Valutazione della prensione qualificata nei topi utilizzando un auto-allenatore

Sommario

Metodo per valutare l'impatto della formazione sulle capacità motorie è uno strumento utile. Sfortunatamente, la maggior parte delle valutazioni comportamentali può essere laboriosa e/o costosa. Descriviamo qui un metodo robotico per valutare la prensione (reach-to-grasp) abilità nei topi.

Abstract

Descriviamo un metodo per introdurre topi ingenui a un nuovo compito di prensione (reach-to-grasp). I topi sono alloggiati in gabbie con una fessura frontale che permette al mouse di uscire dalla sua gabbia e recuperare pellet di cibo. La restrizione alimentare minima viene utilizzata per incoraggiare i topi a eseguire il recupero del cibo dalla fessura. Quando i topi iniziano ad associarsi arrivando alla fessura per il cibo, i pellet vengono tirati via manualmente per stimolare l'estensione e la pronazione della zampa per afferrare e recuperare il pellet attraverso lo slot frontale. Quando i topi iniziano a raggiungere i pellet quando arrivano allo slot, il saggio comportamentale può essere eseguito misurando la velocità con cui riescono a cogliere e recuperare il pellet desiderato. Vengono poi introdotti in un auto-addestratore che automatizza sia il processo di fornitura di pellet alimentari per il mouse da afferrare, sia la registrazione di tentativi di raggiungere e afferrare riusciti e non riusciti. Ciò consente la raccolta di dati di raggiungimento per più topi con il minimo sforzo, da utilizzare nell'analisi sperimentale a seconda dei casi.

Introduzione

I metodi per testare sperimentalmente un'abilità motoria lesioni pre e post-neurologiche, nonché modulare la tempistica, la quantità e il tipo di allenamento motorio sono importanti per la ricerca traslazionale. Nell'ultimo decennio, i topi, a causa della conseguente facilità di manipolazione genetica, sono diventati un sistema modello popolare in cui chiarire i meccanismi dell'apprendimento motorio pre e post-lesione. Tuttavia, i saggi comportamentali nei topi non sono stati ottimizzati nello stesso modo in cui tali saggi sono stati per altri mammiferi (soprattutto ratti). Inoltre, ci sono importanti differenze tra il comportamento di un topo e un ratto che suggeriscono fortemente l'addestramento delle due specie in modi diversi^1,2.

Abili movimenti prensile utilizzano una mano / zampa per posizionare il cibo in bocca, per manipolare un oggetto, o per utilizzare uno strumento. Infatti, raggiungere a cogliere vari oggetti nella vita quotidiana è una funzione fondamentale degli arti superiori e l'atto reach-to-eat è una forma di prensione che molti mammiferi usano. Molti dei cambiamenti genetici, fisiologici e anatomici alla base dell'acquisizione delle abilità prensili sono stati ben definiti nel campo³. Nel tradurre i risultati preclinici in esiti clinici, è necessario un test pertinente che sia efficiente e riproducibile. Studi sui roditori e sulla portata umana dimostrano che il comportamento della prensione è simile negli esseri umani e negli animali⁴. Di conseguenza, queste somiglianze suggeriscono che i test di prehension possono servire come modello traslazionale per studiare l'apprendimento motorio, nonché i menomazioni e i trattamenti della malattia umana. Pertanto, la valutazione della prehension nei topi può offrire un potente strumento nella ricerca traslazionale che studia sia la salute che la malattia^{afferma 4}.

Purtroppo, il compito di prehension nei topi, anche per un ambiente di laboratorio su piccola scala, può essere laborioso e dispendioso in termini di tempo. Per risolvere questo problema, descriviamo qui una versione automatizzata dell'attività di prehension. Il compito descritto richiede ai topi di estendere una singola zampa attraverso la fessura frontale della gabbia di casa del topo, far promettere la zampa estesa, afferrare la ricompensa del pellet alimentare e tirare il pellet all'interno della gabbia per il consumo. I dati risultanti vengono presentati come un successo di prehension o un fallimento. Questa automazione registra con successo i dati e riduce l'onere e il tempo con cui i ricercatori devono impegnarsi il compito.

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'ACUC (Animal Care and Use Committee) della Johns Hopkins University.

1. Preparazione delle gabbie per topi per l'uso

1. Creare un'apertura scanalata con dimensioni di 0,8 cm di larghezza e 7 cm di altezza dalla base all'estremità anteriore di ogni gabbia, come illustrato nella Figura 1. Questa fessura serve come l'apertura attraverso la quale l'animale raggiungerà.
   NOTA: l'auto-formatore è stato progettato per l'uso con le dimensioni standard della gabbia del mouse (come mostrato nella Figura 1) fornite dalla maggior parte dei fornitori di forniture di ricerca animale. Inoltre, l'auto-trainer sosterrà facilmente altri tipi di gabbie.
2. All'interno di ogni singola gabbia, aggiungere una piattaforma adiacente allo slot per consentire ai topi di stare in piedi e raggiungere i pellet presentati. Assicurarsi che la piattaforma si trovi sopra il pavimento della lettiera della gabbia, circa 3 cm di altezza. Utilizzare piatti Petri apposti con supercolla e concappucciato da una lamiera di circa 10 cm x 15 cm, tuttavia, qualsiasi superficie piana abbastanza grande per un mouse in piedi per raggiungere da sarà sufficiente.
3. Creare una tacca verticale attraverso il centro della parte anteriore della gabbia misura 0,8 cm di diametro e 7 cm di altezza che permetterà al mouse di raggiungere la zampa fuori dalla gabbia.
4. Da un sottile foglio di metallo, (spesso circa 2 mm) tagliare un cancello gabbia in rettangoli di misura 5 cm x 10 cm per servire come un'apertura uniforme attraverso la quale l'animale deve raggiungere.
   NOTA: I topi possono masticare gabbie di plastica che cambierebbero le dimensioni dell'apertura. Il mouse raggiungerà questo slot di 0,8 cm quando il cancello della gabbia metallica viene posizionato sopra l'apertura scanalata della gabbia durante i test con nastro, mantenendo la larghezza effettiva dello slot tra le gabbie.
5. Coprire lo slot di ogni gabbia con del nastro adesivo quando il suo mouse non è in fase di test per evitare che la lettiera venga espulsa dalla gabbia.

2. Introdurre i topi al movimento di raggiungimento

1. Registrare il peso iniziale di ogni mouse e calcolare l'85% di quel valore per trovare il peso obiettivo, arrotondando fino a 20 g se il risultato è inferiore. Dare loro un regime di alimentazione per portarli a e poi mantenere questo peso obiettivo.
   1. Dare a ogni topo 2,5 g di pellet il primo giorno e notare qualsiasi cambiamento nel loro peso 24 h più tardi.
      NOTA: Pesare i topi una volta al giorno e aspettarsi un calo di peso di 0,25-1 g al giorno.
   2. Modificare l'alimentazione giornaliera di ogni mouse come richiesto, in base a questa modifica iniziale e cambiamenti in corso nel peso di ogni mouse, al fine di indurre una perdita di peso graduale (meno di 0,8 g persi al giorno) e quindi mantenere il peso obiettivo risultante. Variare da tre a sei 500 pellet mg (1,5 a 3,0 g) al giorno per essere efficace.
      NOTA: I topi rimangono su questa dieta per mantenere il loro peso obiettivo per tutto il protocollo.
2. Quando un topo ha raggiunto il suo peso obiettivo, introdurre ogni mouse al concetto di venire fino alla fessura gated per un pellet alimentare supplementare. Avviare una sessione di allenamento posizionando un pellet da 45 mg sulla superficie del pellet, direttamente davanti allo slot, e consentire a ogni mouse di recuperarlo. La maggior parte dei topi prenderà a questa disposizione di alimentazione entro 1-2 giorni.
3. Una volta che il mouse associa uno slot aperto con l'essere nutriti, incoraggiali a raggiungere con una zampa, piuttosto che con la bocca.
   NOTA: Questo è il passo più complesso, prendendo 1-2 giorni, e instillare comportamento controproducente nei topi per errore è molto facile; si prega di fare riferimento alla sezione di discussione per ulteriori informazioni e consigli.
   1. Utilizzando una coppia di pinzette, tenere un pellet nella stessa posizione in cui il mouse ha recuperato pellet in precedenza. Mentre il mouse inizia a mordere per il pellet, tirarlo via circa mezzo centimetro in modo che il pellet sia fuori dalla portata della sua bocca.
      NOTA: Un mouse al suo peso obiettivo tenterà di recuperare il pellet fuori portata. Ogni volta che il mouse estende una zampa attraverso lo slot, rinforza quel comportamento permettendogli di mangiare il pellet. Alcuni topi possono presentare una preferenza per una zampa rispetto all'altra quando si estendono per il cibo.
   2. Anche se non strumentale alla sperimentazione, registrare se la zampa sinistra o destra è preferito. Questo può potenzialmente consentire più alti tassi di successo complessivi nel saggio comportamentale; in alternativa, eliminare una variabile forzando ogni mouse a raggiungere con la stessa zampa.
      NOTA: Si ottengono risultati migliori se i topi utilizzano la zampa preferita.
   3. Mentre ogni topo associa l'estensione di una zampa con il mangiare un pellet, rafforza ulteriormente quel comportamento trattenendo il pellet in risposta ai tentativi di recuperare il pellet con la bocca e la lingua. I topi inizieranno a rispettare questa disposizione per oltre 2 o 3 giorni.
   4. Finalizzare l'introduzione del comportamento di raggiungimento della zampa desiderata posizionando il pellet da 45 mg poco meno di 1 cm dal bordo esterno del cancello della gabbia, in modo che il punto più a sinistra o a destra del pellet (sia a destra che a sinistra della fessura della gabbia dello sperimentatore 's prospettiva, rispettivamente) è tangente a una linea che si estende direttamente dal bordo dello slot del cancello gabbia. Consentire al mouse di tentare di recuperare il pellet, essendo vigile per rimuovere il pellet e impedirne il consumo se il mouse deve tentare con un altro metodo diverso dall'estensione della zampa.
      NOTA: Quando un mouse estende costantemente una zampa per afferrare ed è in grado di toccare il pellet fornito, è pronto per il test utilizzando l'auto-trainer descritto di seguito e il test comportamentale associato. Il tempo che intersede inuneoso fino alla preparazione varia tra i topi; se ci sono sbandati che richiedono più di due settimane per capire, dovrebbero essere esclusi dal set di dati.

3. Utilizzando l'auto-trainer

NOTA: Vedere la figura 1-3 e la sezione di discussione per una descrizione completa dell'hardware, del software e delle azioni fisiche del formatore automatico.

1. Preparati per la sessione di allenamento.
   1. Calibrare il sensore di pellet esca. Fare clic sulla freccia Esegui nell'interfaccia LabVIEW e notare il sensore di pellet esca che legge sia con che senza pellet. Fare clic sul pulsante Interrompi per interrompere l'esecuzione del test e modificare la destinazione del sensore bait pellet su un valore tra queste due letture (Figura 3 e Tabella 2). La maggior parte delle condizioni di illuminazione fornisce una lettura compresa tra 1 e 4.
   2. Posizionare la gabbia del mouse modificata sull'auto-addestratore (Figura 2). Apporre il cancello della gabbia ( Figura 1) e allineare il pellet al bordo dello slot come nella procedura manuale.
2. Eseguire la sessione di formazione del mouse utilizzando l'interfaccia LabVIEW.
   1. Immettere le informazioni necessarie per registrare i dati relativi alla sessione di formazione (Figura 3 e Tabella 2).
      1. Fare clic sul campo ID mouse e digitare il nome di file di ogni sessione di allenamento utilizzando la tastiera del computer.
      2. Fare clic sul campo Pellet totali da erogare durante la routine per controllare il numero di pellet erogati per un singolo esperimento (in genere 20 - 30). A tale scopo, fare clic sulle frecce su e giù o immettere il numero utilizzando la tastiera del computer.
      3. Fare clic sul campo Pausa dopo il numero di Pellet per impostare una pausa di 5 s dopo che il pellet indicato è stato rimosso dal diving board. A tale scopo, fare clic sulle frecce su e giù o immettere il numero utilizzando la tastiera del computer.
      4. Fare clic sul campo Lunghezza pausa per impostare una pausa tra il momento in cui un pellet viene rimosso dal diving board e il momento in cui viene erogato un nuovo pellet. A tale scopo, fare clic sulle frecce su e giù o immettere il numero utilizzando la tastiera del computer
         NOTA: In genere 1 s è un tempo di pausa appropriato. Se i topi sono ansiosi dopo che ogni pellet è erogato, si consiglia di aumentare la lunghezza della pausa utilizzando il campo Lunghezza pausa a 5 s.
      5. Registrare manualmente la distanza alla quale il pellet viene posizionato nel campo Distanza di raggiungimento. A tale scopo, fare clic sulle frecce su e giù o immettere il numero utilizzando la tastiera del computer
         NOTA: la dimensione degli array di accelerazione e tempo viene esposta a scopo di debug e può essere ignorata.
      6. Fare clic sul campo Cartella da contenere registri per selezionare il percorso del file in cui salvare i dati raccolti.
      7. Una volta compilati i campi delle informazioni, fare clic sul pulsante Esegui per avviare la sessione di formazione. L'auto-allenatore eroga singoli pellet e traccia se cadono attraverso l'imbuto fino a quando il numero totale di pellet è stato erogato, e l'ultimo pellet è stato recuperato o caduto dal mouse. Il programma si fermerà automaticamente a questo punto. Se necessario, può anche essere fermato prematuramente facendo clic sul pulsante Stop.
   2. Una volta che il software è impostato, posizionare la gabbia di casa del mouse da testare sul piedistallo e osservare il mouse in modo da poter valutare se il mouse ha effettivamente imparato a tentare il nuovo comportamento di raggiungimento richiesto nuovo raggiungimento. Dopo aver fatto clic sul pulsante Esegui, consentire al mouse di esaminare lo slot e il nuovo ambiente sconosciuto.
      NOTA: Simile all'introduzione di topi al concetto di raggiungere, si aspettano che alcuni topi siano più conformi di altri. I topi che hanno afferrato il concetto dovrebbero cercare di raggiungere entro 5-10 min e associeranno il movimento dell'auto-allenatore con il pellet presentato, come quando associano una fessura scoperta con il cibo nelle fasi iniziali di questo protocollo.

Risultati

In generale, si consiglia di che ogni sessione di formazione consista in circa 20-30 prove, che possono essere impostate dall'utente, eseguite automaticamente dal formatore automatico e salvate in un unico file di registro per sessione e mouse. Ogni prova può essere eseguita consecutivamente, subito dopo l'altra, con 2-5 s di pausa. I topi formati sull'auto-formatore mostrano un aumento delle abilità in 10 sessioni di allenamento.

Discussione

Il nostro auto-trainer valuta la comprensione degli arti anteriori (prensioni) in modo automatizzato. Per raggiungere questo endpoint, molti dei parametri progettati per l'attività di prensione del mouse, tra cui il posizionamento del pellet, le dimensioni del pellet e i criteri di allenamento, sono stati iterati nel corso di diversi anni e adattati dai protocolli precedenti^{2,5 ,6}. Il progresso qui è l'automazione del compito u...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Filamento ABS	stampato in 3D personalizzato	N/A	utilizzato per portapellet, telaio, braccio e imbuto
Foglio ABS	McMaster-Carr	8586K581	spessore 3/8"; utilizzato per componenti di piattaforma, guide per stand di posizionamento e base
Adruino Mini	Adruino	A000087	versione nano compatibile anche così come altri microcontrollori simili
Supporto di posizionamento	McMaster-Carr	9967T43	35 libbre di capacità di carico
Tubo rotondo in acrilico trasparente	McMaster-Carr	8532K14	ID 3/8"
Low-Carbon  Filo d'acciaio	McMaster-Carr	8855K14	0.148"  diametro
Dispenser di pellet	Lafayette Strumento: Neuroscience	80209-45	con ruota intercambiabile da 45 mg e supporto opzionale
Photointerrupter Breakout Board	SparkFun	BOB-09322 ROHS	progettato per Sharp GP1A57HRJ00F
Sensore di oggetti riflettenti	Fairchild Semiconductor	QRD1113	uscita
fototransistor Servomotore	SparkFun	S8213	generico ingranaggio in metallo (dimensioni micro)
Fotointerruttore trasmissivo	Distanza tra GP1A57HRJ00F nitide		: 10 mm, fessura: 1,8 mm