Articolo metodologico

Misurare la guida dello sperma e la motilità all'interno del tratto riproduttivo ermafrodita di Caenorhabditis elegans

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DOI:

10.3791/59783

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6 giugno 2019

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1Department of Cell, Developmental and Integrative Biology, University of Alabama at Birmingham

In questo articolo

Sommario

Lo sperma deve navigare con successo attraverso l'ovidotto per fertilizzare un ovociti. Qui, descriviamo un saggio per misurare la migrazione dello sperma all'interno dell'utero ermafrodita C. elegans . Questo saggio può fornire dati quantitativi sulla distribuzione dello sperma all'interno dell'utero dopo l'accoppiamento, così come sulla velocità, la velocità direzionale e la frequenza di inversione.

Abstract

La fecondazione di successo è fondamentale per la riproduzione sessuale, ma si sa poco sui meccanismi che guidano lo sperma agli ovociti all'interno del tratto riproduttivo femminile. Mentre studi in vitro suggeriscono che lo sperma di animali fertilizzanti internamente può rispondere a vari spunti dal loro ambiente, l'incapacità di visualizzare il loro comportamento all'interno del tratto riproduttivo femminile crea una sfida per la comprensione della migrazione dello sperma e la mobilità nel suo ambiente nativo. Qui, descriviamo un metodo utilizzando C. elegans che supera questa limitazione e sfrutta la loro epidermide trasparente. C. elegans maschi macchiati con un colorante mitocondriale sono accoppiati con ermafroditi adulti, che agiscono come femmine modificate, e depositano lo sperma con etichetta fluorescente nell'utero ermafrodita. La migrazione e la motilità dello sperma etichettato possono quindi essere tracciate direttamente utilizzando un microscopio ad Epi-fluorescenza in un ermafrodite vivo. Negli animali di tipo selvaggio, circa 90% dello sperma etichettato strisciare attraverso l'utero e raggiungere il sito di fecondazione, o spermatheca. Le immagini dell'utero possono essere prese 1 h dopo l'accoppiamento per valutare la distribuzione dello sperma all'interno dell'utero e la percentuale di spermatozoi che hanno raggiunto lo spermatheca. In alternativa, le immagini time-lapse possono essere scattate immediatamente dopo l'accoppiamento per valutare la velocità dello sperma, la velocità direzionale e la frequenza di inversione. Questo metodo può essere combinato con altri strumenti genetici e molecolari disponibili per il C. elegans per identificare nuovi meccanismi genetici e molecolari che sono importanti nel regolare la guida dello sperma e la motilità all'interno del tratto riproduttivo femminile.

Introduzione

I meccanismi molecolari con cui gli spermatozoi (chiamati spermatozoi) navigano attraverso il tratto riproduttivo femminile verso l'ovocita non sono ben compresi, ma sono fondamentali per la riproduzione sessuale. La motilità dello sperma è altamente dinamica e dipende da solidi segnali di comunicazione che alterano la velocità dello sperma e la motilità direzionale1,2,3,4,5,6 , 7 il , 8 il , 9 il , 10 il , 11 il , 12. C. elegans è diventato un potente modello per lo studio del movimento dello sperma in vivo perché l'epidermide trasparente dell'ermafrodita permette il tracciamento degli spermatozoi vivi a singola cella di risoluzione2,3, 8,10. Lo scopo di questo documento è quello di fornire metodi per valutare il movimento dello sperma all'interno dell'utero ermafrodita C. elegans .

Nelle specie animali in cui gli spermatozoi e gli ovociti si incontrano nell'ambiente esterno (ad esempio, gli ambienti acquatici), lo sperma risponde ai segnali chemiotattici seccato dagli ovociti. Questi segnali guidano la direzione del movimento dello sperma, avvicinandoli alla sorgente del segnale4,6,11. Tuttavia, molto meno è noto circa il movimento dello sperma nelle specie che fertilizzano internamente. Una sfida importante è l'architettura del tratto riproduttivo femminile, che è inaccessibile alla microscopia nella maggior parte delle specie. Studi in vitro su esseri umani, topi e suini, ad esempio, forniscono la prova che le sottopopolazioni dello sperma possono rispondere a chemoattractants, flusso di fluido e gradienti termici1,5,7,9, 12. per la Con questi sistemi, l'incapacità di visualizzare e tracciare il movimento degli spermatozoi in vivo pone seri limiti alle strategie per scoprire i meccanismi chiave che regolano queste funzioni.

Per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato metodi che utilizzano il nematode C. elegans per visualizzare direttamente lo sperma dopo l'inseminazione, per misurare i singoli parametri di migrazione dello sperma in vivo e per misurare la capacità di una popolazione di spermatozoi di colpire sito di fecondazione. Questi metodi, insieme al set di strumenti molecolari e genetici C. elegans , facilitano la scoperta delle molecole di segnalazione chimica e delle macchine molecolari che regolano i comportamenti di motilità degli spermatozoi. Ad esempio, gli schermi genetici possono essere condotti in ermafroditi o maschi per identificare i geni che sono essenziali per un efficace movimento dello sperma in vivo13. Le molecole possono essere iniettate nella gonade ermafrodita per testare gli effetti sull'attivazione dello sperma, sulla velocità di migrazione e sulla motilità direzionale3. Inoltre, i metodi descritti possono essere utilizzati per monitorare la migrazione dello sperma canaglia in posizioni ectopiche del corpo e per valutare la concorrenza dello sperma10,14.

C. elegans esistono in natura come ermafroditi e maschi (vedere Figura 1). La gonade ermafrodita ha due braccia a forma di U che sono immagini speculari l'una dell'altra. Durante lo stadio larvale L4, le cellule germinali più prossimale (cioè le cellule vicine allo spermatheca) subiscono la spermatogenesi. Ogni spermatociti primario entra nella meiosi e produce quattro spermatidi aploidi. Questi spermatidi vengono spinti nello ricettacolo seminale insieme al primo ovociti maturo e subiscono spermiogenesi15. Ermafroditi adulti passare dalla spermatogenesi all'oogenesi. Gli ovociti maturano in una linea di assemblaggio alla moda lungo la gonade, con l'ovocita più maturo all'estremità prossimale della gonade, accanto alla spermatheca. I segnali msp dallo sperma sono necessari per innescare la maturazione meiotica e l'ovulazione16,17. Maschio C. elegans, invece, hanno una gonade a forma di J che producono solo sperma. I spermatidi sono conservati nella vescicola seminale. Dopo l'accoppiamento con l'ermafrodite o la femmina, il maschio inserisce le spicule vicino alla coda nella vulva. I spermatidi vengono attivati durante l'eiaculazione, quando entrano in contatto con il fluido seminale18. C. elegans sperma non nuotare come non sono flagellato. Invece, strisciano attraverso il tratto riproduttivo, utilizzando lo pseudopodo per la locomozione. È ben stabilito che lo sperma maschile, che sono di dimensioni maggiori, hanno un vantaggio competitivo rispetto al seme ermafrodita14.

In questo metodo, maschio C. elegans agiscono come donatore di sperma e sono accoppiati a hermaprhodites adulti. I maschi adulti sono macchiati con un colorante mitocondriale fluorescente per produrre sperma etichettato. Una volta depositato attraverso la vulva ermafrodita, lo sperma deve strisciare intorno agli embrioni nell'utero verso la spermatheca, o sito di fecondazione. L'epidermide trasparente del modello C. elegans consente la visualizzazione diretta di ogni singolo seme mentre naviga attraverso il tratto riproduttivo femminile. Negli ultimi anni, il nostro laboratorio ha utilizzato con successo questo metodo per dimostrare l'importanza di una classe di prostaglandine della serie F nella Guida dello sperma dalla vulva alla ricettacolo seminale19,20. Le meccaniche molecolari che governano la sua sintesi con l'ermafrodita e la risposta dello sperma sono ancora sotto inchiesta. Tuttavia, questo metodo per valutare la motilità e la migrazione degli spermatozoi facilita notevolmente l'identificazione degli attori chiave che controllano la comunicazione degli spermatozoi e degli ovociti negli animali che fertilizzano internamente. Il seguente protocollo descrive passo dopo passo come eseguire questo saggio.

Protocollo

Nota: tutte le fasi di questo protocollo vengono eseguite a temperatura ambiente (~ 20-22 ° c) o in incubatori a temperatura costante impostati a 16 ° c o 20 ° c. Maschio e ermafrodita C. elegans sono coltivati utilizzando condizioni cultura standard e NA22 o OP50 e. coli come fonte di cibo21,22. Gli ermafroditi di tipo Wild N2 e i maschi Fog-2 (Q71) sono utilizzati nella procedura riportata di seguito.

1. giorno 1: prelievo L4 stadio ermafroditi per l'accoppiamento

  1. Per ottenere risultati coerenti, tutti gli ermafroditi devono essere sincronizzati come riproducendo attivamente gli adulti. Raccogliere 20-30 stadi L4 ermafroditi a una piastra di media crescita nematode di 6 cm (NGM). Incubare gli ermafroditi a 20 ° c per 28-30 h.
    Nota: Solo 12-15 ermafroditi saranno utilizzati per l'accoppiamento. I restanti ermafroditi sono in eccedenza.

2. giorno 1: colorazione dei maschi con colorante mitocondriale fluorescente (mito-colorante)

  1. Fare una piastra di colorazione maschio posizionando un punto di E. coli (punto di cibo) al centro di una piastra NGM non sezzata. Per fare il punto del cibo, utilizzare l'estremità di un bicchiere di agitazione per rasare e. coli dal prato di batteri di una piastra seminata e depositarlo sulla piastra non seminata. Il punto dovrebbe essere ~ 5-7 mm di diametro.
  2. Mescolare insieme 2 μL di 1 mM di mito-colorante (vedere tabella dei materiali) in DMSO e 10 μl di tampone M9 (3 g diKH 2po4, 6 g di na2HPO4,5g di NaCl, 1 ml di 1 M MgSO4, H2O a 1 L. aggiungere MgSO4 dopo autoclavi). Pipettare tutta la soluzione di mito-colorante sul punto cibo sulla piastra di colorazione maschile. Lasciate asciugare la piastra al buio (~ 30 min).
    Nota: Mito-Dye è sensibile alla luce. Scudo tutta la soluzione, piastre, e vermi contenenti mito-colorante dalla luce. Conservare lo stock da 1 mM a-20 ° c.
  3. Pick ~ 100 1-3 giorno vecchio adulto maschi23 al mito-colorante macchiato cibo punto sulla piastra di colorazione maschio. Avvolgere la piastra in foglio di alluminio e incubare durante la notte a 16 ° c. Per l'accoppiamento, utilizzare ~ 50-60 maschi per 12-15 ermafroditi. Se sono necessari più di ~ 100 maschi, fare più piastre di colorazione per prevenire il sovraffollamento dei maschi.
    Nota: I maschi possono anche essere macchiati incubando in una soluzione mito-colorante da 10 μM in tampone M9 per 3 h su un vetro dell'orologio. Tenere i vermi coperti per prevenire l'evaporazione e l'esposizione alla luce. Dopo 3 h, utilizzare un Pipet Pasteur per trasferire i maschi su una piastra NGM seminato 10 cm. Trasferire come poco della soluzione di mito-colorante possibile. Avvolgere la piastra in foglio di alluminio e incubare durante la notte in 16 ° c.

3. giorno 2: accoppiamento

  1. Scegli i maschi colorati dal giorno 1 su una nuova piastra NGM seminata. Lasciare il piatto al buio fino all'accoppiamento. Questo passaggio assicura che i batteri colorati in eccesso di mito-colorante intorno ai maschi vengano rimossi. Il riporto di batteri colorati eccessivi di mito-tintura sulla piastra di accoppiamento può macchiare il tessuto ermafrodita.
  2. Fare una piastra di accoppiamento facendo cadere 2 μL di una miscela di E. coli spessa su una piastra NGM non sezzata. Lasciate asciugare i batteri spessi per fare il punto di accoppiamento. I maschi e gli ermafroditi saranno trasferiti su questo punto per l'accoppiamento. Per fare spessa e. coli, spin down 3 ml di notte e . coli e risospendere il pellet batterico in 1 ml di M9. Questa miscela può essere conservata a 4 ° c e riutilizzata per un massimo di 6 mesi.
    Nota: Lo spessore della soluzione di E. coli può essere regolato. Se la soluzione è troppo sottile, i maschi possono strisciare lontano dal punto di accoppiamento invece di aggregare su di esso per l'accoppiamento. I punti di accoppiamento costituiti da un Web E. coli troppo denso possono diminuire l'efficienza di accoppiamento.
  3. Mentre la piastra di accoppiamento di Step 3,2 è in essiccazione, mescolare insieme 300 μL di 1% (p/v) di tricaina (Tri), 300 μL di 0,1% (p/v) Tetramisole (Tet) e 900 μL di M9.
    Nota: Conservare 1% (p/v) tricaina e 0,1% (p/v) Tetramisole come aliquotes a-20 ° c. Evitare il scongelamento ripetuto.
  4. Trasferire 600 μL di soluzione Tet/Tri al vetro dell'orologio.
  5. Trasferimento 12-15 ermafroditi prelevati il giorno 1 alla soluzione Tet/Tri nel vetro dell'orologio. Incubare per 30 minuti per immobilizzare gli ermafroditi. Tenere il vetro dell'orologio coperto per evitare l'evaporazione della soluzione Tet/Tri.
    Nota: È importante che gli ermafroditi siano anestetizzati per almeno 30 minuti. meno tempo potrebbe causare un verme in movimento durante l'acquisizione di immagini, che può interefere con l'imaging.
  6. Mentre gli ermafroditi stanno incubando, scegli 50-60 maschi colorati da Step 3,1 sul punto di accoppiamento (passo 3,2). Conservare la lastra al buio fino al passo 3,8.
  7. Dopo l'incubazione di 30 minuti nella soluzione Tet/Tri, utilizzare un Pipet di vetro Pasteur per trasferire gli ermafroditi immobilizzati dal vetro dell'orologio su una piastra NGM non seminata. Rimuovere il più liquido possibile e lasciare asciugare il liquido in eccesso.
    Nota: Non lasciare asciugare eccessivamente gli ermafroditi. Non appena tutto il liquido visibile è evaporato, iniziare il passo successivo.
  8. Trasferire gli ermafroditi anestetizzati dalla placca NGM non seminata sul punto di accoppiamento con i maschi macchiati. Incubare al buio per 30 minuti per permettere ai maschi di accoppiarsi con gli ermafroditi.
  9. Dopo l'accoppiamento per 30 minuti, montare gli ermafroditi immediatamente per l'imaging time-lapse o trasferire gli ermafroditi su una nuova piastra NGM seminata per riposare per 1 h prima dell'imaging.
    Nota: I video time-lapse dell'utero ermafrodita sono utilizzati per quantificare la velocità dello sperma e la frequenza di inversione. Immagini fisse dell'utero presi 1 h dopo l'accoppiamento sono utilizzati per quantificare la distribuzione dello sperma, o guida spem.

4. giorno 2: vermi di montaggio per la visualizzazione

  1. Creazione di una piazzola di montaggio con 2% di agarosio in H2O
    Nota: 2% agarosio può essere fatto alla rinfusa, aliquotato in provette di vetro, e conservato a 4 ° c. Quando necessario, ogni aliquota può essere cotto al microonde prima di ogni uso e conservato in un blocco di calore per evitare che si solidifying.
    1. Per fare il pad di montaggio, allineare tre vetrini del microscopio di vetro fianco a fianco con i bordi lunghi toccando. Posizionare due pezzi di nastro adesivo uno sopra l'altro su entrambe le diapositive esterne. Questi vetrini di vetro esterni con nastro fungerà da supporto in modo che lo spessore del pad di agarosio risultante sarà "due nastro profondo".
    2. Posizionare ~ 75 μL di agarosio sciolto al 2% sul vetrino centrale (questa è la diapositiva senza nastro). Posizionare immediatamente un nuovo vetrino per microscopio in vetro sulla parte superiore dell'agarosio. Questo vetrino superiore dovrebbe essere perpendicolare alle altre diapositive, con ciascuna estremità appoggiata sul nastro delle due diapositive di supporto.
    3. Lasciate indurire l'agarosio (~ 30 s). Rimuovere con cautela il vetrino superiore facendolo scivolare fuori dal tampone di agarosio.
  2. Posizionare 10-15 μL di soluzione Tet/Tri sul tampone di agarosio al 2%. Trasferire il accoppiati ermafroditi sul pad. Fare attenzione a trasferire i batteri più piccoli possibile.
  3. Posizionare un coperchio scivolare sopra i vermi sul tampone di agarosio.

5. giorno 2: Impostazione acquisizione immagine

Nota: Qualsiasi miscroscopio verticale dotato di epi-fluorescenza, obiettivi 10x e 60x, e una fotocamera digitale può essere utilizzato per acquisire immagini per la distribuzione dello sperma. Sono necessari software in grado di acquisire immagini con scadenza temporale per valutare la velocità dello sperma, la velocità direzionale e la frequenza di inversione.

  1. Acquisizione immagini 1 h dopo l'accoppiamento
    1. Montare la slitta sullo stadio del microscopio. Guardate attraverso i pezzi degli occhi per scansionare i vermi sul tampone di agarosio utilizzando l'obiettivo 10x con il filtro di emissione di fluorescenza rosso (filtro TRITC). Una volta che un verme è stato trovato, accendere brevemente la luce di fluorescenza per vedere se il verme è accoppiato. Se lo sperma è visibile all'interno dell'utero, passare all'obiettivo 60x.
      Nota: La pressione creata dall'obiettivo 60x sul vetrino coprioggetti può danneggiare alcuni vermi fragili, causando l'estrusione dell'intestino o gonade dall'animale. La scansione per l'accoppiamento con successo utilizzando l'obiettivo 10x può minimizzare l'esposizione dei vermi alla pressione aggiuntiva. Non esporre i vermi accoppiati a lunghi periodi di luce fluorescente.
    2. Utilizzando la microscopia a contrasto di interferenza differenziale (dic), posizionare il verme in modo che sia la vulva e uno ricettacolo seminale sono in vista. Focalizzare l'immagine concentrandosi sul centro dello spermatheca. Controllare l'esposizione per i canali DIC e TRITC. In DIC, le strutture dei vermi interni devono essere chiaramente visibili. In TRITC, lo sperma individuale deve essere visibile come puntura distinta.
      Nota: Ogni immagine dovrebbe catturare l'utero dalla vulva a uno degli spermatheca. Se l'utero è troppo lungo per adattarsi a un'immagine, possono essere scattate due immagini distinte. Non è necessario che tutte le immagini siano scattate allo stesso livello di esposizione. Tuttavia, è importante che i singoli spermatozoi possano essere distinti e quantificati nelle immagini di fluorescenza.
    3. Acquisisci immagini DIC e fluorescenti per ogni utero.
    4. Ripetere i passaggi 5.1.1-5.1.3 fino a quando tutti gli ermafroditi accoppiati sono stati iminvecchiati.
  2. Catturare video time-lapse
    1. Scansionare il tampone di agarosio e localizzare gli ermafroditi che contengono lo sperma etichettato all'interno dell'utero, come descritto in STEP 5.1.1 e 5.1.2
    2. Configura il software per acquisire immagini time-lapse nei canali DIC e TRITC. Generalmente, le immagini time-lapse vengono scattate a intervalli di 15-30 s per 10-20 min per utero.

6. la quantificazione

  1. Quantificando la distribuzione dello sperma sulle immagini dell'utero scattate 1 h dopo l'accoppiamento
    1. Partendo con la vulva su un'estremità e la ricettacolo seminale dall'altro, dividere l'utero in terzi. Questi rappresenteranno le tre zone. La zona 1 (Z1) contiene la vulva e la zona 3 (Z3) contiene lo spermatheca.
    2. Conta manualmente il numero di spermatozoi all'interno di ogni terzo dell'utero e riporta il numero in ogni zona come percentuale dello sperma totale nell'intero utero. Di seguito viene fornito un esempio.
      Formula della concentrazione di spermatozoi, equazione del rapporto; Equazione per il calcolo della percentuale di spermatozoi in zone.
      Nota: a volte, l'intensità del segnale dell'immagine del canale TRITC deve essere regolata in modo che ogni seme che è stato catturato nell'immagine possa essere visibile e quantificato.
  2. Tracciamento dello sperma in immagini time-lapse
    Nota: In questo articolo, abbiamo utilizzato il software NIS-Elements per l'analisi. Nelle sezioni qui sotto, diamo istruzioni per il tracciamento manuale dello sperma utilizzando questo software (passo 6.2.1) così come il software open source ImageJ/Fiji (passo 6.2.2).
    1. Monitoraggio dello sperma con gli elementi NIS
      1. Aprire il file. ND2 con la serie time-lapse da tracciare. Per iniziare il tracciamento, aprire il pannello rilevamento facendo clic con il pulsante destro del mouse nel software e selezionando controlli di analisi | Il tracciamento.
      2. Nel riquadro di rilevamento selezionare Definisci nuovo ROI. Definire ogni regione di interesse (ROI) facendo clic su ogni seme che verrà tracciato. Un segno colorato apparirà sopra lo sperma selezionato. Fare clic su fine quando tutti i ROI sono stati selezionati.
      3. Una volta identificate le Roi, passare al fotogramma successivo nella serie time-lapse. Trascinare il marcatore ROI nella nuova posizione dello sperma nell'immagine. Continuare a fare questo fino a quando lo sperma non può più essere tracciato. Le linee punteggiate appariranno collegando ciascuna delle posizioni in cui il marcatore ROI è stato posizionato attraverso tutti i fotogrammi dell'immagine time-lapse.
        Nota: Solo gli spermatozoi nella zona 2 devono essere monitorati come spermatozoi nelle zone 1 e 3 tendono a muoversi in un modello circolare anche in animali di tipo selvaggio.
      4. Esporta tutti i dati quantificabili (ad esempio, lunghezza del percorso, tempo, posizione XY, ecc.) dallo sperma tracciato a un documento Excel facendo clic su Esporta nel pannello rilevamento.
    2. Monitoraggio dello sperma con Fiji
      1. Convertire le immagini del canale TRITC nella serie time-lapse in file. TIF. Salvare tutti i file da una serie in una cartella.
      2. Importare le immagini in Fiji utilizzando la funzione di importazione BioFormats. Importa immagini da una serie time-lapse come un hyperstack.
      3. Open TrackMate in Fiji24 via plugins | Tracciamento | Tracciamento manuale con TrackMate. Si aprirà una casella diaglogue.
      4. Selezionare lo strumento TrackMate nella barra degli strumenti Fiji. Fare doppio clic sullo sperma che verrà tracciato. Apparirà un cerchio verde con linee tratteggiate. Questo cerchio può essere riposizionato facendo clic all'interno del cerchio e trascinandolo nella posizione desiderata. La dimensione di questo cerchio può essere cambiata premendo contemporaneamente il tasto ALT e scorrendo il mouse.
      5. Una volta impostata la dimensione e la posizione del Tracker, fare nuovamente clic sul cerchio. Le linee verdi tratteggiate si trasformeranno in una linea verde solida. Premere contemporaneamente i tasti Shift e L per attivare la modalità di tracciamento. Questo sarà indicato nella barra degli strumenti Fiji.
      6. Passare al fotogramma successivo nella serie time-lapse. Per impostare la nuova posizione dello sperma tracciato nel nuovo fotogramma, passare il mouse sul nuovo punto e premere il tasto a . Il Tracker apparirà ora nella nuova posizione e apparirà una linea che connette le posizioni in cui il Tracker è stato posizionato nei fotogrammi precedenti.
      7. Una volta completate le tracce, fare clic su analizza nella finestra di dialogo TrackMate per generare i dati necessari.
    3. Per calcolare la velocità, dividere la lunghezza totale del percorso dello sperma per il tempo trascorso.
    4. Per calcolare la velocità vettoriale, tracciare una linea attraverso l'utero partendo dalla vulva rivolta verso la spermatheca. Misurare la distanza che lo sperma ha migrato lungo questa linea dall'inizio alla fine della traccia. Dividere questa distanza per il tempo trascorso. I valori negativi indicano che lo sperma è migrato lontano dalla spermatheca.
    5. Per registrare la frequenza di inversione, contare il numero di volte in cui la traccia dello sperma ha generato un angolo inferiore a 90 ° durante tre fotogrammi temporali consecutivi.

Risultati

Per generare i risultati raffigurati in questo documento, i maschi Fog-2 (Q71) sono stati colorati con il mito-colorante e accoppiati a Wild-Type, N2 hermaphrodites. Figura 2 fornisce uno schema generale per il metodo, tra cui la preparazione di worm, accoppiamento e analisi. Come Mostra il film 1 , il tratto riproduttivo ermafrodita per adulti ha due braccia che sono immagini speculari l'una dell'altra. Dopo l'accoppiamento, lo sperma etichettato viene depositato nell'utero ermafrodita attraverso la vulva. Lo sperma si muove intorno agli embrioni in via di sviluppo all'interno dell'utero verso la spermatheca, dove vengono immagazzinati fino alla fecondazione. Poiché le cellule germinali nell'ermafrodita adulta si sviluppano negli ovociti, l'ovocita prossimale e più maturo viene spinto nella ricettacolo seminale attraverso le contrazioni delle cellule della guaina. La fecondazione si verifica mentre l'ovocita è nella spermatheca.

Per quantificare la distribuzione dello sperma e la migrazione attraverso il tratto riproduttivo femminile, l'utero ermafrodita è diviso in tre zone (filmato 1, figura 3A). La zona 1 attraversa il primo terzo dell'utero, partendo dalla vulva. La zona 2 attraversa il terzo medio dell'utero e la zona 3 attraversa l'ultimo terzo dell'utero e include lo spermatheca. Una corretta guida dello sperma utilizzando Wild-Type, N2 ermafroditi e Fog-2 (Q71) maschi dovrebbe comportare circa 90% del seme etichettato che raggiunge la spermatheca, o zona 3 (Figura 3B).  Matings che si traducono in troppo pochi (Figura 3C, meno di 10-15 spermatozoi) o troppi (Figura 3D, utero riempito con sperma) sperma nell'utero non dovrebbe essere contato. In accoppiamenti che si traducono in meno di 10-15 sperma, 3-4 lo sperma canaglia può pesantemente inclinare i dati. Allo stesso modo, quando l'utero è riempito completamente con sperma, lo sperma non può migrare in modo appropriato. Lo sperma può sembrare sparsi in tutto l'uteri di alcuni mutanti che mostrano il fenotipo di guida dello sperma povero. Tuttavia, in questo caso, lo sperma non deve riempire ogni fessura dell'utero, come si vede nella Figura 3D. La quantificazione di ogni braccio della gonade è considerata un campione, o una n.

Le immagini time-lapse sono prese per quantificare la velocità dello sperma e la frequenza di inversione. Solo lo sperma nella zona 2 deve essere tracciato (Figura 4a) perché lo sperma nelle zone 1 e 3 (filmato 1) tende a muoversi in un modello circolare anche all'interno di animali selvatici. Le immagini di tempo-Laspe scattate a intervalli di 15-30 s sono di solito utilizzate per tracciare lo sperma. Sono quantificati solo gli spermatozoi che possono essere seguiti in fotogrammi consecutivi per più di 2,5-3 min. Nella Figura 4B-M, lo sperma segnato dai puntini rossi e blu soddisfano questo criterio, mentre lo sperma segnato dal punto verde non lo fa. Pertanto, i valori definiti nella Figura 4N sono quantificati per lo sperma segnato dai puntini rossi e blu (Figura 4o), mentre quelli per lo sperma segnato dal punto verde non sono stati quantificati.

Diagramma ermafrodita vs maschile dell'anatomia di C. elegans, compresa la linea germinale, la spermateca, la vescicola seminale.
Figura 1: cartone animato dell'adulto C. elegans ermafrodite e maschio. Le principali strutture riproduttive sono etichettate nella figura. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Diagramma di flusso: Protocollo di accoppiamento di C. elegans; colorante, uso di anestetici; Analisi dello sperma tramite microscopia a epifluorescenza.
Figura 2: diagramma schematico della preparazione del campione e acquisizione dei dati. I maschi macchiati con il mito-Dye sono accoppiati a ermafroditi adulti sincronizzati. Immagini Time-lapse di ermafroditi accoppiati vengono presi immediatamente dopo l'accoppiamento per catturare i dati per la velocità dello sperma e la frequenza di inversione. Immagini fisse di ermafroditi accoppiati sono presi 1 h dopo l'accoppiamento per valutare la distribuzione dello sperma all'interno dell'utero. Fare riferimento al testo per ulteriori dettagli. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Analisi della fecondazione embrionale, immagini e diagramma al microscopio, zone di intensità della fluorescenza Z1-Z3.
Figura 3: quantificazione della distribuzione di spermatozoi all'interno dell'utero ermafrodita. (A). Schema dell'utero ermafrodita C. elegans . V = vulva, E = embrione, S = spermatheca, O = oocyte, Z1-Z3 = zone 1-3 utilizzate per misurare la distribuzione dello sperma. (B-D). DIC + TRITC fuse (pannelli a sinistra) e TRITC solo (pannelli a destra) immagini di tipo selvaggio ermafrodite uteri 1 h dopo l'accoppiamento a Fog-2 (Q71) maschi macchiati con il mito-colorante. Lo sperma appare rosso. I contorni gialli indicano la posizione dello spermatheca. Barra di scala: 20 μm. Z1, Z2, Z3 la quantificazione in B rappresenta la percentuale di spermatozoi in ciascuna zona ± deviazione standard. Le immagini in c e D rappresentano i accoppiamenti che hanno provocato troppi (c) o troppi (d) spermatozoi per la quantificazione. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Microscopia della motilità degli spermatozoi: analisi time-lapse, velocità vettoriale, frequenza di inversione, calcoli.
Figura 4: quantificazione della velocità dello sperma e della frequenza di inversione durante la migrazione attraverso l'utero. (A). dic + TRITC immagine fusa di un utero ermafrodita contenente sperma fluorescente (rosso). V = vulva, giallo = spermatheca, Z1-Z3 = tre zone dell'utero, scatola nera: zona 2. (B-M). Immagini del canale TRITC time-lapse ingrandite nella zona 2 (scatola nera in a). Le immagini sono state acquisite a intervalli di 20 s. 3 spermatozoi individuali sono stati tracciati in ogni immagine (puntini rossi, verdi e blu). I puntini colorati nel pannello M rappresentano il percorso di ogni seme da B-L. Barra di scala = 20μm. (N). equazioni e definizioni per velocità dello sperma, velocità vettoriale e frequenza di inversione. (O). Speed, velocità vettoriale e frequenza di inversione dello sperma tracciata nei pannelli B-L dai puntini rossi e blu. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Processo riproduttivo dei nematodi, diagramma delle contrazioni della guaina, ovulazione; analisi microscopica.
Movie 1: filmato del movimento dello sperma e della migrazione. Un ermafrodite di tipo selvatico è stato accoppiato a nebbia-2 (Q71) maschi macchiati di mito-colorante. Il filmato è un composito di immagini time-lapse scattate a intervalli di tempo diversi. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricarlo).

Discussione

La capacità dello sperma di navigare il tratto riproduttivo femminile contorto e trovare ovociti è fondamentale per la riproduzione sessuale. Studi recenti che utilizzano spermatozoi di animali fertilizzanti internamente suggeriscono che rispondono attivamente a vari spunti ambientali, tra cui segnali chimici, flusso di fluido e gradienti di temperatura1,5,7, 9 il , 12. Tuttavia, queste osservazioni sono in gran parte risultate da esperimenti in vitro e si sa poco sul comportamento degli spermatozoi e sulla comunicazione all'interno del tratto riproduttivo. Uno dei principali ostacoli all'acquisizione di dati in vivo sulla migrazione degli spermatozoi e sulla motilità è la mancanza di visibilità all'interno della maggior parte dei tratti riproduttivi femminili. Il metodo che abbiamo descritto qui utilizzando C. elegans supera questa limitazione. Come dimostrano i risultati rappresentativi, l'epidermide trasparente consente la visualizzazione diretta e il tracciamento di ogni seme a risoluzione singola di una cellula in un organismo vivo e intatto.

C. elegans ha due sessi. I maschi, con un genotipo XO, producono solo sperma, e in questo metodo, sono utilizzati come donatori di sperma. L'ermafrodite, con un genotipo XX, sono femmine modificate. Le loro gonadi prima subiscono la spermatogenesi durante il quarto stadio larvale e passare all'oogenesi in età adulta25. Questo saggio utilizza ermafroditi adulti, i cui tessuti riproduttivi forniscono un modello per il tratto riproduttivo femminile. L'utilizzo di entrambi i sessi in questo saggio ci permette di identificare le vie genetiche e molecolari sia nel maschio che nella femmina che possono regolare la guida dello sperma e la motilità. In combinazione con l'intera serie di tecniche genetiche e molecolari disponibili per C. elegans, questo metodo può portare a nuove intuizioni sulla migrazione degli spermatozoi e la motilità, nonché la comunicazione di spermatozoi e ovociti.

Alcuni passaggi critici in questo protocollo giustificano ulteriori considerazioni, oltre ai dettagli forniti nella sezione protocollo.

Vermi
i maschi mutanti fendinebbia 2 (Q71), him-5 (E1490)o him-8 (E1489) possono essere utilizzati al posto dei maschi N2. Queste mutazioni aumentano la frequenza dei maschi nelle colture, ma non influenzano l'accoppiamento maschile o le funzioni dello sperma13. Le femmine, come le femmine di nebbia-2 (Q71) , possono essere utilizzate al posto degli ermafroditi. Tuttavia, le femmine devono essere pre-accoppiate con i maschi per consentire lo sviluppo corretto degli ovociti. La presenza di embrioni fertilizzati da questo pre-accoppiamento assicura anche che l'utero è abbastanza a lungo per valutare correttamente la distribuzione dello sperma. Se vengono valutati i mutanti o gli ermafroditi sperimentali, includere un gruppo di controllo. Ad esempio, gli ermafroditi mutanti devono essere accoppiati con gli ermafroditi di tipo selvaggio N2 come controllo per altre variabili nel saggio. Anche gli ermafroditi che sono stati alimentati con batteri contenenti plasmidi per i saggi di interferenza dell'RNA devono essere alimentati con batteri contenenti un controllo vettoriale vuoto. La distanza dalla vulva, dove gli spermatozoi sono inseminati, alla spermatheca, il sito di fecondazione, può variare a seconda del numero di uova nell'utero (cioè, l'utero si espande con l'aumento del numero di uova). Se si fanno confronti tra i genotipi, selezionare ermafroditi i cui uteri contengono un numero simile di uova. Non selezionare ermafroditi contenenti embrioni da cova o larve in movimento. È possibile eseguire un corso temporale per identificare l'età ottimale in cui devono essere analizzati gli ermafroditi.

Prelievo di ermafroditi e maschi
È importante che gli ermafroditi prelevati per questo saggio non siano da piastre sovracoltivate o di fame. I segnali di cibo e feromone modulano l'espressione di DAF-7, un homolog TGFß. Il percorso DAF-7 è stato dimostrato regolare la sintesi delle prostaglandine serie F che svolgono ruoli importanti nel guidare lo sperma per lo ricettacolo seminale20. La raccolta di ermafroditi da piastre sovraffollate o affamate può comportare una scarsa guida dello sperma non correlata al bersaglio di interesse. La densità delle piastre non sembrano influenzare lo sperma maschile. Tuttavia, i maschi che sono troppo giovani o troppo vecchi possono comportare una riduzione dell'efficienza di accoppiamento (cioè, la percentuale di ermafroditi sulla piastra di accoppiamento che hanno abbastanza spermatozoi nel loro uteri per quantificare). 1-3 i maschi adulti di giorno sono ottimali per questo saggio23.

Anestetizzanti ermafroditi
Nelle nostre mani, la combinazione Tetramisole e tricaina assicura che i vermi siano immobilizzati e rimangano vivi durante l'accoppiamento e l'acquisizione di immagini. Possono essere utilizzati anche altri anestetici, come l'azoturo di sodio. Tuttavia, l'azoturo di sodio è altamente tossico e le condizioni devono essere standardizzate. Le tecniche di immobilizzazione che utilizzano microsfere, agarosio e camere di microfluidica non sono raccomandate in quanto interferiscono con l'accoppiamento.

Colorazione maschile
Il mito-colorante utilizzato in questo manoscritto, MitoTrackerCMXRos, è stato ampiamente usato per etichettare lo sperma, così come altri mitocondri, in C. elegans. Lo sperma etichettato con questo mito-colorante è completamente funzionale, mantenendo la sua capacità di essere attivato, migrare, fertilizzare ovociti, e produrre progenie vitali26,27. Altri coloranti mitocondriali, come rhodamine 6G e DiOC6 sono stati utilizzati per macchia C. elegans mitocondri28,29. Tuttavia, le condizioni per questi coloranti devono essere standardizzate per l'etichettatura dello sperma in questo saggio. Oltre ai meccanismi di etichettatura mitochrondriale, le macchie di DNA, come Syto17, possono essere utilizzate anche per etichettare lo sperma per i saggi di migrazione30. Mentre queste tecniche di etichettatura sono relativamente facili e veloci da eseguire, le strategie transgeniche possono anche essere impiegate per generare sperma che esprimono etichette fluorescenti sotto promotori specifici di spermatozoi31,32.

accoppiamento
I punti di accoppiamento troppo spessi possono diminuire l'efficienza di accoppiamento. Si deve prestare attenzione a trasferire i batteri più piccoli possibile quando si trasferiscono maschi e ermafroditi anestetizzati sul punto di accoppiamento.

Creazione di pastiglie di agarosio e posizionamento dello slip di copertura
Le bolle d'aria possono essere generate nelle pastiglie di agarosio. Essi possono rifrattare la luce durante l'acquisizione di immagini o, se abbastanza grande, causare i vermi a cadere, rendendo impossibile acquisire l'immagine (s). Analogamente, le bolle d'aria possono essere create lungo gli ermafroditi quando il coperchio scivola sopra di loro sul tampone di agarosio. Queste bolle rifrattano la luce e portano alla diminuzione della qualità dell'immagine. La pratica contribuirà a diminuire il verificarsi di bolle d'aria.

Quantificazione
Quando si quantificano la distribuzione dello sperma, diversi piani z attraverso l'utero di un verme possono avere lievi differenze nella distribuzione degli spermatozoi. Troviamo che l'assunzione di una singola immagine focalizzata sulla ricettacolo seminale ci dà risultati riproducibili che sono simili ai risultati ottenuti dalla media di più sezioni z. Si consiglia di concentrare l'immagine sul centro dello spermatheca, ma i piani focali possono essere alterati leggermente in base alle esigenze dello sperimentatore. È tuttavia fondamentale che tutte le immagini siano scattate nello stesso modo. Inoltre, è importante che solo gli spermatozoi che sono a fuoco siano conteggiati. È la discrezione del contatore nel determinare i criteri per lo sperma in-focus. Tuttavia, è fondamentale che i criteri siano applicati sistematicamente a ogni verme quantificato. Per il tracciamento degli spermatozoi, molti software offrono funzionalità di tracciamento automatiche. Tuttavia, troviamo che il tracciamento manuale supera l'algoritmo di tracciamento automatico del software per due motivi principali: 1) l'abbondanza di nuclei di dimensioni simili all'interno dello spazio confinato rende difficile per il software distinguere tra sperma individuale e creare ROIs definite per ogni seme. 2) come sperma andare dentro e fuori messa a fuoco, le loro intensità si spostano, rendendo difficile per il software per tenere traccia dello sperma per lunghi periodi di tempo.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Ringraziamo sinceramente il nostro defunto mentore, Dr. Michael Miller, per la sua ispirazione e altruismo tutoraggio e la creazione di questo metodo come strumento per comprendere meglio lo sperma e la comunicazione degli ovociti. La sua improvvisa scomparsa è stata una perdita enorme per la sua famiglia, il suo laboratorio e la comunità scientifica. Questo studio è stato sostenuto dalla NIH (R01GM085105 a MAM e F30HD094446 a MH). Il contenuto è esclusivamente responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dei National Institutes of Health.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagenti e materiale
60 mm x 15 mm Piastra di PetriFisherFB0875713A
AgarFisherBP1423-500
Cloruro di sodioFisherS671-3
PeptoneFisherBP1420-500
ColesteroloSigma-AldrichC8667
Brodo LB, MillerFisher1426-2
Escherichia coli ceppo NA22Caenorhabditis Genetics Center (CGC)NA22Sia questo che OP50 E. coli possono essere utilizzati per C. elegans il mantenimento e il saggio. Entrambi possono essere acquistati presso il CGC
N2CGCN2
fog-2(q71)CGCCB4108
Filo di platino 0,25 mm di diametroAlfa Aesar10288
5 3/4" Pipetta Pasteur usa e gettaFisher13-678-20A
Vetro dell'orologioFisher02-612A
5 mm Dia.Fisher50-121-5269
MitoTracker CMXRos (Mito-dye)FisherM7512Scudo dalla luce, conservare a -20 ° C
Fosfato monopostassioFisherP285-500
Fosfato disodicoFisherS374-1
Solfato di magnesioFisherM63-500
Dimetil solfossidoFisherBP231-1DMSO
Foglio di alluminioFisher01-213-102
Etile 3-amminobenzoato metansulfonatoSigmaE10521-10GTricaine è il nome comune. Conservare in aliquote a -20 °C.
Tetramisolo cloridratoSigmaL9756-5GConservare in aliquote a -20 ° C
AgarosioFisherBP1356-100
Vetrini coprioggettiFisher12-548-A18 x 18-1
Vetrini per microscopio smerigliatiFisher12-552-3
NomeAziendaNumero di catalogoComments
Equipaggiamento
16 gradi C e 20 gradi Incubatrici CFisher97-990EStesso modello, impostato a temperature diverse.
Microscopio verticale con illuminatore a epifluorescenza, fotocamera e obiettivi 10x e 60xSoftware Nikon
con capacità di acquisizione e tracciamento delle immaginiNikonStereomicroscopio AR
NikonSMZ800NQualsiasi stereomicroscopio che può essere utilizzato per visualizzare C. elegans può essere utilizzato con questo protocollo
con elementi NIS

Riferimenti

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