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Articolo metodologico

Utilizzo dell'attività di spiking del neurone per attivare gli stimoli a ciclo chiuso negli esperimenti neurofisiologici

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DOI:

10.3791/59812

⸱

12 novembre 2019

 ,  ,  , 
1Canadian Center for Behavioural Neuroscience, Department of Neuroscience, University of Lethbridge, 2Clinical Neurosciences, Cumming School of Medicine, University of Calgary

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo dimostra come utilizzare un sistema elettrofisiologico per la stimolazione a ciclo chiuso innescata da modelli di attività neuronale. Viene inoltre fornito un codice Matlab di esempio che può essere facilmente modificato per diversi dispositivi di stimolazione.

Abstract

I sistemi neurofisiologici a ciclo chiuso utilizzano modelli di attività neuronale per innescare stimoli, che a loro volta influenzano l'attività cerebrale. Tali sistemi a ciclo chiuso si trovano già nelle applicazioni cliniche e sono strumenti importanti per la ricerca di base del cervello. Uno sviluppo recente particolarmente interessante è l'integrazione di approcci a ciclo chiuso con l'optogenetica, in modo tale che modelli specifici di attività neuronale possono innescare la stimolazione ottica di gruppi neuronali selezionati. Tuttavia, la creazione di un sistema elettrofisiologico per gli esperimenti a circuito chiuso può essere difficile. Qui, un codice Matlab pronto per applicare viene fornito per l'attivazione di stimoli basati sull'attività di uno o più neuroni. Questo codice di esempio può essere facilmente modificato in base alle esigenze individuali. Ad esempio, mostra come attivare stimoli sonori e come modificarli per attivare un dispositivo esterno collegato a una porta seriale del PC. Il protocollo presentato è progettato per funzionare con un popolare sistema di registrazione neuronale per studi sugli animali (Neuralynx). L'implementazione della stimolazione a ciclo chiuso è dimostrata in un ratto sveglio.

Introduzione

L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare come implementare la stimolazione a ciclo chiuso negli esperimenti neurofisiologici. La configurazione tipica per gli esperimenti a ciclo chiuso nelle neuroscienze comporta l'attivazione di stimoli basati sulla lettura online dell'attività neuronale. Questo, a sua volta, provoca modifiche nell'attività cerebrale, chiudendo così il ciclo di feedback1,2. Tali esperimenti a ciclo chiuso forniscono molteplici vantaggi rispetto alle configurazioni standard a ciclo aperto, specialmente se combinati con l'optogenetica, che consente ai ricercatori di indirizzare un sottoinsieme specifico di neuroni. Ad esempio, Siegle e Wilson hanno utilizzato manipolazioni a circuito chiuso per studiare il ruolo delle oscillazioni theta nell'elaborazione delle informazioni3. Hanno dimostrato che stimolare i neuroni ippocampali sulla fase di caduta delle oscillazioni theta aveva effetti diversi sul comportamento rispetto all'applicazione della stessa stimolazione sulla fase di innalzamento. Anche gli esperimenti a ciclo chiuso stanno diventando sempre più importanti negli studi preclinici. Per esempio, più studi sull'epilessia hanno dimostrato che la stimolazione neuronale innescata all'insorgenza di convulsioni è un approccio efficace per ridurre la gravità delle crisi 4,5,6. Inoltre, i sistemi per il rilevamento automatizzato delle crisi epilettiche e la consegna contingente della terapia7,8 hanno mostrato benefici significativi nei pazienti con epilessia9,10,11,12. Un'altra area di applicazione con rapido avanzamento delle metodologie a ciclo chiuso è il controllo dei neuroprotesi con interfacce corticale cervello-macchina. Questo perché fornire un feedback istantaneo agli utenti di dispositivi protesici migliora significativamente la precisione e la capacità13.

Negli ultimi anni, diversi laboratori hanno sviluppato sistemi personalizzati per la registrazione elettrica simultanea dell'attività neuronale e la consegna di stimoli in un sistema a circuito chiuso14,15,16,17,18. Anche se molte di queste configurazioni hanno caratteristiche impressionanti, non è sempre facile implementarli in altri laboratori. Questo perché i sistemi spesso richiedono tecnici esperti per assemblare l'elettronica necessaria e altri componenti hardware e software necessari.

Pertanto, al fine di facilitare l'adozione di esperimenti a circuito chiuso nella ricerca sulle neuroscienze, questo documento fornisce un protocollo e codice Matlab per convertire un setup di registrazione elettrofisiologico open-loop19,20,21,22 in un sistema a circuito chiuso2,6,23. Questo protocollo è progettato per funzionare con l'hardware di registrazione Digital Lynx, un sistema di laboratorio popolare per le registrazioni della popolazione neuronale. Un esperimento tipico è costituito dai seguenti: 1) Registrazione di 5-20 minuti di dati di chiodare; 2) Smistamento Spike per creare modelli neuronali; 3) Utilizzando questi modelli per eseguire il rilevamento online di modelli di attività neurale; e 4) Innescare stimolazione o eventi sperimentali quando vengono rilevati modelli specificati dall'utente.

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Protocollo

Tutte le procedure qui descritte sono state eseguite nell'ambito di un protocollo di ricerca sugli animali approvato dall'University of Lethbridge Animal Welfare Committee.

1. Chirurgia

NOTA: Le procedure chirurgiche utilizzate per impiantare sonde per registrazioni neurofisiologiche sono state presentate in altre pubblicazioni24,25,26. I dettagli esatti dell'intervento chirurgico per la stimolazione a ciclo chiuso dipendono dal tipo di sonde di registrazione utilizzate e dalle aree cerebrali mirate. Nella maggior parte dei casi, tuttavia, un intervento chirurgico tipico sarà costituito dai seguenti passaggi.

  1. Portare in sala operatoria una gabbia con un ratto da impiantare con una sonda di silicone o un array di elettrodi per registrare l'attività neuronale.
  2. Anestesizzare il roditore con 2-2,5% isoflurane e fissare la testa in un telaio stereotassico. Assicurarsi che l'animale sia incosciente durante l'intervento chirurgico osservando qualsiasi reazione motorica a lievi stimoli tattili25.
  3. Applicare un unguento oculare per ridurre al minimo la secchezza durante l'intervento chirurgico.
  4. Rasare l'area chirurgica e disinfettare la pelle con soluzione di clorhessia 2% e 70% di alcool isopropile.
  5. Iniettare lidocaina (5 mg/kg) sotto il cuoio capelluto sopra l'area del cervello in cui verranno impiantati gli elettrodi.
  6. Fare un'incisione del cuoio capelluto sopra l'area del futuro impianto, e utilizzare un bisturi e tampone di cotone per cancellare il periosteo dal cranio esposto25.
  7. Forare 4-8 fori nel cranio per l'impianto di viti di ancoraggio (0,5 mm) come supporto strutturale per l'impianto25. Attaccare le viti al cranio inserendole nei fori e assicurarsi che siano tenute saldamente in posizione.
  8. Forare la craniotomia in corrispondenza delle coordinate specificate e immettere l'impianto microdrive/probe.
    NOTA: Il protocollo descritto per la stimolazione a ciclo chiuso funzionerà per qualsiasi regione cerebrale in cui sono inseriti gli elettrodi.
  9. Fissare il microdrive /sonda e qualsiasi connettore di interfaccia elettrica necessaria al cranio utilizzando acrilico dentale. La quantità di acrilico dentale dovrebbe essere sufficiente per attaccare saldamente l'impianto, ma non dovrebbe entrare in contatto con il tessuto molle circostante25.
  10. Dopo l'intervento chirurgico, monitorare attentamente l'animale fino a quando non ha recuperato sufficiente consapevolezza per mantenere la recumbency sternale25. Per i successivi 3 giorni, somministrare sottocutaneamente un analgesico (ad esempio Metacam, 1 mg/kg) e un antibiotico per prevenire l'infezione (ad esempio enrofloxacin, 10 mg/kg).
    NOTA: Gli animali sono in genere lasciati recuperare da un intervento chirurgico per una settimana prima di qualsiasi test o registrazione.

2. Installazione del software

NOTA: Questo è stato testato su Windows 10, versione a 64 bit.

  1. Installare il software di acquisizione ed elaborazione dei dati.
    1. Installare il sistema di acquisizione dati Cheetah 6.4 (https://neuralynx.com/software/category/sw-acquisition-control), che include le librerie per interagire con il cheetah Acquisition System.
    2. Installare SpikeSort3D (https://neuralynx.com/software/spikesort-3d) o qualsiasi altro software che utilizza KlustaKwik27 per lo smistamento dei picchi. Il software di rilevamento online utilizza le definizioni del cluster dal motore KlustaKwik. Questo software può essere eseguito sullo stesso computer o può essere eseguito su computer separati che si trovano sulla stessa rete.
    3. Installare NetComDevelopmentPackage (https://github.com/leomol/cheetah-interface/blob/master/NetComDevelopmentPackage_v3.1.0), che può essere scaricato anche da https://neuralynx.com/software/netcom-development-package.
  2. Install Matlab (https://www.mathworks.com/downloads/; il codice è stato testato sulla versione Matlab R2018a). Assicurarsi che Matlab sia abilitato nel firewall di Windows. Normalmente un pop-up verrà fuori durante la prima connessione.
    1. Accedere a un account Matlab. Scegli la licenza. Scegli la versione. Scegliere il sistema operativo.
  3. Scaricare la raccolta seguente per l'attivazione di eventi online da: https://github.com/leomol/cheetah-interface estrarre i file nella cartella 'Documenti/Matlab' del computer. Una copia del codice è fornita nei relativi Materiali supplementari.

3. Acquisizione iniziale dei dati

  1. Avviare l'acquisizione dei dati utilizzando il software Cheetah.
  2. Registrare alcuni minuti di dati con agguato per popolare le forme d'onda del modello.
  3. Interrompere l'acquisizione dei dati ed eseguire l'ordinamento dei picchi sui dati registrati.
    1. Aprire SpikeSort3D, fare clic su File Proprietà Menu . Caricare il file Spikee selezionare un file di picco dalla cartella con i dati registrati.
    2. Fare clic su Menu cluster e quindi su Cluster automatico utilizzando KlustaKwik, lasciando le impostazioni predefinite e fare clic su Esegui.

4. Esperimento a circuito chiuso

  1. Riprendere l'acquisizione dei dati in Cheetah.
  2. Aprire Matlab.
    1. Aprire ClosedLoop.m e fare clic su Esegui. In alternativa, nella finestra di comando di Matlab, eseguire ClosedLoop(). Assicurarsi che ClosedLoop.m si trova nel percorso Di Matlab. Se l'utente desidera utilizzare una funzione personalizzata per chiamare su ogni trigger, eseguire ClosedLoop('-callback', customFunction) invece, dove customFunction è un handle per tale funzione.
    2. Caricare le informazioni sui picchi definite sulla registrazione iniziale facendo clic su Carica, individuando la cartella di registrazione e selezionando uno dei file di dati (.ntt, .nse).
    3. Selezionare uno o più neuroni che attiveranno la stimolazione facendo clic sulla casella di controllo sotto le forme d'onda tracciate.
    4. Definire il numero minimo di neuroni che attiveranno la stimolazione digitando un numero intero nella casella di testo"min matches"; e definire l'intervallo di tempo in cui i picchi corrispondenti alle diverse forme d'onda sono considerati co-attivi digitando un numero nella casella di testo "finestra".
    5. Fare clic su Invia per iniziare. Questo inizierà l'attivazione online di eventi (toni come default) in base all'attività di chiodare di neuroni selezionati.

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Risultati

I ratti Fisher-Brown Norway nati e cresciuti sul posto sono stati abituati a maneggiare per due settimane prima dell'esperimento. Un'unità di registrazione è stata impiantata chirurgicamente, simile ai metodi descritti in precedenza28,29,30,31,32,33,34. I segnali neuronali sono stati registr...

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Discussione

Il protocollo descritto qui, mostra come utilizzare un sistema di registrazione neurofisiologico standard per eseguire la stimolazione a circuito chiuso. Questo protocollo consente ai neuroscienziati con scarse competenze in informatica di implementare rapidamente una varietà di esperimenti a ciclo chiuso con poco costo. Tali esperimenti sono spesso necessari per studiare le interazioni causali nel cervello.

Dopo aver preparato un animale e installato il software (passaggi 1 e 2), l'esperiment...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi legati a questo lavoro.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NSERC Discovery a AL e AG.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BaytrilBayer, Mississauga, CADIN 02169428antibiotico; 50 mg/mL
Cheetah 6.4NeuraLynx, Tucson, AZ6.4.0.betaInterfacce software per l'acquisizione dei dati 
Digital Lynx 4SXNeuraLynx, Tucson, AZ4SXdi registrazione
Trasmettitore headstageTBSIB10-3163-GKtrasmette il segnale neurale al ricevitore
IsofluranoFresenius Kabi, Toronto, CADIN 02237518inalazione anestetico
Jet Denture Powder & LiqudLang Dental, Wheeling, US1230acrilico dentale
Lacri-LubeAllergan, Markham, CADIN 00210889unguento oculare
Lido-2Rafter 8, CalgaryDIN 00654639anestetico locale; 20 mg/mL
MatlabMathworksR2018bper l'elaborazione del segnale e l'attivazione di eventi esterni
MetacamBoehringer, Ingelheim, DEDIN 02240463analgesico; 5 mg/mL
NetcomNeuraLynxv1Application Programming Interface (API) che comunica con Cheetah
Sonda in siliconeCambridge NeurotechASSY-156-DBC2dispositivo impiantato
SpikeSort 3D NeuraLynx, Tucson, AZSSStrumenti diclassificazione della forma d'onda del picco 3D da
a cellula Il ricevitore radio wirelessTBSI911-1062-00trasmette il segnale neurale al Digital Lynx
apparecchiature Software cellula

Riferimenti

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