Presentiamo un metodo utile per la sintesi e purificazione e depurazione esulla scala di specifici enantiomeri e regioisori di epossido di acido aracidonico (AA), acido docosaesaenoico (DHA) e acido eicosapentaeno (EPA) con l'uso di un citocromo batterico P450 enzima (BM3).
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Articolo metodologico
Sintesi ezimatica dei metaboliti epossidici degli acidi docosahexaenoici, eicosapentaenoici e aracidonici
In questo articolo
Sommario
Abstract
I metaboliti epossidizzati di vari acidi grassi polinsaturi (PUFA), rititi acidi grassi epossidici, hanno una vasta gamma di ruoli nella fisiologia umana. Questi metaboliti sono prodotti endogenamente dalla classe citocromatica P450 degli enzimi. A causa dei loro effetti biologici diversi e potenti, c'è un notevole interesse nello studio di questi metaboliti. Determinare i ruoli unici di questi metaboliti nel corpo è un compito difficile, in quanto gli acidi grassi epossidici devono prima essere ottenuti in quantità significative e con alta purezza. Ottenere composti da fonti naturali è spesso laborioso, e idrolasi epossido solubili (sEH) rapidamente idrolizzare i metaboliti. D'altra parte, ottenere questi metaboliti tramite reazioni chimiche è molto inefficiente, a causa della difficoltà di ottenere regioisomeri e enantiomeri puri, bassi rendimenti e vaste (e costose) purifiche. Qui, presentiamo un'efficiente sintesi enzimatica di 19(S), 20 (R)- e 16(S), 17(R)-epoxydocosatrapaenoiche acids (EDP) da DHA via epossidazione con BM3, un enzima batterico CYP450 isolato originariamente da Bacillus megaterium (che è prontamente espresso in Escherichia coli). La caratterizzazione e la determinazione della purezza vengono eseguite con spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR), cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e spettrometria di massa (MS). Questa procedura illustra i benefici della sintesi enzimatica dei metaboliti PUFA epoxy ed è applicabile all'epossidazione di altri acidi grassi, tra cui l'acido aracidonico (AA) e l'acido eicosapentaenoico (EPA) per produrre l'analogo epoxyeicosanoico acidi (EET) e gli acidi epossidicosaetui (EEQ), rispettivamente.
Introduzione
Come interesse per il ruolo che gli acidi grassi polinsaturi (in particolare gli acidi grassi polinsaturi omega-3 e omega-6) è cresciuto negli ultimi anni, i ricercatori hanno preso atto della vasta gamma di vantaggi interessanti che i loro metaboliti mostra. In particolare, i metaboliti dell'acido grasso epossidico prodotti dalla classe citocromatica P450 degli enzimi sono stati un grande punto focale. Ad esempio, molti epossido di PUFA, tra cui gli acidi epossieicosachichi (EET), gli acidi epoxydocosatrapaenoici (EDP) e gli acidi epossirossitetraenoici (EEQ), svolgono un ruolo critico nella regolazione della pressione sanguigna e dell'infiammazione1,2 , 3 (COM del nome , 4 DEL psu' , 5. È interessante notare che gli enantiomeri specifici e i regioisomeri degli epossido di AA e EPA sono noti per avere effetti variabili sull'vasoconstriction6,7. Mentre gli effetti fisiologici degli enantiomeri e dei regioisomeri degli EET e degli EEQ sono stati documentati, si sa poco sull'effetto degli analoghi acidi essidomiomiatori (EDP) formati dal DHA. L'uso diffuso dell'olio di pesce8, che è ricco sia di EPA che di DHA, ha suscitato interesse anche per gli EDP9. I benefici di questi integratori sono creduti per essere in parte a causa dei metaboliti DHA a valle (16,17-EDP e 19,20-EDP essendo il più abbondante) perché in vivo livelli di EDP si coordinano molto bene con la quantità di DHA nella dieta10, 11.
Lo studio dei meccanismi e degli obiettivi di questi acidi grassi epossidici mediante metabolomica, biologia chimica e altri metodi si è dimostrato impegnativo, in parte perché esistono come miscele di regio- e stereo-isomeri, e un metodo per ottenere quantità pure del anti-enantiomeri e regioisomers. I mezzi convenzionali per sintetizzare chimicamente questi composti si sono dimostrati inefficaci. L'uso di perossididi come l'acido meta-cloroperoxybenzoico per l'epossidica ha molti inconvenienti, in particolare la mancanza di selettività dell'epossidazione, che richiede una purificazione costosa e scrupolosa di singoli regiosori e enantiomeri. La sintesi totale dei metaboliti DHA ed EPA è possibile, ma soffre anche di inconvenienti che lo rendono poco pratico per la sintesi su larga scala come i costi elevati e le basse rese12,13. Una produzione complessiva efficiente può essere realizzata con sintesi enzimatica, poiché le reazioni enzimatiche sono regio- e stereoselettive14. Gli studi dimostrano che l'epossidizzazione epossimatica epossimatica di AA ed EPA (con BM3) è sia regiosesesese che enantiosese15,16,17,18, ma questa procedura non è stata testata con DHA, o su un grande scala. L'obiettivo generale del nostro metodo era quello di scalare e ottimizzare questa epossidazione chemiozimatica per produrre rapidamente quantità significative di acidi grassi epossidici puri come loro antiantiomeri individuali. Utilizzando il metodo qui presentato, i ricercatori hanno accesso a una strategia semplice ed economica per la sintesi di EDP e altri metaboliti epossidici PUFA.
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Protocollo
AVVISO: Consultare tutte le schede tecniche di sicurezza dei materiali pertinenti (MSDS) prima di utilizzare le sostanze chimiche elencate.
1. Espressione di tipo selvaggio BM3
- Inoculare pBS-BM3 trasinfezione DH5 E. coli (una generosa donazione dal Dr. F. Ann Walker) in 5 mL di brodo LB sterile con 0,5 mg di ampicillina aggiunto in un tubo di coltura 20 mL.
- Incubare la coltura cellulare in uno shaker a 37 gradi centigradi per 24 h a 200 giri/min. Aggiungere la coltura di avviamento notturno (5 mL) e 100 mg di ampicillina a 1 L di brodo Sterile LB in un pallone Fernbach o Erlenmeyer. Agitare a 37 gradi centigradi per 6 h a 200 giri/min, quindi a 30 gradi centigradi per 18 h a 200 giri/min.
- Raccogliere e centrifugare la coltura cellulare a 4 gradi centigradi per 10 min a 1.000 x g. Scartare il supernatante e conservare il pellet cellulare a -78 gradi centigradi fino alla purificazione degli enzimi.
NOTA: Il supernatante può essere sterilizzato chimicamente con il trattamento con candeggina o sterilizzato utilizzando un autoclave e poi versato nello scarico.
2. Purificazione di BM3.
-
Lisi cellulare
- Sbattere il pellet cellulare sul ghiaccio e risospendere in 40 mL di buffer di solubilizzazione a freddo ghiaccio (1m) (10 mM Tris, 0,01 mM fenilmetilmethylsulfonyl fluoride (PMSF;), 0,01 mM EDTA; pH 7,8).
AVVISO: il PMSF è tossico per contatto. - Mentre sul ghiaccio, sonicare le cellule per 1 min con un omogeneizzatore ad ultrasuoni (impostazione di potenza di uscita 10, dovere 100%), seguita da una rottura di 1 min sul ghiaccio al fine di lisizzare le cellule. Ripetere questa procedura 6 volte. Centrifugare la lisata cellulare a 4 gradi centigradi per 30 min a 11.000 x g per pellet detriti cellulari.
- Sbattere il pellet cellulare sul ghiaccio e risospendere in 40 mL di buffer di solubilizzazione a freddo ghiaccio (1m) (10 mM Tris, 0,01 mM fenilmetilmethylsulfonyl fluoride (PMSF;), 0,01 mM EDTA; pH 7,8).
-
Cromatografia affinità
- Preparare una forte colonna di cromatografia di scambio di anioni (vedi Tabella dei materiali; diametro: 2,8 cm x 6 cm, volume della colonna: 37 mL) lavando con 5 volumi di colonne (CV) del buffer A (10 mM Tris, pH 7,8) a 4 gradi centigradi.
- Aggiungere le linguetta delle cellule alla colonna equilibrata e lavare la colonna con 3 CV di tampone freddo A. Elute il BM3 lavando la colonna con tampone freddo B (10 mM Tris, 600 mM NaCl, 6 CV).
- Raccogliere la frazione eluente bruno-rossastro. Se la proteina non viene utilizzata immediatamente, mescolarla con un volume uguale di glicerolo e congelare il flash con azoto liquido. Conservare la soluzione congelata a -78 gradi centigradi.
3. Epossidazione del DHA da parte di BM3
- Preparare la reazione aggiungendo 0,308 g (0,940 mmol) di DHA in 18,8 mL di dimeilfossido (DMSO) a 2 L di buffer di reazione di agitazione (0,12 fosfato di potassio, 5 mM MgCl2, pH 7.4) insieme a 20 nM dell'enzima BM3 scongelato. La concentrazione di enzimi può essere determinata dal metodo di analisi spettrale monossido di carbonio/dithionite19.
- Mentre la soluzione si sta agitando, iniziare la reazione aggiungendo 1 equivalente di NADPH (nicotinamide adenina dinucleotide fosfato ridotto, sale tetrasodio, 0.808 g, 0.940 mmol) disciolto nel buffer di reazione. Mescolare la reazione per 30 min mentre l'aria bollente attraverso la miscela di reazione con un palloncino pieno d'aria attaccato a una siringa e ago.
- Utilizzando uno spettrofotometro (vedere Tabella deimateriali), controllare l'assorbimento della miscela di reazione a 340 nm per determinare se NADPH è esaurito. Se non vi è alcuna assorbimento rimanente che indica il consumo di NADPH, la reazione è completa.
NOTA: In genere, la reazione è completa dopo 30 min. - Spegnire la miscela di reazione aggiungendo lentamente 1 M di acido osalico, dropwise, fino a quando il pH della soluzione raggiunge 4.
4. Estrazione di EDP
- Estrarre la soluzione tampone spento con 2 L di etere dietillo (anidroso, privo di perossido) 3 volte. Raccogliere lo strato di etere (6 L) e asciugare con solfato di magnesio idroelettrico (MgSO4).
- Filtrare l'MgSO4 dalla soluzione e concentrare lo strato di etere essiccato su un evaporatore rotante per produrre il residuo EDP grezzo.
- Purificare il residuo mediante cromatografia a colonna flash (una cartuccia di silice da 40 g è sufficiente). Iniziare al 10% di acetato di etilico (EtOAc) in esagoni e rampa fino al 60% EtOAc in esagoni oltre 22 min.
NOTA: Tre picchi principali sono ottenuti e raccolti, eluindo nell'ordine di 1. DHA non reagito; 2. miscela di isomeri EDP; e 3. (normali prodotti di sovraossidazione (cfr. figura 1)). - Unire le frazioni e concentrarle sull'evaporatore rotativo. Da questo esempio, 0,074 g, (24%) DHA non reagito, 0,151 g (47%) di isomeri EDP, e 0,076 g, (22%) di-epossido sono stati ottenuti.
5. Esterificazione degli EDP, separazione di 16(S),17(R)- e 19(S),20(R)-EDP e saponificazione degli esteri
AGGIORNAMENTO: Il trimethylsilyldiazometathane (TMS-diazometae) è molto tossico sia per il contatto che per l'inalazione. Utilizzare solo in un cofano di fume con l'attrezzatura protettiva personale adeguata.
- Diluire gli epossido (0,151 g, 0,435 mmol) in una fiaschetta a fondo rotondo o piccola fiala con 2 mL di metanolo idrosotro (MeOH) e 3 mL di toluene anidride, aggiungere una barra di stir, e aggiungere TMS-diazometatano (1,2 semilari equivalenti, o 0,26 mL di una soluzione di 2 M in hexanes) sotto argon.
- Attendere 10 min e aggiungere ulteriore TMS-diazometano (0.050 mL) fino a quando non rimane un colore giallo pallido.
- Dopo 30 min, concentrare con cura la miscela utilizzando l'evaporatore rotante e purificare il residuo dalla cromatografia a colonna flash. Elute con 4% EtOAc in esagoni (utilizzando una colonna di gel di silice o cartuccia 40 g) per 22 min. In questo esempio, 19,20-EDP ester metil (0,116 g, 74%) e 16,17-EDP ester metile (0,029 g, 19%), sono stati ottenuti come oli chiari (rendimento totale, 93%).
- Raccogliere le frazioni contenenti i regioisomers edthyl ester purificati. 19(S), 20(R)-EDP metil ester eluise per prime, seguite da 16(S),17(R)-EDP ester metile.
- Se rimangono frazioni miste (contenenti entrambi gli isomeri; possono essere valutate mediante cromatografia a strato sottile (TLC) in 8:1 hexane/EtOAc e macchiate con permanganato di potassio (KMnO4)), ri-cromatografate con lo stesso sistema solvente di prima.
- Concentrare le frazioni contenenti i singoli regioisomers.
NOTA: a questo punto, l'identità e la purezza possono essere valutate da NMR (utilizzando CDCl3 come solvente; vedere la legenda per la figura 2). - Per convertire i singoli regioisomers di ester metile EDP alle loro forme acide, diluire l'ester EDP in THF:water (circa 0,7 mL/0,1 mmol di ester). Aggiungere 2 M aqueous LiOH (3 equivalenti molare) e mescolare durante la notte.
NOTA: la completezza della reazione può essere valutata da TLC, utilizzando 3:1 exanes/EtOAc, colorazione con KMnO4; il prodotto ha un fattore di ritenzione di 0,3 USD. - Spegnire lentamente la reazione con l'acido formico, fino a quando il pH della miscela raggiunge 3-4. Aggiungere acqua ed acetato etilico (1-2 mL/0,100 mmol di ester) e separare gli strati. Estrarre lo strato d'acqua con EtOAc (3 x 5 mL), lavare con soluzione salamoia satura (NaCl) e asciugare lo strato EtOAc sopra anhydrous solfato di sodio (Na2SO4).
- Concentrare la soluzione di acetato etiliato utilizzando un evaporatore rotante, aggiungere esanei (10 mL) e concentrarsi di nuovo. Ripetere due volte per azeotropicale rimuovere l'acido formica residuo. Purificare il residuo dalla cromatografia a colonna flash, eluindo con 10-30% EtOAc oltre 15 min.
- Concentrare le frazioni desiderate e asciugare in vacuo per permettersi l'acido purificato.
NOTA: In questa fase, la purezza enantiomerica può essere valutata (da HPLC chirale, vedere le leggende per Figura 3 - Figura 4 per colonna e condizioni). La purezza chimica può essere valutata da C18 (achiral) HPLC (vedi Tabella dei materiali e riferimento 14).
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Risultati
Il cromatogramma della colonna flash (eseguito utilizzando un sistema di purificazione flash automatizzato come descritto di seguito) ottenuto dopo la purificazione della miscela grezza dall'epossidiva esossimatica ezimatica è mostrato nella Figura 1. Dopo l'esterificazione e la separazione dei regioisori, sono stati ottenuti i puri 16(S),17(R)-EDP e 19(S),20(R)-EDP esters metil. In genere, sono presenti in un rapporto appr...
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Discussione
Vi presentiamo qui un metodo operativamente semplice ed economico per preparare i due metaboliti epossidici più abbondanti del DHA - 19,20 e 16,17-EDP. Questi acidi grassi epossidici possono essere preparati in forma altamente enantiopure (come il loro S,R-isomers) utilizzando l'enzima BM3 di tipo selvatico. Diversi punti critici che possono essere utilizzati per la risoluzione dei problemi, e l'estensione del nostro metodo per la preparazione di metaboliti epossidi enantiopure di AA ed EPA, sono descritti di se...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è finanziato da R00 ES024806 (National Institutes of Health), DMS-1761320 (National Science Foundation) e fondi di avvio dalla Michigan State University. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Jun Yang (Università della California a Davis) e Lalitha Karchalla (Michigan State University) per l'assistenza con l'ottimizzazione della reazione enzimatica, e il Dr. Tony Schilmiller (MSU Mass Spectromometria e Metabolomics Facility) per assistenza con l'acquisizione dei dati HRMS.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Bicarbonato di ammonio | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillina | GoldBio | A30125 | NA |
| Solfato di magnesio anidro | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Metanolo anidro | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Solfato di sodio anidro | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Anidro toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Acido arachidonico (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Sensibile all'aria. |
| Etere dietilico | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (grado di biologia molecolare) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Acido docosaesaenoico (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Sensibile all'aria. |
| EDTA (acido etilendiamminotetraacetico) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Acido eicosapentaenoico (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Sensibile all'aria. |
| Acetato di etile | Sigma | 34858 | NA |
| Cartucce per colonne Flash da 25, 40, 4, 12 g Fisher | Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | In alternativa, è possibile utilizzare la cromatografia convenzionale su colonna |
| Acido formico (grado HPLC) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glicerolo | Sigma | G7757 | NA |
| Esani | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Brodo | Sigma | L3022 | NA |
| Idrossido di litio | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Cloruro di magnesio | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Metanolo (grado HPLC) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Sale tetrasodico | Sigma-Aldrich | 481973 | sensibile all'aria. |
| Acido ossalico | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 trasfettato DH5&alfa; E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF (fenilmetanosulfonilfluoruro) | Sigma | P7626 | Tossico! |
| Permanganato di potassio | Sigma-Aldrich | 223468 | per la colorazione TLC. |
| Fosfato di potassio bibasico | Sigma | 795496 | NA |
| Fosfato di potassio monobasico | Sigma | 795488 | NA Q |
| Sepharose Resina a flusso rapido (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | Per la purificazione a scambio anionico dell'enzima |
| cloruro di sodio | Sigma | 71376 | NA |
| Tetraidrofurano, anidro | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazometano (2,0 M in esani) | Sigma-Aldrich | 362832 | Molto tossico. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| Necessario anche: | |||
| Sistema di purificazione flash automatico (abbiamo usato un Buchi Reveleris X2) | Buchi | ||
| C18 (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Centrifuga Agilent | ||
| capace di 10.000 x g | |||
| Colonna HPLC chirale (Lux cellulosa-3), 250 x 4,6 mm, 5 &; M, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| Forniture per la chimica generale: un imbuto separatore da 2 L, becher e palloni di Erlenmeyer con capacità di 1000-2000 L, fiale da 20 mL, fiale HPLC, piccoli palloni a fondo tondo e ancorette. | |||
| HPLC (utilizziamo una pompa analitica Shimadzu Prominence LC-20AT e un rivelatore UV-vis SPD-20A | Spettrofotometro Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000... | Thermo-Fisher Scientific NMR | ||
| NMR: Spettrometro Agilent DD2 (500 MHz) | |||
| Evaporatore rotante | Buchi | ||
| Dismembratore sonico o omogeneizzatore ad ultrasuoni | Cole-Parmer |
Riferimenti
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circulation Research. 78, 415-423 (1996).
- Ulu, A., et al. An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).
- Ye, D., et al. Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).
- Imig, J. D. Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury. Hypertension. 65, 476-682 (2015).
- Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation. Scientific Reports. 6, 39211(2016).
- Zou, A. P., et al. Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity. American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).
- Lauterbach, B., et al. Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators. Hypertension. 39, 609-613 (2002).
- Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , National Center for Health Statistics. Hyattsville, MD. (2015).
- Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease. Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).
- Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters. Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).
- Ostermann, A. I., Schebb, N. H. Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids. Food & Function. 8, 2355-2367 (2017).
- Khan, M. A., Wood, P. L. Method for the synthesis of DHA. , WO2012126088A1 (2012).
- Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).
- Cinelli, M. A., et al. Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids. Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).
- Falck, J. R., et al. Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid). Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).
- Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium. Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).
- Capdevila, J. H., et al. The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3. Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).
- Lucas, D., et al. Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450. Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).
- Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase. Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).
- Cayman Chemical, 19,20-EpDPA. , https://www.caymanchem.com/product/10175 (2019).
- Graham-Lorence, S., et al. An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase. Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).
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Ristampe e permessi
