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Articolo metodologico

Generazione in vitro di cellule progenitrici cardiache specifiche del campo del cuore del mouse

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DOI:

10.3791/59826

⸱

3 luglio 2019

 ,  , 
1Division of Cardiology, Department Medicine, Johns Hopkins School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Lo scopo di questo metodo è quello di generare cellule progenitrici cardiache specifiche del campo cardiaco del campo cardiaco in vitro al fine di studiare le specifiche delle cellule progenitrici e le proprietà funzionali, e di generare cellule cardiache specifiche della camera per la modellazione delle malattie cardiache.

Abstract

Le cellule staminali pluripotenti offrono un grande potenziale per comprendere lo sviluppo e la malattia del cuore e per la medicina rigenerativa. Sebbene i recenti progressi nella cardiologia dello sviluppo abbiano portato a generare cellule cardiache da cellule staminali pluripotenti, non è chiaro se i due campi cardiaci - il primo e il secondo campo cardiaco (FHF e SHF) - siano indotti nei sistemi di cellule staminali pluripotenti. Per risolvere questo problema, abbiamo generato un protocollo per la specifica in vitro e l'isolamento delle cellule progenitrici cardiache specifiche del campo cardiaco. Abbiamo usato linee di cellule staminali embrionali che trasportano Hcn4-GFP e Tbx1-Cre; I giornalisti Rosa-RFP del FHF e dello SHF, rispettivamente, e l'immunostaining delle cellule vive della proteina della membrana cellulare Cxcr4, un marcatore SHF. Con questo approccio, abbiamo generato cellule progenitrici che ricapitolano le proprietà funzionali e il trascrittoma delle loro controparti in vivo. Il nostro protocollo può essere utilizzato per studiare le specifiche iniziali e la segregazione dei due campi cardiaci e per generare cellule cardiache specifiche della camera per la modellazione delle malattie cardiache. Poiché si tratta di un sistema organoide in vitro, potrebbe non fornire informazioni anatomiche precise. Tuttavia, questo sistema supera la scarsa accessibilità degli embrioni dello stadio di gasastrulation e può essere scalato per schermi ad alta velocità.

Introduzione

L'uso di cellule staminali pluripotenti (PSC) ha rivoluzionato il campo della rigenerazione cardiaca e della medicina personalizzata con miociti specifici per il paziente per la modellazione della malattia e le terapie farmacologiche1,2,3, 4.Più recentemente, sono stati sviluppati i protocolli in vitro per la generazione di cardiomiociti atriale vs ventricolare e di un pacemaker derivato da PSC5,6. Tuttavia, se la cardiogenesi può essere ricreata in vitro per studiare lo sviluppo cardiaco e successivamente generare cellule cardiache ventricolare specifiche della camera non è ancora chiaro.

Durante lo sviluppo embrionale precoce, le cellule mesodermiche sotto l'influenza di morfogeni secreti come BMP4, Wnts e Activin A formano la striscia primitiva7. Le cellule mesodermiche cardiache segnate dall'espressione di Mesp1 migrano anteriormente e ultimamente per formare la mezzaluna cardiaca e poi il tubo cardiaco primitivo7,8. Questo gruppo migratorio di cellule comprende due distinte popolazioni di cellule progenitrici cardiache (CPC), vale a dire il primo e il secondo campo cardiaco (FHF e SHF)9,10. Le cellule del SHF sono altamente proliferanti e migratorie e sono principalmente responsabili dell'allungamento e del looping del tubo cardiaco. Inoltre, le cellule SHF si differenziano per cardiomiociti, fibroblasti, muscoli lisci e cellule endoteliali mentre entrano nel tubo cardiaco performare il ventricolo destro, il tratto di deflusso ventricolare destro e gran parte di entrambi atri atri,10. Al contrario, le cellule FHF sono meno proliferanti e migratorie e si differenziano principalmente per i cardiomiociti in quanto danno origine al ventricolo sinistro e una parte più piccola degli atri11. Inoltre, i progenitori SHF sono contrassegnati dall'espressione di Tbx1, FGF8, FGF10 e Six2 mentre le cellule FHF esprimono Hcn4 e Tbx511,12,13,14,15.

I PSC possono differenziarsi a tutti e tre glistrati germinali e successivamente a qualsiasi tipo di cellula nel corpo 4,16. Pertanto, offrono un enorme potenziale per comprendere lo sviluppo del cuore e per modellare difetti specifici dello sviluppo con conseguente malattia cardiaca congenita, la causa più frequente di difetti alla nascita17. Un grande sottogruppo di malattie cardiache congenite include anomalie cardiache specifiche della camera18,19. Tuttavia, non è ancora chiaro se questi provengano dallo sviluppo anomalo del campo cardiaco. Inoltre, data l'incapacità dei cardiomiociti di proliferare dopo la nascita, ci sono stati ampi sforzi per creare tessuto cardiaco per la rigenerazione cardiaca1,7,20. Considerando le differenze fisiologiche e morfologiche tra le camere cardiache, la generazione di tessuto cardiaco specifico della camera utilizzando i PSC è di notevole importanza. Mentre i recenti progressi nella cardiologia dello sviluppo hanno portato a una solida generazione di cellule cardiache da PSC, non è ancora chiaro se i due campi cardiaci possano essere indotti nei sistemi PSC.

Per ricapitolare cardiogenesi in vitro e studiare le specifiche e le proprietà dei CPC, in precedenza abbiamo usato un sistema basato sulla differenziazione degli sferoidi cardiaci derivati da PSC21,22,23,24. Recentemente, abbiamo generato cellule staminali embrionali di topo (mESC) con gFP e reporter RFP sotto il controllo del gene FHF Hcn4 e del gene SHF Tbx1, rispettivamente (mESCsTbx1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. Gli mESC differenziati in vitro formavano sferoidi cardiaci in cui le cellule GFP e RFP sono apparse da due aree distinte di cellule mesodermiche e modellate in modo complementare. Le cellule di GFP e RFP e RFP risultanti hanno mostrato caratteristiche FHF e SHF, determinate rispettivamente dalle analisi di sequenziamento dell'RNA e clonali. È importante sottolineare che, utilizzando mESC che trasportano il reporter Isl1-RFP (mESCIsl1-RFP), abbiamo scoperto che le cellule SHF sono state contrassegnate fedelmente dalla proteina della superficie cellulare CXCR4, e questo può consentire l'isolamento delle cellule specifiche del campo cardiaco senza transgeni. Il presente protocollo descriverà la generazione e l'isolamento di CPC specifici sul campo cardiaco da mESC, che possono fungere da valido strumento per studiare le malattie cardiache specifiche della camera.

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Protocollo

NOT: Nella generazione in vitro di cellule progenitrici cardiache del campo cardiaco specifiche del campo cardiaco (Figura 1).

1. Manutenzione degli ESC del mouse

  1. Coltivare mESC (mESCsTbx1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP, mESCIsl1-RFP)25 su 0,1% (w/v) gelatina rivestita t25 flaconi in 2i media (870 mL di glascow minimo mezzo essenziale (GMEM), 100 mL di siero bovino fetale (FBS), 10 mL di GlutaMAX, 10 mL di acidi essenziali non essenziali, 10 ml di piravae, 3 - L di beta-mercaptoetanolo, 20-L di Lif (200 U/mL), 0,3 CHIR99021 e 0,1 -M PD0325901).
  2. Quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza, sciacquare le cellule una volta con soluzione tampone fosfato (PBS) e quindi dissociare in singole cellule aggiungendo 1 mL di Trypsin e incubando a 37 gradi centigradi per 3 min.
  3. Neutralizza Trypsin aggiungendo 4 mL di 10% FBS nel DMEM (Modified Eagle Medium) di Dulbecco. Contare le celle utilizzando un contatore cellulare automatizzato.
  4. Centrifuga 3 x 105 cellule per 3 min a 270 x g e temperatura ambiente.
  5. Aspirati il supernatore, sospendere le cellule in 5 mL di mezzo 2i e riplaccare su 0.1% (w/v) gelatina rivestita flaconi T25 per la manutenzione.

2. Generazione di cellule progenitrici cardiache utilizzando sferoidi cardiaci

  1. Centrifuga 2,5 x 106 cellule dal passo 1,3 per 3 min a 270 x g e temperatura ambiente.
  2. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 25 mL di mezzo SFD (105 celle / mL). A seconda della portata dell'esperimento, il numero mESC può essere regolato di conseguenza.
    NOT: Il supporto SFD contiene 715 mL di Medium (IMDM) di Iscove, 250 mL di F12 di Ham, 5 mL di N2-supplemento, 10 mL di B27 meno vitamina A, 5 mL di 10% (w/v) BSA (in PBS), 7,5 mL di GlutaMAX e 7,5 mL di Penicillina-Streptomimia. Aggiungere l'acido ascorbico (50 mg/mL) e 3,9 x 10-3% (v/v) di monothioglicerolo prima dell'uso.
  3. Infilare la sospensione cellulare in una piastra sterile da 150 mm x 25 mm e incubare a 37 gradi centigradi nell'incubatrice di CO2 del 5% per 48 h. Gli sferoidi cardiaci devono essere formati entro 24 ore.
  4. Raccogliere tutti gli sferoidi cardiaci formati e centrifugare per 3 min a 145 x g e temperatura ambiente per isolare selettivamente gli sferoidi ed evitare singole cellule.
  5. Aspirare il supernatante e risospendere gli sferoidi in 25 mL di mezzo SFD con 1 ng/mL di Activin A e 1.5 ng/mL di BMP4 per l'induzione differenziazione. Placcare gli sferoidi nella stessa piastra sterile da 150 mm x 25 mm e incubarli a 37 gradi centigradi nell'incubatrice di CO2 del 5% per 40 h.
    NOT: Diverse concentrazioni di Activin A (0-3 ng/mL) e BMP4 (0,5-2 ng/mL) possono essere utilizzate per l'ottimizzazione della differenziazione a seconda della linea mESC.
  6. Raccogliere tutti gli sferoidi cardiaci e centrifugare per 3 min a 145 x g e temperatura ambiente.
  7. Aspirare il supernatante e risospendere gli sferoidi in 25 mL di SFD medio. Trasferire gli EB risospesi in un accessorio ultra-basso 75 cm2 fiaschetta e incubarli a 37 gradi centigradi nell'incubatrice di CO2 del 5% per 48 h.

3. Isolamento delle cellule progenitrici cardiache specifiche del campo cardiaco mediante reporter fluorescenti

  1. Centrifuga sferoidi cardiaci a 145 x g e temperatura ambiente per 3 min e aspirare il supernatante. Aggiungere 1 mL di Trypsin e incubare a 37 gradi centigradi per 3 min.
  2. Aggiungere 4 mL di 10% FBS in DMEM per inattivare Trypsin e mescolare bene con il pipettaggio. Per rimuovere gli EB non dissociati, filtrare il mix utilizzando un colino da 70 mm e centrifugare le cellule filtrate per 3 min a 270 x g e temperatura ambiente.
  3. Ordinare i CPC che trasportano reporter fluorescenti (CPC derivati da mESCsTbx1-Cre; Rosa-RFP; HCN4-GFP), aspira il superataento e aggiunge la 500 unità di smistamento FACS (1% (v/v) FBS, 200 mM HEPES e 10 mM di EDTA in PBS) per la sospensione.
  4. Per rimuovere tutti i cluster di cellule prima dello smistamento, filtrare nuovamente le cellule utilizzando un tubo rotondo-inferiore in polistirolo da 5 mL con un colino da 40 m. Tenere le cellule sul ghiaccio fino allo smistamento.
  5. Ordinare le celle per isolare Tbx1-Cre; Rosa-RFP e HCN4-GFP CPC positivi utilizzando un sorter cellulare attivato fluorescente (FACS). Raccogliere le celle ordinate in 1 mL di FBS. Mantenere il campione di celle e le celle ordinate a 4 gradi centigradi.

4. Isolamento delle cellule progenitrici cardiache specifiche del campo cardiaco utilizzando Cxcr4 come indicatore di proteine della superficie cellulare

  1. Per isolare i CPC di primo campo contro il secondo campo cardiaco in base all'espressione del recettore della proteina superficiale Cxcr4, utilizzare la linea mESCIsl1-RFP. Aspirare il supernatante dal passo 3.3 e risospendere i singoli CPC in 300 : L di 10% FBS in PBS contenente 1:200 (vol/vol) PerCP-efluor 710 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-Cxcr4 anti-
  2. Incubare a temperatura ambiente per 5min e lavare aggiungendo 1-2 mL di PBS freddo. Centrifugare i singoli CPC per 3 min a 270 x g e temperatura ambiente e lavare altre due volte seguite dalla centrifugazione.
  3. Aspirati il supernatante e aggiungete 500 l di soluzione di selezione FACS per risospendere i singoli CPC e filtrare come nel passaggio 3.4.
  4. Isolare le celle Cxcr4 e Cxcr4 utilizzando FACS. Raccogliere le celle ordinate in 1 mL di FBS. Mantenere il campione di celle e le celle ordinate a 4 gradi centigradi.

5. Analisi delle cellule progenitrici cardiache specifiche del campo cardiaco isolato

  1. CPC ordinati Centrifuga per 3 min a 270 x g e temperatura ambiente. Le cellule ordinate possono essere utilizzate per analisi dell'espressione genica e proteica oppure possono essere ricoltivate per le analisi in momenti successivi.
  2. Per ricolturare cPC isolati, aspirare il supernatore, risospendere le cellule in mezzo SFD e riaffiorare 3 x 104 celle per un piatto di 384 pozzetti rivestito con 0,1% (w/ v) gelatina.  Se si nota un aumento della morte cellulare dopo l'ordinazione, aggiungere al campione 10 M di Y-27632 (inibitore ROCK). Due giorni dopo la ricoltura, si deve notare il pestaggio spontaneo.
  3. Per analizzare la capacità dei CPC placcati di differenziarsi ai cardiomiociti, raccogliere le cellule al giorno 12 della differenziazione. Utilizzare la Trypsin come descritto nei passaggi 1.2-1.5 per isolare le singole PMI. Resospendio le cellule in paraformaldeide (PFA) del 4% (w/v) e incubaperdi per 30 min a temperatura ambiente per fissare le cellule.
  4. Centrifugare le cellule per 3 min a 895 x g, e temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in PBS per lavare il PFA. Ripetere di nuovo questo passaggio.
  5. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 10% FBS in PBS. Incubametà metà del campione cellulare con anticorpo topo anti-Troponina T (1:500) e utilizzare il resto del campione come controllo negativo. Incubare per 30 min a temperatura ambiente.
  6. Lavare le celle due volte come descritto nel passaggio 5.4 utilizzando PBS. Aspirati il superatante e risospendere entrambi i campioni di cellule in 10% FBS in PBS con 1:500 asino anti-topo IgG (H-L) anticorpo, Alexa Fluor 647 coniugato. Incubare per 30 min a temperatura ambiente.
  7. Lavare due volte con PBS come nel passaggio 5.6. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 200 gradi l di PBS. Utilizzare un citometro di flusso per analizzare le cellule.

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Risultati

Dopo circa 132 h di differenziazione, i CPC Tbx1-RFP e Hcn4-GFP possono essere rilevati utilizzando un microscopio fluorescente (Figura 2). Generalmente, le celle GFP e RFP appaiono approssimativamente intorno allo stesso tempo. Le due popolazioni di CPC continuano ad espandersi nelle immediate vicinanze e comunemente in un modello complementare. L'adeguamento delle concentrazioni di Activin A e BMP4 modificherà le percentuali di FHF vs CPC SHF (Figura 3). La sp...

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Discussione

Nel nostro protocollo, descriviamo una metodologia per generare sferoidi cardiaci e CPC isolati specifici sul campo del cuore. Questi possono essere utilizzati per studiare i meccanismi di specifica CPC e le loro proprietà, così come per la modellazione della malattia della camera cardiaca specifica. Un lavoro pubblicato in precedenza ha utilizzato una linea mESC con due reporter fluorescenti (Mef2c/Nkx2.5) per studiare cardiogenesi in vitro, tuttavia, entrambi questi marcatori sono espressi al giorno embrionale 9,5-10 q...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla per le divulgazioni.

Ringraziamenti

E. T. è stato supportato da The Magic That Matters e AHA. C. K. è stato supportato da sovvenzioni da NICHD/NIH (R01HD086026), AHA e MSCRF.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
β-mercaptoetanoloSigmaM6250
0,1% (p/v) GelatinaEMD MilliporeES-006-B
100 mM Piruvato di sodioGibco11360
100x Pen/StrepGibco15070-063
1x PBS senza calcio e magnesioThermo Fisher Scientific21-040-CV
20% ParaformaldeideThermo Fisher Scientific50-980-493
mL Tubo in polistirene a fondo tondo con 40μ filtro cellulare mBD Falcon35223
Activin AR & D Systems338-AC-010
Acido ascorbicoSigmaA-4544
B27 meno vitamina A (50x)Thermo Fisher Scientific12587010
BMP4R & D Systems314-BP
Albumina di siero bovinoSigmaA2153
Selezionatore cellulareSonySH800Sony o qualsiasi altro selezionatore cellulare attivato dalla fluorescenza
Filtro cellulare 70μ mThermo Fisher Scientific08-771-2
Centrifuga Sorvall Legend XTThermo Fisher Scientific75004508
CHIR99021Selleck chemicalsS2924
CO2 IncubatoreThermo Fisher Scientific51030285
Corning Ultra Low Attachment T75 PalloneCorning07-200-875
Innumerevoli contatori cellulari automatizzati II FLThermo Fisher Scientific
Donkey anticorpo secondario IgG di topo, Alexa Fluor 647 coniugatoThermo Fisher ScientificA-31571, Lotto #1757130
Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM)Gibco11965-092
EDTASigmaE6758
ESGRO (LIF)Microscopio MilliporeESG1106
EVOS FLThermo Fisher ScientificAMF4300
Siero Fetale BovinoInvitrogenSH30071.03
Glasgow' s MEM (GMEM)Gibco11710035
GlutaMAX (100x)Gibco35050-061
Ham' s F12Gibco10-080-CV
HEPESSigmaH3375
IMDMGibco12440053
Monotioglicerero (MTG)SigmaM-6145
Anticorpo anti-troponina T di topoThermo Fisher ScientificMS-295-P1
N2-SUPPLEMENTGibco17502-048
Non essenziale soluzione di aminoacidi (NEAAInvitrogen11140-050
PD0325901SelleckchemS1036
PerCP-efluor 710 anticorpo coniugato anti-Cxcr4Thermo Fisher Scientific46-9991-82
Piatto di coltura in sospensione 150 mm x 25 mmFiasche Corning430597
T25Corning353109
TrypLE (tripsina)Gibco12604
Y-27632 (inibitore ROCK)Tecnologie delle cellule staminali72304
5

Riferimenti

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