Registrazioni elettrofisiologiche di correnti ioniche a cella singola sotto stress di taglio ben definito

Le forze emodinamiche generate dal flusso sanguigno sono ben note per svolgere ruoli importanti nella funzione endoteliale e vascolare^1,2. È anche noto che diversi tipi di canali ionici rispondono acutamente ai cambiamenti nello stress di taglio^3,4,5 portando all'ipotesi che i canali ionici possono essere sensori di stress da taglio primari. Più di recente, noi e altri abbiamo dimostrato che i canali ionici meccanosensitive svolgono ruoli critici in diverse funzioni vascolari sensibili allo stress di taglio, tra cui la risposta vasoattiva allo stress di taglio^6,7,8 e angiogenesi dello sviluppo⁹. I meccanismi della sensibilità di taglio-stress dei canali ionici, tuttavia, sono quasi totalmente sconosciuti. Questa lacuna di conoscenza è probabilmente dovuta alla difficoltà tecnica di eseguire registrazioni elettrofisiologiche sotto stress di taglio ben definito. In questo articolo, quindi, forniamo un protocollo dettagliato passo dopo passo regolarmente eseguito nel nostro laboratorio per raggiungere questo obiettivo^6,7,10,11.

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di consentire l'indagine in tempo reale della meccanoattivazione del canale ionico sotto stress di taglio ben definito nella gamma fisiologica. Ciò si ottiene modificando una camera di flusso a piastre parallela standard per consentire la calatta elettrofisiologica nella camera e l'accesso alle cellule coltivate sulla piastra inferiore durante l'esposizione in tempo reale al flusso, fornendo un approccio unico per raggiungere questo obiettivo Obiettivo^6,7,11. Al contrario, le camere standard a flusso di lamiere parallele, descritte nelle pubblicazioni precedenti, possono essere utilizzate per l'analisi dell'imaging in tempo reale delle cellule esposte alle forze di taglio¹² o altri approcci non invasivi^13,14 ma non per Elettrofisiologia. Allo stesso modo, l'apparato cono e piastra, un altro potente approccio per esporre le cellule allo stress di taglio^15,16 non è adatto per registrazioni elettrofisiologiche. Pertanto, questi dispositivi di flusso non consentono l'indagine della sensibilità allo stress da taglio dei canali ionici. La difficoltà nell'eseguire registrazioni elettrofisiologiche in flusso è la ragione principale per la scarsità di informazioni sui meccanismi responsabili di questi effetti cruciali.

In termini di approcci alternativi per raggiungere lo stesso obiettivo, non ce ne sono così accurati o controllati. Alcuni studi precedenti hanno tentato di registrare l'attività del canale ionico sotto flusso esponendo le cellule a un flusso di liquido proveniente da un'altra pipetta portata in prossimità di una cella da oltre^17,18. Questo è altamente non fisiologico, in quanto le forze meccaniche generate in queste condizioni hanno poco in comune con i profili fisiologici dello stress da taglio nei vasi sanguigni. Simili preoccupazioni si applicano ai tentativi di simulare lo stress fisiologico di taglio per perfusione di camere aperte. Come discusso in dettaglio nel nostro studio precedente¹⁰, un'interfaccia ad aria liquida aperta crea più disturbi e ricircolo, che sono non fisiologici. Per affrontare tutte queste preoccupazioni, abbiamo progettato una camera di flusso a piastre parallele modificata (MPP), chiamata anche "dispositivo di flusso minimamente invasivo" nei nostri studi precedenti^6,7,10,11, dall'acrilico e ampiamente utilizzato nel nostro laboratorio. Tuttavia, nonostante il fatto che la descrizione originale del progetto sia stata pubblicata quasi 20 anni fa ed è l'unico dispositivo di flusso che consente di eseguire registrazioni elettrofisiologiche sotto stress di taglio ben definito, questa metodologia non è stata adottato da altri laboratori e ci sono solo pochissimi studi che tentano di registrare le correnti in flusso. Crediamo, quindi, che fornire una descrizione dettagliata per l'utilizzo della camera di flusso MPP sarà di grande aiuto per le ricerche che sono interessate acanali ionici meccanosensibili e biologia vascolare.

L'uso di animali nei nostri studi è approvato dall'Università dell'Illinois al Chicago Animal Care Committee (#16-183).

1. Montaggio della camera a flusso di piastra parallela modificata

NOT: Fare riferimento alla tabella 1 e Figura 1 per gli ID della camera di flusso MPP. Si prega di fare riferimento alla Figura 1 per uno schema che descrive l'orientamento dei pezzi della camera per l'assemblaggio.

1. Per aderire al vetro di copertura rettangolare, pezzo D, sul fondo del pezzo C, fare prima la soluzione di elastomer in silicone mescolando accuratamente 500 l'agente di polimero in silicone elastomer osomero in 5 mL di base elastomer in silicone.
2. Applicare uno strato sottile della soluzione elastomer in silicone intorno ai bordi dello spazio rettangolare del pezzo C e posizionare delicatamente il pezzo rettangolare di vetro di copertura D direttamente sulla soluzione elastomer in modo tale che il pezzo D copre completamente lo spazio rettangolare aperto del pezzo C. Pulire con cura la soluzione di elastomeri in silicone in eccesso.
3. Ripetere il passaggio 1.2 per aderire al vetro di copertura rettangolare, pezzo F, sul fondo del pezzo E e consentire alla soluzione di elastomeri in silicone di curare durante la notte a temperatura ambiente.
   NOT: Una volta curato, il vetro di copertura rettangolare rimarrà aderito fino a sei mesi prima di dover essere sostituito.
4. A partire dal pezzo della camera inferiore, pezzo E, assemblare la camera di flusso MPP posizionando in sequenza ogni pezzo sopra il precedente nel seguente ordine: pezzo E (in basso), pezzo C, pezzo B, pezzo A (superiore).
5. Allineare i fori di vite di ogni pezzo agli angoli e avvitare saldamente i pezzi insieme per evitare che si verifichino perdite durante la somministrazione del flusso alla camera di flusso MPP.

2. Preparazione cellulare e semina nella camera di flusso MPP

NOT: Seguite i passaggi 2.1.2.7 per le cellule endoteliali coltivate. Seguite il metodo descritto nei passaggi 2.8.2.14 per isolare le cellule endoteliali dalla galleria arteriosa mesenteica del topo e la preparazione di cellule endoteliali appena isolate.

1. In una piastra a 6 pozzetti, mettere da quattro a cinque cerchi di vetro di copertura da 12 mm e cellule di semi tra il 10% e il 30% di confluenza in modo che sia possibile accedere a singole celle per le registrazioni elettrofisiologiche.
2. Incubare le cellule in condizioni di coltura standard (5% CO₂, 37 ) per non meno di 2 h per consentire alle cellule di aderire e non più di 24 h come cellule endoteliali nell'esperienza degli autori diventano molto piatte e difficili da correggere quando semina a sub-confluenza per più di 24 H.
3. Rimuovere un vetro di copertura contenente le cellule aderte da un pozzo della piastra a 6 pozzetti, risciacquare rapidamente in salina con tamponamento di fosfato (PBS) e trasferirlo in una teglia Petri da 35 mm contenente 2 mL di soluzione da bagno elettrofisiologico (tabella 2) prima del trasferimento al flusso MPP studio.
4. Trasferire il cerchio di vetro di copertura al vetro di copertura rettangolare, pezzo D, che viene aderito al pezzo C della camera di flusso MPP assicurandosi che una soluzione adeguata rimanga sul vetro di copertura in modo che le cellule non vengano esposte all'aria. Aggiungete la soluzione per il bagno desiderata (250 dollari l) alle celle in modo che il cerchio di vetro di copertura e le celle siano completamente sommersi in soluzione.
5. Posizionare il cerchio di vetro di copertura in modo che si appoggia nella metà più vicina al lato del serbatoio del vuoto in modo che le celle siano in linea con le aperture a vela del pezzo B. Assicurarsi che il cerchio di copertura in vetro aderisca al pezzo D attraverso l'adesione al vetro della soluzione in modo che l'applicazione flusso alla camera non interrompe la posizione del cerchio di vetro di copertura.
6. Assemblare la camera di flusso MPP avvitando i pezzi nell'ordine appropriato, come descritto nei passaggi 1.4 e 1.5 e come illustrato nella Figura 1. Trasferire la camera allo stadio del microscopio e perfondere immediatamente la camera con soluzione bagno in modo che la soluzione raggiunga il serbatoio sottovuoto per l'aspirazione (10 mL).
7. Identificare una cellula sana per l'esperimento identificando una cellula con un bordo scuro e un nucleo evidente. Evitare le celle che sembrano sbiancare o le celle che sono in contatto con altre celle.
   NOT: Nel laboratorio degli autori, vengono utilizzate cellule endoteliali aortiche umane e cellule endoteliali meusteriche primarie in coltura. Tuttavia, qualsiasi altro tipo di cellula aderente che è di interesse per esigenze di ricerca specifiche può essere utilizzato allo stesso modo.
8. Lavare il porticato dell'arteria isolata in soluzione di dissociazione (Tabella 2). Trasferire la sala giochi su un tubo di centrifugazione da 2 mL contenente 2 mL di soluzione di dissociazione preriscaldata (ricetta per la soluzione di dissociazione mostrata nella tabella 2) contenente proteasi neutra (0,5 mg/mL) ed elastasi (0,5 mg/mL). Incubare per 1 h a 37 gradi centigradi con agitazione delicata ogni 10 min.
9. Rimuovere 1 mL della soluzione di dissociazione proteasi/elastasi neutra e aggiungere 1 mg/mL di collagenae di tipo 1. Restituire la soluzione di collagenasi alla soluzione contenente le arterie per una concentrazione finale di tipo 1 di collagenee di 0,5 mg/mL. Incubare per 2/3 min a 37 gradi centigradi.
10. Utilizzando una pinze di grado 5, spostare rapidamente la sala giochi su una teglia Petri di 35 mm di diametro contenente una goccia di soluzione di dissociazione fresca e refrigerata di 750 gradi. Dissociare ulteriormente il tessuto utilizzando due aghi siringhe da 20 G per liberare meccanicamente le cellule endoteliali dalle arterie enzimaticamente digerite.
11. Utilizzando un tubo di vetro Pasteur usa e getta da 9", triturare la soluzione cellulare 10x prima di trasferire le cellule in un nuovo tubo di centrifuga di 1,5 ml utilizzando il tubo di vetro.
12. Lavare la piastra Petri con altri 750 gradi di soluzione di dissociazione e trasferirla nello stesso tubo. Utilizzando la pipetta di vetro, disperdere ulteriormente meccanicamente le cellule pipetting almeno 10x per creare una sospensione a singola cella facendo attenzione a non introdurre bolle che possono danneggiare l'integrità delle cellule endoteli.
13. Aggiungete 750 l della sospensione delle cellule endoteliali (500-1.000 celle) direttamente al pezzo D della camera di flusso MPP sulla metà più vicina al lato del vuoto del serbatoio. Lasciare che le cellule endoteliali aderiscano tra 45 min e 1 h a temperatura ambiente.
14. Assemblare la camera di flusso MPP avvitando i pezzi nell'ordine appropriato, come descritto nei passaggi 1.4 e 1.5 e come illustrato nella Figura 1. Trasferire la camera allo stadio del microscopio e perfondere immediatamente la camera con soluzione bagno in modo che la soluzione raggiunga l'aspirazione del vuoto (10 mL). Identificare le cellule endoteliali accessibili dal loro fenotipo ruvido e rotondo^19,20.
    NOT: Una varietà di metodi di digestione e cocktail enzimatici sono stati utilizzati per isolare le cellule endoteliali da diversi letti arteriosi. Vedere la tabella 3 per le descrizioni dettagliate dei protocolli che sono stati utilizzati da una varietà di ricercatori per isolare le cellule endoteliali per l'elettrofisiologia dei morsetti dei canali ionici meccanosensitive. Questi metodi sono probabilmente adatti per l'uso in combinazione con la camera di flusso MPP.

3. Controllo dello stress da taglio nella camera di flusso MPP per le registrazioni elettrofisiologiche dei canali Ion Ichanosensitive attivati dalla cesoia

1. Impostare un sistema di perfusione gravitazionale collegando un cilindro di siringa da 30 mL a un lucchetto a 3 vie dotato di tubi microbore (diametro interno: 0,05 pollici, diametro esterno: 0,09 pollici) adatto per l'inserimento nel foro di ingresso di 3 mm di diametro del pezzo A del MPP studio.
2. Attaccare il cilindro graduato alla faccia esterna della gabbia di Faraday che circonda il rig di elettrofisiologia (Figura 2) utilizzando nastro adesivo a due lati. Prima di inserire il tubo nella camera MPP, pre-riempire la siringa e i tubi con la soluzione del bagno (vedere la tabella 2 per la soluzione di bagno utilizzata per studiare la rettifica interiormente k^- canali nelle cellule endoteliali). Inserire il tubo nel foro di ingresso della camera di flusso MPP del pezzo A.
3. Pre-riempire la camera di flusso MPP con soluzione in modo tale che la soluzione viene rimossa nel serbatoio del vuoto. Interrompere il flusso verso la camera e riempire il cilindro graduato al marchio superiore. Calcolare manualmente le portate consentendo alla soluzione di fluire attraverso la camera e utilizzando un orologio di arresto per calcolare mL/s a una determinata altezza del cilindro di siringa.
4. Sollevare o abbassare la siringa per alterare il flusso, e quindi tagliare nella camera, e continuare questo processo fino a trovare un livello desiderato di stress di taglio.
5. Calcolare la sollecitazione di taglio in una camera parallela utilizzando la seguente equazione²¹:
   6/Q/h²w
   dove : viscosità del fluido (g/cm, Q, velocità di flusso (mL/s) e larghezza della camera a piastre parallele (w : 2,2 cm) e altezza (h - 0,1 cm).
   NOT: Nell'attuale sistema di perfusione gravitazionale, ad un'altezza del cilindro di siringa (misurata dalla parte superiore del cilindro) di 57 cm sopra lo stadio del microscopio, la portata è di 0,3 ml/s. La cesoia calcolata nella camera a questa altezza del cilindro di siringa e la portata è di 0,7 dyn/cm². Va anche notato che altri sistemi di perfusione, come una pompa peristaltica, possono essere utilizzati per controllare il flusso alla camera di flusso MPP. Tuttavia, questi dispositivi possono aggiungere turbolenza indesiderata e influenzare la stabilità delle misurazioni elettrofisiologiche in flusso, quindi, utilizzando il sistema di perfusione gravitazionale descritto qui è raccomandato.
6. Trasferire una camera assemblata contenente cellule aderenti allo stadio microscopio del rig di elettrofisiologia e inserire il tubo pre-riempito con soluzione vasca ripieno nel foro del pezzo A. Riempire contemporaneamente la camera e lavare le cellule con 10 mL di soluzione vasca da bagno girando la serratura a 3 vie in modo che la soluzione fluisca verso la camera.
7. Una volta ottenuta la configurazione di patch desiderata, consentire alle correnti del canale di stabilizzarsi in un bagno statico a temperatura ambiente. Una volta che le correnti si sono stabilizzate, applicare la cesoia in modo graduale permettendo agli aumenti di corrente di stabilizzarsi prima del successivo aumento dello stress da taglio.
   NOT: Gli autori trovano il maggior successo con la configurazione delle patch perforate durante lo studio dei canali ionici meccanoattivati nelle cellule endoteliali. Per eseguire configurazioni di patch intercellulari perforate, aggiungere 5 l of un'amphotericina di 60 mg/mL nel solfuro dimetilo (DMSO) a 1 mL di 0,2 m sterile soluzione di pipetta filtrata. Dopo aver generato un sigillo giga-ohm nella configurazione collegata alle cellule, le patch intere delle celle perforate si formano entro 2-5 min.
8. Rimuovere l'esposizione di taglio alle cellule fermando il flusso alla camera permettendo alle correnti di canale meccanosensitive di tornare alle correnti di base osservate nel bagno statico.
9. Isolare le correnti meccanosensibili del canale ionico di interesse alterando la valenza della soluzione (ad esempio, 60 mM K in soluzione di bagno con 0 Ca^{2 in} soluzione pipetta per studiare internamente la rettifica dei canali K. La tabella 2 mostra esempi di ricette di soluzioni) e/o l'inibizione farmacologica di fonti attuali potenzialmente contaminanti.

Più fotografie che mostrano diverse viste della camera di flusso MPP sullo stadio del microscopio (pannello superiore) e una rappresentazione schematica della camera di flusso MPP (pannello inferiore) sono mostrati nella Figura 1. Lo schema descrive in dettaglio le dimensioni dell'intero dispositivo e della camera di flusso. La figura 2 mostra una fotografia del sistema di perfusione gravitazionale alla camera di flusso MPP nel nostro laboratorio (pannello superiore). Viene inoltre illustrata una rappresentazione schematica del sistema di flusso (pannello inferiore) destinata a evidenziare i passaggi che isolano le cellule nella camera di flusso dalla corsa della soluzione dal sistema di perfusione e dalla forza della rimozione del vuoto della soluzione.

Un segno distintivo dei canali ionici meccanosensibili è un brusco ritorno ai livelli di base dopo la cessazione dello stimolo meccanico3,6,7. La figura 3 mostra come esempio che la rimozione dello stimolo da stress da taglio durante le registrazioni elettrofisiologiche di Kir current da una cellula endoteliale appena isolata produce un ritorno alle correnti di base inizialmente registrate in un bagno statico. Il ritorno ai livelli di corrente di base dopo l'arresto del flusso alla camera MPP si è verificato entro dieci secondi dalla cessazione del flusso.

Le registrazioni elettrofisiologiche a celle intere (WC), in particolare quelle prelevate da cellule appena isolate, hanno spesso evidenti correnti di fondo di perdita che possono mascherare l'attività del canale. Alcuni canali ionici, come quelli della famiglia di canali K, rettificando verso l'interno, hanno proprietà biofisiche che consentono di sottrarre la corrente di fondo della perdita per un'analisi più accurata. Figura 4 viene illustrato come esempio il processo dai dati non elaborati (Figura 4A) alla perdita lineare calcolata e tracciata (Figura 4B) alla finale, perdita sottratta traccia rappresentativa (Figura 4C). Vedere una spiegazione dettagliata per calcolare e sottrarre la perdita dalla registrazione della patch WC perforata non elaborata nella legenda di accompagnamento alla figura 4.

Figura 1: camera di flusso MPP e schema dettagliato. Le fotografie della camera di flusso MPP assemblata (pannello superiore) mostrano la camera sullo stadio del microscopio da tre diverse viste: il lato visto durante gli esperimenti (a sinistra), dall'ingresso perfusione (al centro) e dalla presa del vuoto (a destra) che è fuori dalla vista in la fotografia. La direzione del flusso è etichettata in ciascuna. Si noti che il filo di terra può facilmente adattarsi in una delle fessure da 2 mm quando piegato con un angolo di 90. Uno schema dettagliato (in basso) mostra le dimensioni esatte per la replica dell'apparato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Il sistema di perfusione gravitazionale. Una fotografia etichettata del sistema di perfusione gravitazionale nel nostro laboratorio è mostrata nel pannello superiore. La camera di flusso MPP in due fasi e il sistema di perfusione gravitazionale sono descritti in dettaglio nel pannello inferiore. Viene evidenziata la separazione della camera di flusso contenente le cellule e dei due serbatoi superiori e inferiori. Il passaggio 1 consente alla soluzione di fluire dal serbatoio superiore del pezzo B al pezzo D della camera in cui vengono semizzati le cellule. Passo 2 permette alla soluzione di fluire dal pezzo D fino al serbatoio inferiore, pezzo F. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: tracce rappresentative dell'attivazione corrente indotta dalla cesoia dei canali Kir e ritorno ai livelli attuali di base dopo la rimozione del flusso. Un buon controllo positivo per la meccanoattivazione dei canali ionici è il ritorno ai livelli correnti di base inizialmente osservati in un bagno statico dopo la cessazione dello stimolo meccanico. Le correnti del canale K (Kir) si attivano in modo interno dalla sollecitazione di taglio quando la soluzione di gravità può fluire nella camera di flusso MPP. Dopo la cessazione del flusso verso la camera, le correnti di Kir ritornano rapidamente ai livelli statici di base osservati prima del flusso. Una rampa da -140 mV a 40 mV è stata applicata alla patch oltre 400 ms. La soluzione bagno conteneva 60 mM Ke il potenziale di inversione era di 20 mV. Le tracce rappresentative sono state generate da una cellula endoteliale appena isolata dalle arterie mesentiche dei topi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Esempio di sottrazione delle perdite per un'analisi accurata della corrente di Kir con attivazione meccanica. (A) Rappresentante registrazione grezza della corrente di Kir da una cellula endoteliale primaria del topo con notevole corrente di perdita lineare verso l'esterno (ioperdo). Una rampa da -140 mV a 40 mV è stata applicata alla patch oltre 400 ms. La soluzione bagno conteneva 60 mM Ke il potenziale di inversione era di 20 mV. (B) Laperdita impedisce l'analisi dell'attività reale del canale Kir. Per sottrarre laperdita, calcolare prima la conduttanza di pendenza lineare di Ileak (Gpendenza : (Ia-Ib)/(Va-Vb)). Moltiplicare lapendenza G per le corrispondenti tensioni dell'intera traccia grezza per tracciarela perdita I sui dati grezzi. La linea dovrebbe sovrapporre esattamente la perdita lineare verso l'esterno. (C) Sottrarre laperdita tracciata dall'intera traccia in modo che la corrente lineare verso l'esterno sia di .0 pA/pF e la corrente reale di Kir possa essere analizzata. Si noti nel pannello C che la corrente di Kir verso l'interno è circa la metà di quella della traccia dei dati grezzi originali nel pannello A. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Dimensioni del MPP (assemblate e smontate) e informazioni aggiuntive specifiche per ogni parte del dispositivo.

Tabella 2: Esempi di soluzioni con ricette utilizzate negli esperimenti.

Tabella 3: Metodologia per studiare i canali ionici meccanosensibili utilizzando tecniche elettrofisiologiche.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.