Il metodo di localizzazione dell'immunofluorescenza in vivo (IVIL) può essere utilizzato per esaminare la biodistribuzione in vivo di anticorpi e jujuganti anticorpi per scopi oncologici negli organismi viventi utilizzando una combinazione di targeting per tumori in vivo ed immunostaining ex vivo Metodi.
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Articolo metodologico
Localizzazione dell'immunofluorescenza in vivo per la valutazione della biodistribuzione terapeutica e diagnostica degli anticorpi nella ricerca sul cancro
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli anticorpi monoclonali (mAbs) sono strumenti importanti per il rilevamento, la diagnosi e il trattamento del cancro. Essi sono utilizzati per svelare il ruolo delle proteine nella tumorigenesi, possono essere diretti a biomarcatori tumorali che consentono il rilevamento e la caratterizzazione del tumore, e possono essere utilizzati per la terapia del cancro come mAbs o coniugati anticorpale-farmaco per attivare le cellule eftuali immunitarie, per inibire le cellule eftori immunitarie, per inibire le cellule eftuali immunitarie, per inibire le cellule efiloriche immunitarie, per inibire le cellule echeologiche immunitarie, per inibire le cellule ebrasive immunitarie vie di segnalazione, o uccidere direttamente le cellule che trasportano l'antigene specifico. Nonostante i progressi clinici nello sviluppo e nella produzione di nuovi e altamente specifici mAb, le applicazioni diagnostiche e terapeutiche possono essere compromesse dalla complessità e dall'eterogeneità del microambiente tumorale. Pertanto, per lo sviluppo di terapie e diagnostica efficienti basate su anticorpi, è fondamentale valutare la biodistribuzione e l'interazione del coniugato basato sugli anticorpi con il microambiente tumorale vivente. Qui, descriviamo in Vivo immunofluorescenza localizzazione (IVIL) come un nuovo approccio per studiare le interazioni di terapie e diagnostica basate su anticorpi nelle condizioni fisiologiche e patologiche in vivo. In questa tecnica, un anticorpo terapeutico o diagnostico specifico dell'antigene viene iniettato per via endovenosa in vivo e localizzato ex vivo con un anticorpo secondario in tumori isolati. IVIL, quindi, riflette la biodistribuzione in vivo di farmaci anticorpi e agenti di targeting. Due applicazioni IVIL sono descritte valutando la biodistribuzione e l'accessibilità degli agenti di contrasto basati su anticorpi per l'imaging molecolare del cancro al seno. Questo protocollo permetterà agli utenti futuri di adattare il metodo IVIL per le proprie applicazioni di ricerca basate su anticorpi.
Introduzione
Gli anticorpi monoclonali (mAb) sono grandi legocoproteine (circa 150 kDa) della superfamiglia immunoglobulina che sono secreti dalle cellule B e hanno una funzione primaria nel sistema immunitario per identificare e inibire la funzione biologica di, o segnare per distruzione, patogeni batterici o virali, e può riconoscere l'espressione anomala delle proteine sulle cellule tumorali1. Gli anticorpi possono avere un'affinità estremamente elevata con i loro epitopi specifici fino alle concentrazioni di femtomolare, rendendoli strumenti molto promettenti in biomedicina2. Con lo sviluppo della tecnologia dell'ibrido da parte ....
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Protocollo
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Institutional Administrative Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) della Stanford University.
1. Modello murino transgenico dello sviluppo del cancro al seno
- Osservare i topi dal modello di cancro desiderato per la crescita tumorale appropriata tramite la palpazione o la misurazione della pinza prima di procedere.
NOTA: Qui è stato utilizzato il modello murino transgenico dello sviluppo del cancro al seno (FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT). Questi animali sviluppano spontaneamente carcinomi mammari invasivi tra 6 e 12 settimane di età in ogni ghiandol....
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Risultati
Il metodo IVIL è stato utilizzato qui per esaminare la biodistribuzione in vivo e l'interazione dei tessuti di B7-H3-ICG e Iso-ICG, consentendo agli agenti, dopo l'iniezione endovenosa in un animale vivente, di interagire con il tessuto bersaglio per 96 h, e poi una volta che i tessuti sono primario anticorpi durante l'immunostaining ex vivo. Il metodo IVIL è stato anche confrontato con la colorazione IF standard dei tessuti per il marcatore B7-H3. Le normali ghiandole mammarie murine non.......
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Discussione
Questo metodo ha diversi passaggi critici e richiede potenziali modifiche per garantire una corretta implementazione. In primo luogo, il dosaggio e la tempistica dell'iniezione endovenosa anticorpo/anticorpo devono essere adattati all'applicazione specifica. Generalmente, dosaggi dovrebbero essere utilizzati che sono coerenti con come l'anticorpo coniugato sarà in genere utilizzato, cioè, dosaggi corrispondenti dell'anticorpo terapeutico o agente di contrasto basato su anticorpi. Inoltre, i tempi della raccolta dei tessu.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Andrew Olson (Stanford Neuroscience Microscopy Service) per le discussioni e l'uso delle attrezzature. Ringraziamo il dottor Juergen K. Willmann per il suo mentore. Questo studio è stato sostenuto da NIH R21EB022214 grant (KEW), NIH R25CA118681 training grant (KEW) e NIH K99EB023279 (KEW). Lo Stanford Neuroscience Microscopy Service è stato supportato da NIH NS069375.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Animal Model | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | Il Jackson Laboratory | 002374 | Femmine, 4-6 settimane di età |
| Forniture per la manipolazione degli animali | |||
| 27G Catetere | VisualSonics | Si prega di chiamare per ordinare | Vevo MicroMarker Kit di incannulamento |
| per l'accesso alla vena della codaSalviette imbevute di alcol | Fisher Scientific | 22-246073 | |
| Spugne di garza (4 "x 4" 16 strati) | Cardinal Health | 2913 | |
| Lampada termica | Morganville Scientific | . HL0100 | |
| Isoflurano | Henry Schein Animal Health | 29404 | |
| Unguento oftalmico | Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Nastro chirurgico | 3M | 1530-1 | |
| Tissue Collection | |||
| Stampi base monouso | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
| Temperatura di taglio ottimale (OCT) Media | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Pinza chirurgica London | Strumenti per la scienza fine | 11080-02 | |
| Forbici chirurgiche | Strumenti per la scienza | 14084-08 | |
| Anticorpi | |||
| AlexaFluor-488 capra anti-ratto IgG | Life Technologies | A-11006 | |
| AlexaFluor-546 capra anti-coniglio IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 capra anti-umano IgG | Life Technologies | A11014 | |
| Controllo dell'isotipo IgG umano | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| Anticorpo umanizzato anti-netrina-1 | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| Coniglio anti-Topo CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Clone Rat |
| anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clone |
| Reagents | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Clear Nail Polacco | Qualsiasi farmacia locale | ||
| Verde Indocianina - NHS | Intrace Medical | ICG-NHS estere | |
| Mezzo di montaggio | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
| Siero di capra normale | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
| Paraformaldeide (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Fosfato sterile Soluzione salina tamponata (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Supplies | |||
| Adesivi vetrini VWR | 48311-703 | ||
| Colonne di desalinizzazione | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| Vetrini di copertura | Fisher Scientific | 12-544G | |
| Penna barriera idrofobica | Ted Pella | 22311 | |
| Provette per microcentrifuga | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Vassoio per colorazione vetrini | VWR | 87000-136 | |
| Software | |||
| FIJI | LOCI, UW-Madison. | Versione 4.0 | https://fiji.sc/ |
Riferimenti
- Forthal, D. N. Functions of Antibodies. Microbiology Spectrum. 2 (4), 1-17 (2014).
- Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. D. Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity.
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Ristampe e permessi
