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Articolo metodologico

Caratterizzare i mutanti correlati alla malattia di RAF Family Kinases utilizzando una serie di metodi pratici e fattibili

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DOI:

10.3791/59795

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17 luglio 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Laboratory of Cancer Signaling, Division of Cellular and Molecular Research, National Cancer Centre Singapore, 2The Cancer and Stem Cell Program, Duke-NUS Medical School

In questo articolo

Sommario

In questo articolo, abbiamo presentato una serie di metodi pratici e fattibili per caratterizzare i mutanti correlati alla malattia delle chinasi della famiglia RAF, che includono il saggio in vitro chinasi, il saggio di co-attivazione della RAF e il saggio di luciferasi diviso complementare.

Abstract

Le chinasi della famiglia fibrosarcoma (RAF) rapidamente accelerato svolgono un ruolo centrale nella biologia cellulare e la loro disfunzione porta a tumori e disturbi dello sviluppo. Una caratterizzazione dei mutanti RAF correlati alla malattia ci aiuterà a selezionare strategie terapeutiche appropriate per il trattamento di queste malattie. Recenti studi hanno dimostrato che le retisi familiari della RAF hanno attività sia catalitiche che allosteric, che sono strettamente regolate dalla dimerizzazione. Qui, abbiamo costruito una serie di metodi pratici e fattibili per determinare le attività catalitiche e allosteric e la relativa affinità/stabilità di dimero delle chinasi della famiglia RAF e dei loro mutanti. In primo luogo, abbiamo modificato il classico saggio in vitro della chinasi riducendo la concentrazione di detergenti nei tamponi, utilizzando una delicata procedura di lavaggio rapido e impiegando una fusione di glutathione S-transferase (GST) per evitare che i dimeri della RAF si dissocino durante Purificazione. Questo ci permette di misurare l'attività catalitica dei mutanti RAF, in modo virile mente attivo. In secondo luogo, abbiamo sviluppato un nuovo saggio di co-attivazione della RAF per valutare l'attività allostricale dei mutanti NAsie-morti della RAF utilizzando proteine RAF troncate N-terminal, eliminando il requisito di Ras attivo nei protocolli attuali e ottenendo così un livello superiore sensibilità. Infine, abbiamo generato un unico test di lucidferasi diviso complementare per misurare quantitativamente l'affinità/stabilità relativa dei dimeri di vari mutanti RAF, che è più affidabile e sensibile rispetto al tradizionale test di co-immunoprecipitazioni. In sintesi, questi metodi presentano i seguenti vantaggi: (1) user-friendly; (2) in grado di effettuare efficacemente senza attrezzature avanzate; (3) conveniente; (4) altamente sensibili e riproducibili.

Introduzione

Le chinasi della famiglia RAF sono un componente chiave della cascata di segnalazione RAS/RAF/MEK/ERK, che trasmette un segnale da RAS per attivare la proteina mitogen -linse (MEK)1,2,3. Questa famiglia di chinasi svolge un ruolo cruciale nella crescita cellulare, sopravvivenza e differenziazione, e le loro alterazioni inducono molte malattie, in particolare il cancro5,6,7,8. Recentemente, i sequenziature genomiche hanno identificato molti mutanti DELLA RAF correlati alla malattia che presentano diverse proprietà nella trasmissione del segnale della cascata RAS/RAF/MEK/ERK9,10,11. Un'attenta caratterizzazione dei mutanti RAF ci aiuterà a capire i meccanismi molecolari di come i mutanti RAF alterano la produzione di segnale della cascata RAS/RAF/MEK/ERK, eventualmente selezionare approcci appropriati per il trattamento di varie malattie basate sui mutanti RAF.

Le chinasi della famiglia RAF comprendono tre membri, CRAF, BRAF e ARAF, che hanno strutture molecolari simili ma abilità diverse per attivare la segnalazione a valle1,2,3,4. Tra questi paraloghi, BRAF ha la più alta attività in virtù del suo coscione costitutivo NtA (N-terminal acidic) motivo12,13,14, mentre ARAF ha il più basso attività derivanti dal suo motivo APE non canonico15. Questo può spiegare le diverse frequenze di mutazione dei paralati RAF nelle malattie: BRAF>CRAF>ARAF. Inoltre, all'interno dello stesso paralogo RAF, le mutazioni in diversi siti possono innescare la segnalazione a valle in modi distinti, il che aggiunge un ulteriore livello di complessità alla regolazione delle chinasi della famiglia RAF. Recenti studi hanno dimostrato che tutte le chinasi RAF hanno attività catalitiche e allosteric13,14,16,17,18. I mutanti RAF constitutivemente attivi attivano la segnalazione a valle direttamente facendo fosfolare MEK, mentre i mutanti RAF che sono morti di parentesi possono trasattivare le loro controparti di tipo selvaggio attraverso la dimerizzazione laterale e attivare la segnalazione MEK-ERK16 ,19,20. L'affinità/stabilità dei dimeri è un parametro chiave che non solo determina l'attività allostricarica dei mutanti RAF cilasi-morti, ma influisce anche sull'attività catalitica dei mutanti RAF complessivamente attivi15,21, 22.I mutanti nasie-morti della RAF ad alta affinità/stabilità dei dimeri possono trasattivare direttamente i RAGF endogeni di tipo selvaggio15, mentre quelli con affinità/stabilità dilettante intermedia richiedono un coordinamento di elevato livello di molecole RAF di tipo selvatico per funzionare13,15,20,21,23. Allo stesso modo, i mutanti della RAF proattivi con stitusivi fosfo MEK in modo dipendente dai dimer, e quelli con bassa affinità/stabilità dei dimeri perdono la loro attività catalitica in vitro dopo l'immunoprecipitazioni che rompe i deboli dimeri della RAF15, 21,22. L'affinità/stabilità dei dimeri determina anche la sensibilità dei mutanti RAF ai loro inibitori, e correla positivamente alla resistenza degli inibitori della RAF24. Pertanto, per caratterizzare i mutanti DELLA RAF correlati alla malattia, è necessario misurare le loro attività catalitiche e allosteric e l'affinità/stabilità delle dimeri.

Negli ultimi anni, il nostro laboratorio e altri hanno sviluppato vari metodi per caratterizzare le chinasi della famiglia RAF e i loro mutanti. Secondo il nostro laboratorio e l'esperienza di altri, riteniamo che i seguenti tre saggi abbiano vantaggi nella definizione dei mutanti della RAF correlati alla malattia: (1) il saggio in vicolo cinsetro che può essere effettuato con facilità per rilevare l'attività catalitica di mutanti RAF attivi15; (2) il saggio di co-attivazione della RAF che è un metodo affidabile e conveniente per misurare l'attività allostricale dei mutanti della RAF ciansioni13,15,21,22,23, 25, (3) il saggio di lucidferasi diviso gratuito che ha una sensibilità molto più elevata nel misurare l'affinità/stabilità relativa dei dimeri dei mutanti RAF in contrasto con il tradizionale analisi di co-immunoprecipitazioni, ed è in grado di svolgere senza attrezzature avanzate in contrasto ai metodi analitici quantitativi come SPR (Surface Plasmon Resonance) analisi15,22. Combinando questi tre saggi, possiamo capire facilmente come un mutante DELLA RAF legato alla malattia alteri la segnalazione a valle e quindi utilizzare una strategia terapeutica appropriata per trattare la malattia causata da questa mutazione della RAF.

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Protocollo

1. In Vitro Kinase Saggio per misurare l'attività catalitica dei mutanti RAF

  1. Costruire vettori codificano i mutanti RAF (Figura1A) con il tag FLAG(DYKDDDDK) al capointroduzione utilizzando Gibson Assembly o i metodi tradizionali di clonazione molecolare.
    1. Introdurre il tag FLAG e le mutazioni nelle sequenze di codifica RAF dei PCR, quindi inserire intere sequenze nel vettore pCDNA3.1() utilizzando l'assemblaggio Gibson o la legatura del DNA T4 e seguendo i protocolli del manichino. Utilizzare le seguenti condizioni per le reazioni PCR: (1) 95 gradi centigradi, 2 min; (2) 95 gradi centigradi, 30 s; (3) 59 gradi centigradi, 30 s; (4) 68 gradi centigradi, 3 min; (5) 20 cicli di (da 2 a 4); (6) Blocco di 4 gradi centigradi.
      NOT: Primer PCR per la clonazione: 5- AAATTAATACGACTCACTATAGGATAGGC-3 e 5-CAGCGGGTTTAACGGGCCCCTCTA-3.
    2. Inserire la sequenza di codifica GST a monte delle sequenze di codifica mutanti RAF per generare vettori che codificano mutanti RAF fusi mediante gli stessi metodi descritti nel passaggio 1.1.1.
    3. Convalidare tutti i vettori mediante sequenziamento del DNA prima della trasfezione.
  2. Piastra 293T cellule in piastre 6-well ad una densità di 5 x 105 cellule / beh un giorno prima della trasfezione. Quando la densità cellulare raggiunge l'80-90% di confluenza il secondo giorno, il transfett con vettori che codificano le chinasi RAF con tag FLAG o i loro mutanti dal passo 1.1 nelle cellule seguendo il protocollo di produzione dei reagenti di trasfezione (Tabella dei materiali).
  3. Sostituire il mezzo di coltura 24 h dopo la trasfezione.
  4. Aspirare il mezzo di coltura 48 h dopo la trasfezione e aggiungere 400 HCl, 150 mM NaCl, 1 mM di acido etilenediaminetraceacetica (EDTA), 0,25% NP-40, pH 7,2) integrato con inibitori di proteasi e fosfasi per la lisciviazione delle cellule sul ghiaccio.
    NOT: La concentrazione di NP-40 nel buffer di lisi è fondamentale per rilevare l'attività catalitica dei mutanti RAF con moderata affinità/stabilità di dimero in vitro. Un'alta concentrazione di detersivo o un forte detergente nel tampone di lisi può rompere i dimeri della RAF e quindi uccidere l'attività catalitica delle chinasi RAF o dei loro mutanti.
  5. Trasferire le linguette delle cellule in un tubo da 1,5 mL e girare verso il basso di 12.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi per esaurire i detriti cellulari.
  6. Trasferire 300 ll per campione di listi a cellule intere pulite a tubi da 1,5 mL, aggiungere 20 llà per campione di perline di affinità anti-FLAG e ruotare in una stanza fredda (4 gradi centigradi) per 1 h. Prendete anche 40 LL per campione di lisato a cellule intere pulito da parte per rilevare l'espressione e l'attività (fosforo-ERK1/2) dei mutanti RAF mediante immunoblot, come descritto di seguito.
  7. Lavare le perline anti-FLAG una volta con il tampone di lisi, poi una volta con buffer di reazione alla chinasi (20 m HEPES, 10 mM MgCl2, 0,5 mM Na3VO4, 0,5 mM DTT, pH 7.2), e aggiungere 20 l di miscela di reazione alla china (2 g di MEK1 (K97A) e 100 ATP in 20 buffer delle azioni) per campione.
    NOT: Il lavaggio del tallone deve essere completato delicatamente e rapidamente, il tampone residuo deve essere aspirato completamente prima di aggiungere la miscela di reazione alla chinasi e tutte le operazioni in questa fase devono essere eseguite a 4 gradi centigradi in una stanza fredda.
  8. Incubare le reazioni della chinasi a temperatura ambiente (25 gradi centigradi) per 10 minuti e capovolgere i tubi contenenti reazioni chinasi con le dita ogni due minuti durante l'incubazione.
  9. Aggiungere 5 luna di buffer campione SDS 5x (375 mM Tris HCl, 9% solfato di sodio al sodio (SDS), 50% Glycerol, 0.03% Bromophenol Blue) per campione per fermare le reazioni alla chinasi, e poi riscaldare i campioni a 90 gradi centigradi per 5 min.
  10. Eseguire i campioni nell'elettroforesi gel poliacrilamide (PAGE) del 9-12%, con 0,1% di SDS, trasferire le proteine nella membrana di nitrocellulosa e rilevare i livelli di mutanti fosforo-MEK e RAF in campioni di immunoblot.
    NOT: Il fosforo-MEK può anche essere quantificato utilizzando l'incorporazione di P-ATP alnumero 32. In breve, al buffer di reazione alla chinasi viene aggiunto 10 M -32P-ATP e la quantità di meK fosforillato viene quindi quantificata dopo la separazione PAGE utilizzando l'autoradiografia standard, il fosforoimaging o le tecniche di conteggio della scintillazione liquida come appropriato.

2. Analisi di co-attivazione della RAF per valutare l'attività allostricale dei mutanti della RAF Kinase-morto

  1. Costruire vettori che codificano il ricevitore RAF (dominio della chinasi CRAF con motivo NtA unphosphosphosllatable, AAFF) o gli attivatori della rafasi-morto (dominio della chinasi RAF con motivo NtA, SSDD, DDEE o DGEE) (Figura 1A) come descritto nel passaggio 1.1.
  2. Transfect 293T cellule con due vettori che codificano sia il ricevitore RAF e l'attivatore RAF kinasi-morto o un singolo vettore codifica una delle proteine come descritto nei passaggi 1.2 e 1.3.
  3. Sostituire il mezzo di coltura a 24 h dopo la trasfezione e raccogliere 293T transfectants a 48 h per preparare l'intera cellula lisati come descritto nei passaggi 1.4 e 1.5.
  4. Mescolare rapidamente il lisa di intere cellule pulite con 5x buffer di campione SDS a temperatura ambiente (25 gradi centigradi) e poi far bollire a 90 gradi centigradi per 5 min.
  5. Eseguire i campioni di lisato a cellule intere bollite in 9-12% PAGE con 0,1% SDS, trasferire le proteine nella membrana di nitrocellulosa e rilevare i livelli di fosforo-ERK1/2 e controllare le proteine mediante immunoblot.

3. Test di lucidale diviso complementare per misurare l'affinità/stabilità di dimero relativo dei mutanti RAF

  1. Costruire vettori codificano mutanti RAF marcati FLAG fusi al N-terminus di Nluc (N-terminus di firefly luciferase, aa2-416) o al Capolino C di Cluc (C-terminus di luciferasi lucciola, aa398-550) come descritto nel passaggio 1.1.
  2. Cellule transfetate 293T con una coppia di vettori che codificano diversi mutanti Nluc-RAF e mutanti Cluc-RAF come descritto al passaggio 1.2.
  3. A 24 h dopo la trasfezione, riplaccare 293T transfectants cellulari in lastre di immagine nera Krystal alla densità cellulare di 2x105 per bene con mezzo privo di colore (cioè DMEM senza fenolo rosso).
  4. 24 h più tardi, aggiungere D-lucidferina (0,2 mg/mL) a 293T transfectanti cellulari, incubare per 30 min, e misurare i segnali luciferasi utilizzando un sistema multi rilevamento (Tabella dei materiali).
  5. Dopo aver misurato i segnali di luciferasi, aspirare il mezzo e lisci 293T transfectanti con tampone di lisi per preparare l'intera cellula lisati come descritto nei passaggi 1.4 e 1.5.
  6. Eseguire i campioni di lisato di tutta la cellula in 9-12% PAGE con 0.1% SDS e rilevare i livelli di espressione dei mutanti Nluc-RAF e Cluc-RAF da immunoblot anti-FLAG come descritto nel passo 2.5. I livelli di espressione relativi del mutante Nluc-RAF e del mutante Cluc-RAF nei transfetti 293T sono quantificati utilizzando l'immagine J dai loro immunoblot.
  7. Normalizza i segnali luciferasi di transfectanti a cellule 293T secondo i livelli di espressione dei mutanti Nluc-RAF e dei mutanti Cluc-RAF. In breve, questo si ottiene dividendo il segnale di luciferasi grezzo per i livelli di espressione relativi dei mutanti Nluc-RAF e dei mutanti Cluc-RAF dal passo 3.6.

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Risultati

Le retine della famiglia RAF hanno attività sia catalitiche che allosteric, che consentono ai loro mutanti correlati alla malattia di attivare la segnalazione a valle attraverso diversi meccanismi13,14,16,17 ,18. I mutanti della RAF, attivi direttamente, trapolano i loro substrati, mentre i mutanti RAF morti di chinasi compiono la loro funzione trasattivando ...

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Discussione

In questo articolo, abbiamo presentato tre metodi per caratterizzare i mutanti RAF correlati alla malattia, che includono il saggio in vitro della chinasi, il saggio di co-attivazione della RAF e il saggio di luciferasi diviso gratuito. Dal momento che le chinasi RAF hanno sia attività catalitica che attività allosteric, vari mutanti RAF possono attivare la segnalazione a valle attraverso due meccanismi distinti13,14,16,

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Gli autori vorrebbero riconoscere la Hairy Cell Leukemia Fellowship per il supporto di Yuan Jimin. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Asia Fund Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge Funding Award (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF bridging grant (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), sovvenzione pilota NCCRF (NCCRF-YR2017-JUL-PG3) e SHF Academic Medicine Borsa di ricerca (AM/TP011/2018).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
anti-fosfoERK1/2Tecnologie di segnalazione cellulare4370
anti-fosphoMEK1/2Tecnologie di segnalazione cellulare9154
anti-ERK1/2AB clonaleA0229
anti-MEK1/2Tecnologie di segnalazione cellulare9124
anti-FLAG (mouse)Sigma-AldrichF3165
anti-HANovus BiologicalsMAB6875
anti-FLAG(Coniglio)Tecnologie di segnalazione cellulare14793
anti-β-actinaSigma-AldrichA2228
anti-FLAG beads(M2)Sigma-AldrichA4596
HRP-coniugato anti-topo IgGJackson Laboratories115-035-003
HRP-coniugato anti-Coniglio IgGJackson Laboratories111-035-144
pcDNA3.1 (+)In vitrogenV79020
Gibson Assembly Cloning  KitNew England BiolabsE5510
T4 DNA ligasiNew England BiolabsM0202
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
Fugene 6Roche11 814 443 001
DMEM senza rosso fenoloInvitrogen21063-029
D-luciferina GoldBioLUCK-100
6xhis-taged MEK1 (K97A)  preparati nei nostri precedenti studiN.A.Riferimento 15.
Sistema di rilevamento GloMax-Multi.PromegaE7041

Riferimenti

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