Registrazioni elettrofisiologiche di correnti ioniche a cella singola sotto stress di taglio ben definito

Sommario

L'obiettivo di questo protocollo è descrivere una camera di flusso a piastre parallela modificata da utilizzare per studiare l'attivazione in tempo reale dei canali ionici meccanosensibili da sollecitazioni di taglio.

Abstract

Lo stress da taglio fluido è ben noto per svolgere un ruolo importante nella funzione endoteliale. Nella maggior parte dei letti vascolari, lo stress da taglio elevato da aumenti acuti del flusso sanguigno innesca una cascata di segnalazione con conseguente vasodilazione alleviando così lo stress meccanico sulla parete vascolare. Il modello di stress da taglio è anche ben noto per essere un fattore critico nello sviluppo di aterosclerosi con stress di taglio lamiarese essendo ateroprotettivo e disturbato stress di taglio essere aterogenico. Mentre abbiamo una comprensione dettagliata dei vari percorsi di segnalazione delle cellule intermedie, i recettori che prima traducono lo stimolo meccanico in mediatori chimici non sono completamente compresi. I canali ionici meccanosensibili sono fondamentali per la risposta alla cesoia e regolano la segnalazione delle cellule indotta da taglio controllando così la produzione di mediatori vasoattivi. Questi canali sono tra i primi componenti di segnalazione attivati per taglio e sono stati collegati alla vasodialazione indotta da taglio attraverso la promozione della produzione di ossido nitrico (ad esempio, rettificando interiormente K^e il potenziale del recettore transitorio [TRP] canali) e iperpolarizzante dell'endotelio (ad esempio, Kir e canali K^ad attivazione di calcio [KCa]) e vasoconstriction indotta da taglio attraverso un meccanismo indeterminato che coinvolge canali piezo. Comprendere il meccanismo biofisico con cui questi canali vengono attivati dalle forze di taglio (cioè direttamente o attraverso un meccano-recettore primario) potrebbe fornire potenziali nuovi obiettivi per risolvere la fisiofisiologia associata alla disfunzione endoteliale e l'aterogenesi. È ancora una grande sfida registrare l'attivazione indotta dal flusso dei canali ionici in tempo reale utilizzando l'elettrofisiologia. I metodi standard per esporre le cellule a sollecitazioni di taglio ben definite, come il reometro a cono e piastra e la camera di flusso della piastra parallela chiusa non consentono lo studio in tempo reale dell'attivazione del canale ionico. L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere una camera di flusso a piastre parallele modificata che consente la registrazione elettrofisiologica in tempo reale dei canali ionici meccanosensibili sotto una sollecitazione di taglio ben definita.

Introduzione

Le forze emodinamiche generate dal flusso sanguigno sono ben note per svolgere ruoli importanti nella funzione endoteliale e vascolare^1,2. È anche noto che diversi tipi di canali ionici rispondono acutamente ai cambiamenti nello stress di taglio^3,4,5 portando all'ipotesi che i canali ionici possono essere sensori di stress da taglio primari. Più di recente, noi e altri abbiamo dimostrato che i canali ionici meccanosensitive svolgono ruoli critici in diverse funzioni vascolari sensibili allo stress di taglio, tra cui l....

Protocollo

L'uso di animali nei nostri studi è approvato dall'Università dell'Illinois al Chicago Animal Care Committee (#16-183).

1. Montaggio della camera a flusso di piastra parallela modificata

NOT: Fare riferimento alla tabella 1 e Figura 1 per gli ID della camera di flusso MPP. Si prega di fare riferimento alla Figura 1 per uno schema che descrive l'orientamento dei pezzi della camera per l'assemblaggio.

1. Per aderire al vetro di copertura rettangolare, pezzo D, sul fondo del pezzo C, fare prima la soluzione d....

Risultati

Più fotografie che mostrano diverse viste della camera di flusso MPP sullo stadio del microscopio (pannello superiore) e una rappresentazione schematica della camera di flusso MPP (pannello inferiore) sono mostrati nella Figura 1. Lo schema descrive in dettaglio le dimensioni dell'intero dispositivo e della camera di flusso. La figura 2 mostra una fotografia del sistema di perfusione gravitazionale alla camera di flusso MPP nel n.......

Discussione

Il sistema vascolare è costantemente esposto a forze emodinamiche attive, che attivano canali ionici meccanosensitive^3,22 ma i ruoli fisiologici di questi canali nella mechanotransduzione indotta da stress di taglio sono solo cominciando ad emergere^4,6,8. I meccanismi responsabili della meccanosensibilità dei canali attivati dallo stress di taglio rimangono sconosciuti. .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,2 µ m filtri per siringhe sterili	VWR	28145-501	Utilizzato per filtrare la soluzione di pipetta elettrofisiologica
Pinze di 5 gradi	Strumenti scientifici fini	1252-30	Utilizzato per il trasferimento di arterie digerite in una soluzione fresca
9" Pasteur Pipet	Fisher Scientifc	13-678-20D	Utilizzato per l'interruzione meccanica delle arterie digerite e il trasferimento di cellule endofleliali appena isolate
Diametro 12 mm Cerchi di vetro di copertura	Fisher Scientifc	12-545-80	Da utilizzare con studi che coinvolgono cellule in coltura e trattamenti multipli. Le celle aderenti al vetro di copertura vengono utilizzate per le analisi con patch clamp
24 mm x 40 mm Vetro di copertura rettangolare	Sigma-Aldrich CLS2975224		Vetro di copertura da aggiungere ai pezzi della camera di flusso MPP C (Figura 1)
24 mm x 50 mm Vetro di copertura rettangolare	Sigma-Aldrich	CLS2975245	Vetro di copertura da aggiungere alla camera di flusso MPP E (Figura 1)
Aghi per siringa da 20 G	Becton Dickinson and Co	305175	Per l'uso nella disgregazione meccanica delle arterie mesenteriche digerite
Piastra di Petri da 35 mm	Genesee Scientific	32-103	Per l'uso nella disgregazione meccanica delle arterie mesenteriche digerite
Amfotericina B solubilizzata	Sigma-Aldrich	A9528-50MG	Utilizzato per generare la configurazione del cerotto perforato a cellula intera.
Collagenasi, tipo I	Worthington Biochemical	100 mg - LS004194	Enzima utilizzato nel nostro laboratorio come breve digestione dopo il cocktail iniziale di proteasi neutra ed elastasi
Dimetil solfossido (DMSO)	Fisher Scientifc	67-68-5	Solvente per Amfotericina B utilizzato in patch clamp perforato a cellula intera
Elastasi, liofilizzato	Worthington Biochemical	25 mg - LS002290	Enzima utilizzato nel nostro laboratorio in un cocktail con proteasi/dispasi neutra per iniziare la digestione delle arterie per l'isolamento delle cellule endoteliali.
Piastra per coltura tissutale Falcon, 6 pozzetti, fondo piatto con coperchio a bassa evaporazione	Corning	353046	Per l'uso con studi che coinvolgono cellule in coltura e trattamenti multipli
Proteasi/dispasi neutra	Worthington Biochemical	10 mg- LS02100 50 mg - LS02104	Enzima utilizzato nel nostro laboratorio in un cocktail con elastasi per iniziare la digestione delle arterie per l'isolamento delle cellule endoteliali
SylGard	World Precision Instruments	SYLG184	Elastomero siliconico per far aderire il vetrino di copertura rettangolare ai pezzi C ed E della camera di flusso MPP (Figura 1)
Tubi Tygon ND 10-80	Tubi Microbore	AAQ04133	ID: 0,05 pollici, diametro esterno: 0,09 pollici, tubo di perfusione di ingresso per la somministrazione del flusso alla camera