Caratterizzazione a livello molecolare utilizzando robusti approcci biochimici di una nuova proteina Kinase

Summary

Abbiamo caratterizzato una nuova proteina della chinasi utilizzando robusti approcci biochimici: analisi Western Blot con un anticorpo specifico dedicato su diverse linee cellulari e tessuti, interazioni con esperimenti di coimmunoprecipitazioni, attività della chinasi rilevata da Western Blot utilizzando un anticorpo specifico per ilfosforo e con l'etichettatura ATP di z[32 P].

Abstract

L'ampio sequenziamento dell'intero genoma ha identificato molti Open Reading Frame (ORF) che forniscono molte potenziali proteine. Queste proteine possono avere ruoli importanti per la cellula e possono svelare nuovi processi cellulari. Tra le proteine, le chinasi sono i principali attori in quanto appartengono ai percorsi di segnalazione cellulare e hanno la capacità di attivare o disattivare molti processi cruciali per il destino della cellula, come la crescita cellulare, la divisione, la differenziazione, la motilità e la morte.

In questo studio, ci siamo concentrati su una nuova potenziale proteina della chinasi, LIMK2-1. Abbiamo dimostrato la sua esistenza da Western Blot utilizzando un anticorpo specifico. Abbiamo valutato la sua interazione con una proteina a monte che regola utilizzando esperimenti di coimmunoprecipitazioni. La coimmunoprecipitazione è una tecnica molto potente in grado di rilevare l'interazione tra due proteine bersaglio. Può anche essere utilizzato per rilevare nuovi partner di una proteina esca. La proteina esca può essere purificata tramite un tag progettato alla sua sequenza o tramite un anticorpo che la ridestina specificamente. Questi complessi proteici possono quindi essere separati da SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) e identificati utilizzando la spettrometria di massa. Immunoprecipitato LIMK2-1 è stato utilizzato anche per testare la sua attività di chinasi in vitro da z[³²P] ETICHETTAtura ATP. Questo saggio ben consolidato può utilizzare molti substrati diversi, e versioni mutate dell'esca possono essere utilizzate per valutare il ruolo di residui specifici. Gli effetti degli agenti farmacologici possono anche essere valutati poiché questa tecnica è sia altamente sensibile che quantitativa. Ciò nonostante, la manipolazione della radioattività richiede particolare cautela. L'attività della chinasi può anche essere valutata con anticorpi specifici che prendono di mira il gruppo di fosforo dell'amminoacido modificato. Questi tipi di anticorpi non sono disponibili in commercio per tutti i residui modificati al fosforo.

Introduction

Per molti decenni, sono state chiarite numerose vie di segnalazione e il loro coinvolgimento in processi cellulari cruciali come la divisione cellulare, la differenziazione, la motilità, la morte cellulare programmata, l'immunità e la neurobiologia, è stato dimostrato. Le chinasi svolgono un ruolo significativo in questi percorsi di segnalazione in quanto spesso regolano finemente la loro attivazione o inattivazione e fanno parte di complessi versatili transitori che rispondono agli stimoli esterni^1,2,3. La mutazione e la disregolazione delle chinasi spesso portano a malattie....

Protocol

1. Preparazione cellulare per la trasfezione

DESTRA: Tutti i passi della coltura cellulare devono essere eseguiti in un laboratorio dedicato e le cellule vengono manipolate all'interno di un mobile microbiologico di classe 2.

1. Cellule di semi HEK-293 (Rene embrionale umano) in piastre da 10 cm in 10 mL di DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium) completate con siero di vitello fetale al 10%. Coltura per 3-5 giornisotto il 5% di CO 2, a 37 gradi centigradi, fino a raggiungere il 90% di confluenza.
2. Trattare le lastre di 10 cm con il collagene R per aumentare l'adesione cellulare alle piastre di plastica.
   1. ....

Results

LA proteina LIMK2-1 è sintetizzata
LIMK2-1 è menzionato nelle banche dati, ma finora solo un documento ha dimostrato l'esistenza del suo mRNA¹⁸. Rispetto ai suoi due omologhi, LIMK2a e LIMK2b, LIMK2-1 ha un dominio aggiuntivo di terminale C identificato come dominio inibitorio della proteina fosfogio 1 (PP1i). Abbiamo progettato un anticorpo che si rivolge a un peptide di questo dominio, aminoacidi 671-684 (Figura 1A

Discussion

Qui, abbiamo usato robusti strumenti biochimici per caratterizzare a livello molecolare una nuova proteina, LIMK2-1, che si ritiene sia una chinasi basata sulla sua sequenza e sui suoi omologhi, LIMK2a e LIMK2b²⁰.

In primo luogo, abbiamo dimostrato l'esistenza di LIMK2-1 a livello proteico usando l'analisi Western Blot con un anticorpo specifico. In seguito, abbiamo valutato la sua interazione con la chinasi a monte ROCK1, che è nota per regolare LIMK2a e LIMK2b, gli om.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticorpo anti-actina	Sigma-Aldrich	A1978	per Western Blot
Anticorpo anti-c-Myc	Invitrogen	MA1-21316	per Western Blot
Anticorpo anti-cofilina	Tecnologia di segnalazione cellulare	3312/5175	per Western Blot
Anticorpo anti-GFP	Santa Cruz	sc-9996	per Western Blot
Anticorpo anti-HA	Roche Applied Science	11687423001	per Western Blot
Anticorpo anti-fosfo-cofilina	Tecnologia di segnalazione cellulare	3313	per Western Blot
Anticorpo Anti-PP1i	Eurogentec	progettato per questo studio	per Western Blot
Aprotinina	Euromedex	A-162B	per tampone di lisi
ATP	Invitrogen	PV3227	per γ[ Etichettatura 32P
"γ[ 32P] ATP	Perkin Elmer	NEG502A	per γ[ Etichettatura 32P]
salina tamponata BES	Sigma-Aldrich	14280	per trasfezione
β-glicerofosfato	Sigma-Aldrich	G9422	per tampone lisi e chinasi
β-mercaptoetanolo	Sigma-Aldrich	M3148	per Laemmli
BSA	Sigma-Aldrich	A3059	per tampone
di bloccoBlu di bromofenolo	Sigma-Aldrich	B0126	per Laemmli
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881	per la trasfezione
Centrifuga	Sigma	111-541
Collagene R	Pan Biotech	P06-20166	per la trasfezione
Controllo siRNA	Ambion	AM4611	per la specificità
degli anticorpi PP1iCoomassie PageBlue Soluzione di colorazione delle proteine	Thermo-Fisher	24620	per colorazione su gel
EDTA	Sigma-Aldrich	3690	per tampone di lisi
Unità di elettroforesi	Biorad	Mini-Protean	per Western Blot
EZview Gel rosso di affinità anti-HA	Sigma-Aldrich	E6779	per immunoprecipitazione
Software GeneSys	Ozyme		per l'acquisizione di Western Blot
Software GeneTolls	Ozyme		per la quantificazione Western Blot
Perle GFP-trappola	Chromtek		per l'immunoprecipitazione
Glicina	Euromedex	26-128-6405	per tampone di trasferimento
GST-cofilina	Upstate Cell signaling	12-556	per γ[ Etichettatura 32P]
Siringa Hamilton 100 mL	Hamilton	710	per rimuovere accuratamente il surnatante dalle perle senza aspirarle
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	per tampone chinasi
Software ImageQuant TL	GE Healthcare		per l'acquisizione e la quantificazione della radioattività
LIMK2 siRNA	Ambion	s8191	per PP1i specificità anticorpale
Leupeptin	Sigma-Aldrich	SP-04-2217	per lisi e tampone chinasi
MBP	Upstate Cell signaling	13-173	per γ[ Marcatura 32P]
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	per tampone chinasi
MnCl2	Sigma-Aldrich	244589	per tampone chinasi
NaCl	Euromedex	1112	per lisi e tampone chinasi
NaF	Sigma-Aldrich	S-1504	per tampone lisi e chinasi
Okaidic acido	Euromedex	0-2220	per tampone di lisi
PMSF	Sigma-Aldrich	78830	per tampone di lisi e chinasi
p-nitrofenilfosfato	Euromedex	1026	per tampone di lisi
membrana PVDF Immobillon-P	Merck-Millipore	IPVH00010 dimensione dei pori 0,45 mm	per Western Blot
Ruota rotante	Labinco		per incubazione di perle
Safe lock eppendorf	Eppendorf	0030120.086	per il test delle chinasi
SDS	Sigma-Aldrich	5030	per Laemmli e tampone di migrazione
Ortovanadato di sodio	LC Laboratories	S8507	per tampone di lisi e chinasi
Pirofosfato di sodio	Fluka	71501	per tampone di lisi
Super Signal West Dura	Protein Biology	34075	per Western Blot
Syngene Pxi	Ozyme		Western Blot
	Biochain	P1234035 Cervello P12345152 Polmone P1234149 Fegato P1234188 Pancreas P1234260 Testicolo	per analisi Western Blot
Unità di trasferimento	Biorad	Mini-Trans-Blot	per Western Blot
Tris	Euromedex	26-128-3094 B	per tampone di lisi
Tween-20	Sigma-Aldrich	P7949	per tampone bloccante
Typhoon FLA9500	GE Healthcare		per leggere l'autoradiografia
Typhoon Trio	Amersham Bioscience		per leggere l'autoradiografia
Carta Whatman	GE Healthcare	3030-672	per Western Blot