal comitato etico della facoltà di medicina dell'Università di Duisburg-Essen (14-6028-BO).

1. Raccolta di campioni di sangue o urina e isolamento del DNA poliomavirus

1. Raccogliere almeno 3 mL di sangue in tubi EDTA o urina in tubi di acquisizione.
2. Centrifugare il campione a 2.500 x g per 15 min. Se necessario, pipetta plasma in un nuovo tubo e conservare i campioni di plasma a 4 gradi centigradi per diversi giorni o congelare a -20 gradi per un deposito più lungo.
3. Preparate 40 l di proteine assi K in un tubo di microcentrismo da 1,5 ml e aggiungete 400 l di plasma pipettando.
4. Lesiilililcampione sommando 400 l di tampone di lisi, vortice per 15 s, e incubare per 10 min a 56 gradi centigradi.
5. Isolare il DNA utilizzando un kit di estrazione del sangue del DNA come descritto nelle istruzioni del produttore. In breve, aggiungere alcol e caricare le lisa su una colonna di spin contenente una membrana a base di silice legante il DNA. Lavare le colonne più volte per produrre DNA puro.
6. Eluire il DNA prodotto in 30-50 l di TE buffer.

2. Amplificazione della regione di controllo non codificante (NCCR)

1. Eseguire la procedura seguente in locali fisicamente separati. Utilizzare una stanza isolata per preparare i reagenti e distribuire il mix ai tubi PCR.
2. Preparare il Master Mix per il pre-PCR utilizzando la coppia di primer A (Tabella 1) in un volume totale di 50 gradi centigradi e utilizzare il DNA precedentemente isolato dal passaggio 1.6. Lo schema di pipettaggio per la preparazione del master mix per la PCR pre e nidificata viene stampato nella tabella 2.
3. Distribuire 45 ll l della miscela master nei tubi PCR.
4. Aggiungere 5 - L del DNA isolato nei tubi PCR.
   NOTA: Utilizzare un'altra stanza a quella per la preparazione del mix master per evitare la contaminazione.
5. Eseguire la PCR con le condizioni di reazione, come illustrato nella tabella 3. Ripetere la denaturazione, l'annessione e l'estensione in 35 cicli.
6. Per l'amplificazione nidificata utilizzare primer coppia B che ospita i siti di restrizione per AgeI e SpeI (Tabella 1).
7. Eseguire la PCR nidificata con le condizioni di reazione descritte nei passaggi da 2,2 a 2,5 utilizzando 5 lofdeli del pre-PCR.
8. Mescolare 10 l del prodotto PCR con 2 ll di 6x gel loading coloranti. Caricare 10 l della miscela su un gel di agarose dell'1,5% e far funzionare il gel per 30 min a 60 mA.
9. Visualizzare il gel utilizzando un sistema di documentazione UV appropriato.
   NOTA: si prevede che la dimensione dell'amplificatore sia compresa tra 300 e 500 bp a seconda che si siano verificati riarrangiamenti (eliminazioni, inserimenti o duplicazioni) (Figura2C).
10. Purificare gli amplificatori PCR utilizzando un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore. Elute i PCR amplificano in 30 - L di tampone di eluizione.
11. Invia gli amplicons per il sequenziamento di Sanger usando la coppia di primer B.

3. Clonazione del NCCR nel giornalista a doppia fluorescenza

1. Digerire gli amplificatori purificati (passaggio 2.10) con AgeI e SpeI per 2 h a 37 gradi centigradi, come descritto nella tabella 4.
2. Ripetere il passaggio 2.10 e purificare gli amplificatori digeriti.
3. Parallelamente, digerire anche la spina dorsale del plasmide (1,5 g) con AgeI e SpeI per 2 h a 37 gradi centigradi, come descritto nella tabella 5. Questo passaggio deve essere eseguito una sola volta. Per le reazioni successive, congelare la digestione a -20 gradi centigradi.
4. Analizzare la spina dorsale del plasmide digerito su un gel agarose a bassa fusione dello 0,8%.
   NOTA: Non far funzionare il gel con una corrente superiore a 40 mA. L'inserimento previsto della regione distanziale originariamente derivato dal pEX-K4 2-LTR CD3¹³ è di 128 bp (Figura 2C).
5. Visualizza i frammenti di DNA usando la luce UV a onde lunghe (320 nm) e ritaglia la banda della spina dorsale usando un bisturi pulito. Trasferire il frammento di gel a bassa fusione in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Evitare lunghi tempi di esposizione ai raggi UV per prevenire danni al DNA.
   NOTA: Poiché viene utilizzata l'agarose a bassa fusione, non è necessario purificare il DNA prima della legatura.
6. Riscaldare la spina dorsale contenente il pezzo di agarose a bassa fusione per 10 minuti a 65 gradi centigradi al fine di sciogliere il pezzo di gel e mescolare ogni 2 min da vortice delicato. Il gel fuso può essere utilizzato direttamente per la legatura.
7. Ligate la spina dorsale e l'amplificatore digerito utilizzando T4 DNA ligase durante la notte a 16 gradi centigradi utilizzando lo schema mostrato nella tabella 6.
8. Eseguire la trasformazione in E. coli utilizzando il metodo di shock termico, i batteri delle piastre sulle piastre LB-amp e la coltura a 37 gradi centigradi durante la notte.
9. Il giorno successivo, selezionare tre cloni positivi e preparare le colture E. coli durante la notte (5 mL di LB-Amp) e la coltura a 37 gradi centigradi.
10. Isolare il DNA plasmide utilizzando protocolli standard come descritto altrove¹⁴, eseguire la digestione AgeI e SpeI per verificare la presenza di cloni positivi e visualizzare frammenti tagliati su un gel di agarose 1%. La banda distanziale (128 bp) sarà sostituita dalla sequenza NCCR più grande (300-500 bp, vedi sopra).
11. Inviare il plasmide per il sequenziamento di Sanger utilizzando primer EGFP-N o la coppia di primer B (Tabella1).
12. Poiché le mutazioni potrebbero verificarsi spontaneamente, confrontare i risultati del sequenziamento con i risultati del sequenziamento ottenuti con l'amplificatore. Utilizzare solo i cloni contenenti sequenze identiche rispetto all'amplificatore.
13. Utilizzare un software di workbench molecolare (ad esempio, freeware GENtle 1.9.4 o altri programmi di editing di sequenze) per allineare e modificare le sequenze ottenute (Figura 3).
14. Avviare GENtle 1.9.4 e importare le sequenze di DNA facendo clic sul pulsante Importa (freccia verde rivolta verso il basso).
15. Quindi, fare clic su Strumento e selezionare Allineamento dal menu (Usa Ctrl-G come scorciatoia) e scegliere le sequenze di DNA per l'allineamento.
16. Aggiungere una sequenza all'allineamento facendo clic su Aggiungi o rimuovi una sequenza facendo clic su Rimuovi. Includere una sequenza di consenso NCCR archetipica come JN192438¹⁵, non utilizzare la sequenza NCCR dal Comunemente usato Dunlop-strain¹⁶, dal momento che ospita riarrangiamenti e duplicato altri rispetto all'archetipico BKPyV Ceppi.
    NOTA: il NCCR contiene già il codone di avvio traslazionale (Figura 3).
17. Scegliere un metodo per l'allineamento facendo clic su Algoritmo nella barra degli strumenti e scegliere clustal W. Impostare i parametri di allineamento in modo che corrispondano a 2; penalità estensione gap -1; penalità gap -2 e fare clic su OK per eseguire l'allineamento.

4. Trasfezione transitoria delle cellule HEK293T con il plasmide reporter e trattamento con potenziali agenti antivirali

1. Per preparare una quantità sufficiente di DNA plasmide per i successivi esperimenti di trasfezione preparare una coltura overnight 150 mL. Isolare il DNA plasmico utilizzando un kit di isolamento plasmide. In alternativa, possono essere utilizzati altri kit di purificazione plasmida.
2. Seme 1 x 10^{5 cellule} HEK293T in DMEM contenenti 10% FCS, penicillina e streptomicina (1x) per pozzo di una piastra di 12 pozzetti 24 h prima della trasfezione e incubare durante la notte a 37 gradi centigradi e 5% CO₂ per mantenere la proliferazione attiva durante la transfezione.
   NOTA: Le cellule devono essere circa l'80% di confluenti alla trasfezione.
3. Mettete 250 l di supporto siero ridotto in un tubo sterile e aggiungete 1 g di ogni schiaffeggiatore e mescolate delicatamente pipettando.
4. Aggiungere 3 -L del reagente di trasfezione alla miscela di DNA, mescolare delicatamente pipettando e incubare per 15 min. Pre riscaldare il reagente di trasfezione alla temperatura ambiente di 22 gradi centigradi e vortice delicatamente prima dell'uso.
5. Aggiungere la miscela goccia-saggio ai pozzi e distribuire delicatamente al pozzo.
6. Dopo 4 h, sostituire il supernatante con un nuovo mezzo contenente gli agenti di prova e il controllo del solvente. Incubare a 37 gradi centigradi fino all'analisi. In questo esempio, sono stati utilizzati gli inibitori mTOR INK128 (100 ng/mL) e la rapamicicina (100 ng/mL).

5. Microscopia a fluorescenza e citometria di flusso

1. Controllare le celle per la fluorescenza rossa e verde al microscopio a fluorescenza (Figura 4).
   NOTA: la fluorescenza rossa e verde corrisponde rispettivamente all'espressione genica BKPyV precoce e tarda.
2. Dopo 72 h di post-trasfezione, aspirare il supernatante e lavare le cellule due volte con 1 mL di PBS freddo.
3. Aggiungere delicatamente 500 l di propsina e ruotare leggermente la piastra per evitare il distacco prematuro delle cellule. Questo passaggio è importante per evitare i doppietto cellulari.
4. Dopo l'addizione, rimuovere la trypsin direttamente con la stessa punta di pipetta.
5. Incubare le cellule per almeno 5 min a 37 gradi centigradi.
6. Risospendere le celle tripsinate con 1 mL di PBS contenenti il 3% di FCS e trasferire le sospensioni in tubi FACS pre-etichettati.
7. Aggiungere daPI (1 g/mL) prima dell'analisi FACS.
8. Analizzare le cellule utilizzando un citometro di flusso. Per ogni campione, misurare almeno 10.000 cellule viventi, che sono negative per la colorazione DAPI.

6. Analisi dei dati

1. Importare i dati nel software di analisi della citometria del flusso e aggiungere campioni facendo clic e trascinando nell'area di lavoro.
2. Fare doppio clic sul file importato e creare un grafico. Scegliere FSC-A e SSC-A facendo clic sugli assi x e y. Cancellare la popolazione di celle principale facendo clic su Poligono sulla barra degli strumenti e inquadrando la popolazione di celle (Figura 5). Assegnare alla popolazione di celle scelta il nome necessario (ad esempio "celle singole"). Le "celle singole" verranno visualizzate come un nuovo spazio di lavoro.
3. Procedere con il gating "singole celle" per DAPI negativo (cioè, "cellule viventi"). Identificare le cellule viventi confrontare la popolazione cellulare con e senza colorazione DAPI. In entrambi i grafici scegliere FSC-A contro pacific-blue-A.
4. Fare clic sul rettangolo e scegliere la popolazione di cellule negative DAPI, denominare la popolazione cellulare scelta "celle viventi" e creare un nuovo grafico a punti che mostri FITC (eGFP) e PE (tdTomato) come descritto in precedenza.
5. Aggiungere quadranti in "celle viventi" scegliendo Quad dalla barra degli strumenti. Cancellare la popolazione trascinando il centro del quadrante sul bordo di ogni popolazione. I quadranti rappresentano 1) eGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOM, 3) eGFP-tdTOM-, 4) eGFP-tdTOM.
   NOTA: a causa della sovrapposizione spettrale degli spettri di emissione tra FITC e PE, la compensazione iniziale è essenziale per distinguere tra segnali rossi e verdi e per ottenere risultati accurati.
6. Determinare le intensità di fluorescenza media (MMI) facendo clic con il pulsante destro del mouse sul quadrante e scegliendo Aggiungi statistiche. Scegliere Media e fare clic su OK. La IFM media è ora visualizzata sotto la popolazione nella sezione "statistiche". I quadranti 2 e 4 corrispondono all'espressione iniziale, mentre i quadranti 3 e 4 rappresentano l'espressione tardiva.
7. Aggiungere ulteriori repliche nello stesso modo per la potenza statistica.
8. Per l'interpretazione dei dati tracciare i valori DI FIM di inizio e in ritardo in un grafico a barre:
9. Per confrontare le attività NCCR ottenute da diversi donatori o ceppi di virus, aggiungere un controllo archetipico o il ceppo Dunlop¹⁶ e impostare le sue Unità MMI relative al 100% e calcolare i valori MFI relativi. Ripetere con ogni replica e determinare la media e la deviazione standard.
10. Per valutare un effetto di potenziali composti sull'attività trascrizionale, impostare il controllo del solvente al 100% e tracciare le IFM delle cellule trattate.

Results

In questo esperimento rappresentativo, l'attività trascrizionale guidata dalla regione di controllo non codificabil Inoltre, un inibitore mTOR, che potrebbe essere usato per trattare i pazienti dopo la riattivazione di BKPyV, è stato testato per la sua inibizione dell'espressione genica precoce virale. A tal fine, un saggio a doppia fluorescenza-reporter è stato utilizzato come pubblicato in precedenza⁵. Lo schema di flusso di lavoro complessivo dell'installazione ...

Discussion

In questo articolo viene presentato un metodo comunemente usato che consente l'analisi dell'attività BKPyV di controllo non codificante (NCCR) guidata in anticipo e in ritardo. L'attività NCCR può essere misurata simultaneamente e non necessita di lisi delle cellule trafette. Inoltre, è possibile analizzare un numero relativamente elevato di cellule e non è necessaria la co-trasfezione di marcatori aggiuntivi per la normalizzazione dei valori di fluorescenza.

Una parte fondamentale di questo m...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scala da 100 bp	NEB	N3231	Qualsiasi scala con una portata fino a 1 kb può essere sostituita Scala
2 tronchi	NEB	N0550	Qualsiasi scala con una portata fino a 10 kb può essere sostituita
Agar-Agar, Kobe I	Carl Roth	5210.3
AgeI-HF	NEB	R3552
Ampicillina Natriumsalz Cellpure	Carl Roth	HP62.1
Aqua ad iniectabilia	Bbraun	2351744	può essere sostituito da qualsiasi produttore
BD FACSCanto&; II	BD Biosciences
BD FACSDiva	BD Biosciences
DAPI	Sigma 10236276001
DFC450C modulo fotocamera	Leica		Qualsiasi fotocamera può essere utilizzata
DMEM	Gibco	41966-029	può essere sostituito da qualsiasi produttore
Microscopio LED DMIL	Leica		Qualsiasi microscopio a fluorescenza può essere utilizzato
DNA Blood Mini Kit	Qiagen	51104	può essere sostituito da qualsiasi produttore
E.coli DH5alpha Competent Cells	Thermo Scientific	18258012
FBS Superior	MerckMillipore	50615	Qualsiasi FBS può essere utilizzato
FlowJo v10.5.3	FlowJo, LLC		Qualsiasi software di citometria a flusso FBS può essere utilizzato
Gel Loading Dye, Purple (6X)	NEB	B7024	Qualsiasi colorante di carico 6x può essere sostituito
HEK293T cellule	ATCC	11268	Queste cellule esprimono costitutivamente l'antigene T grande del virus delle scimmie 40 (SV40) e il clone 17 è stato selezionato specificamente per la sua elevata trasfettabilità.
L'incubatore a CO2 HERAcell® 240i	Thermo Scientific		può essere sostituito da qualsiasi produttore
Kit PCR	HotStar Qiagen	203203
Sistema di documentazione Intas Gel Intas			Qualsiasi sistema di visualizzazione per DNA colorato contenente gel di agarosio Può essere utilizzato
850081	Biozima	di agarosio a basso punto di fusione	può essere sostituito da qualsiasi produttore
Opti-MEM	Invitrogen	31985070	può essere sostituito da qualsiasi produttore
pBKV (34-2)	ATCC	45025	Plasmide che ospita il genoma a lunghezza intera del ceppo BKPyV Dunlop; è stato utilizzato come controllo positivo; DNA Seq. Acc.: KP412983
PBS	Gibco	14190-136
PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler	Bio-Rad	prodotto fuori produzione	Qualsiasi termociclatore può essere utilizzato
PCR Nucleotide Mix, 10 mM	Promega	#C1145	può essere sostituito da qualsiasi produttore
PCR1 e PCR2 Primers	metabion	non applicabile	Dissalato. Diluire a (10 µ M) con acqua di grado PCR
PenStrep (100x)	Gibco	15140-122	può essere sostituito da qualsiasi produttore
Roti®-GelStain	Carl Roth	3865	Un colorante a base di fluorescenza per la misurazione della concentrazione di dsDNA
SpeI-HF	NEB	R3133
T4-DNA Ligasi	NEB	M0202
TransIT LT1	Mirus	MIR2300
Tripsina 0,05% - EDTA	Gibco	25300-054	può essere sostituito da qualsiasi produttore
Kit plasmidico ZymoPURE II	Zymo	D4201	può essere sostituito da qualsiasi produttore