È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursori per la crescita autonoma della vescicola

5.2K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/59831

⸱

28 giugno 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Physics of Synthetic Systems - E14, Physics-Department and ZNN, Technische Universität München, 2Departmant of Chemistry, Center for Integrated Protein Science (CIPSM), Technische Universität München, 3Nanosystems Initiative Munich

In questo articolo

Sommario

Qui sono presentati protocolli per la creazione di piccole vescibole unilamellar a base di peptidi in grado di crescere. Per facilitare la produzione vesiculo del peptide della membrana, queste vesciche sono dotate di un sistema di traduzione della trascrizione e del plasmide di codifica dei peptidi.

Abstract

La compartimentazione delle reazioni biochimiche è un aspetto centrale delle cellule sintetiche. A questo scopo, i compartimenti di reazione basati su peptidi servono come alternativa attraente ai liposomi o alle vesciche a base di acidi grassi. Esternamente o all'interno delle vesciche, i peptidi possono essere facilmente espressi e semplificare la sintesi dei precursori della membrana. Fornito qui è un protocollo per la creazione di vesciche con diametri di 200 nm sulla base dei polipeptidi elastina-come anfilici (ELP) utilizzando la disidratazione-reidratazione da perline di vetro. Sono inoltre presentati protocolli per l'espressione e la purificazione batterica degli ELP attraverso il ciclo della temperatura inversa, nonché la loro funzionalizzazione covalente con coloranti fluorescenti. Inoltre, questo rapporto descrive un protocollo per consentire la trascrizione dell'RNA aptamer dBroccoli all'interno delle vescicle ELP come esempio meno complesso per una reazione biochimica. Infine, viene fornito un protocollo, che consente in vesiculo espressione delle proteine fluorescenti e del peptide della membrana, mentre la sintesi di quest'ultimo si traduce nella crescita vescicale.

Introduzione

La creazione di sistemi cellulari viventi sintetici è di solito avvicinata da due direzioni diverse. Nel metodo top-down, il genoma di un batterio è ridotto ai suoi componenti essenziali, portando in ultima analisi ad una cellula minima. Nell'approccio bottom-up, le cellule artificiali sono assemblate de novo da componenti molecolari o sottosistemi cellulari, che devono essere integrati funzionalmente in un sistema coerente simile a una cellula.

Nell'approccio de novo, la compartimentazione dei componenti biochimici necessari è solitamente ottenuta utilizzando membrane a base di fosfolipidi o acidi grassi1,2,3,4. Questo perché le membrane cellulari "moderne" sono costituite principalmente da fosfolipidi, mentre gli acidi grassi sono considerati candidati plausibili di recinti di membrana prebiotica5,6. Per la formazione di nuove membrane o per facilitare la crescita della membrana, gli elementi costitutivi anfilici devono essere forniti dall'esterno7 o idealmente attraverso la produzione all'interno di un vano membranoutilizzando utilizzando i corrispondenti processi anabolizzanti4 ,8.

Mentre la sintesi dei lipidi è un processo metabolico relativamente complesso, i peptidi possono essere prodotti abbastanza facilmente utilizzando reazioni di espressione genica prive di cellule9,10. Quindi, le membrane peptidiche formate da peptidi anfifile rappresentano un'interessante alternativa alle membrane lipidiche come recinti per imitazioni cellulari artificiali che sono in grado di crescere11.

I copolimeri anfifici simili all'elastina (ELP) sono una classe attraente di peptidi, che può fungere da elemento costitutivo per tali membrane12. Il motivo di base della sequenza di amminoacidi di ELPs è (GaGVP)n, dove "a" può essere qualsiasi aminoacido ad eccezione della prolina e "n" è il numero di ripetizioni motif13,14,15,16,17 . ELP sono stati creati con un blocco idrofobico contenente principalmente fenilalanina per un e un blocco idrofilo composto principalmente da acido glutammico11. A seconda dei parametri di una e soluzione, come la concentrazione di pH e sale, gli ELP presentano una cosiddetta transizione di temperatura inversa alla temperatura Tt, dove i peptidi subiscono una transizione di fase completamente reversibile da un idrofilo all'idrofobico stato. La sintesi dei peptidi può essere facilmente implementata all'interno di vesciche utilizzando l'estratto di cellule batteriche "TX-TL"11,18,19,20,21, che fornisce tutti i componenti necessari per le reazioni di trascrizione e traduzione accoppiate.

Il sistema TX-TL è stato incapsulato insieme, con il modello di DNA che codifica gli ELP nelle vescicoli ELP utilizzando la reidratazione-reidratazione dalle perline di vetro come supporto solido. La formazione di vescicle avviene attraverso la reidratazione dei peptidi secchi dalla superficie del tallone11. Possono essere utilizzati altri metodi22 per la formazione di vescicoli, che potenzialmente mostrano una minore polidispersione e dimensioni vesciche più grandi (ad esempio, elettro-formazione, trasferimento di fase di emulsione o metodi basati sulla microfluidica). Per testare la fattibilità del metodo di incapsulamento, la trascrizione dell'aptamer fluorogenico dBroccoli23 può essere utilizzata in alternativa11, che è meno complessa dell'espressione genica con il sistema TX-TL.

A causa dell'espressione dei mattoni della membrana in vesiculo e la loro successiva incorporazione nella membrana, le vesciche iniziano a crescere11. L'incorporazione di membrane degli ELP può essere dimostrata attraverso un saggio FRET. A tal fine, gli ELP utilizzati per la formazione della popolazione vescicana iniziale sono coniugati con coloranti fluorescenti in parti uguali che costizzano una coppia FRET. Dopo l'espressione di ELP non etichettati in vesiculo e la loro incorporazione nella membrana, gli ELP etichettati nella membrana vengono diluiti e di conseguenza il segnale FRET diminuiscedi 11. Come metodo versatile e comune per la coniugazione, viene utilizzato la cicloaddition azide-alkyne catalizzata in rame. Con l'uso di un legamento stabilizzante come tris(benzyltriazolylmethyl)-ammine, la reazione può essere effettuata in una soluzione acquosa a un pH fisiologico senza l'idrolisi dei reanti11, che è appropriato per le reazioni di coniugazione peptidi.

Il seguente protocollo presenta una descrizione dettagliata della preparazione per i peptidosos a base di ELP. Viene descritta l'espressione dei peptidi e della formazione di velecle utilizzando il metodo delle perline di vetro. Inoltre, viene descritto come implementare la trascrizione dell'aptamer fluorogenico dBroccoli e la reazione trascrizione-traduzione per l'espressione proteica all'interno delle vesciche ELP. Infine, è fornita una procedura per la coniugazione di ELP con fluorofori, che può essere utilizzato per dimostrare la crescita vescicale attraverso un analisi FRET11.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. Espressione di Polipeptidi simili a Elastin

  1. Giorno 1: Preparazione di una coltura di avviamento e forniture per l'espressione peptide
    1. Preparare e autoclave espressione coltura flaastri (4 x 2.5 L) e 3 L di lB medio. Per 1 L di LB medio, aggiungere 25 g di LB in polvere a 1 L di acqua ultrapura.
    2. Preparare una coltura di avviamento con una soluzione di clorramphenico di 100 mL di un lB medio, 50 -L di filtro sterile (filtro 0,22 m) (25 mg/mL in EtOH) e 50 lun di filtro sterile (filtro da 0,22 m) soluzione di carcillina (100 mg/mL in 50% EtOH e 50% di acqua ultrapura).
    3. Aggiungere una piccola striscia da un stock batterico pre-fatto contenente ceppo E. coli BL21(DE3)pLysS con il vettore di espressione pET20b() codificando la sequenza polipeptide MGHGVGVP((GEGVP)4(GVGVP))4((GFGVP)4(GVGVP))3 (GFGVP)4GWP (abbreviato come EF) a una coltura di avviamento preriscaldata di 100 mL e incubare a 37 gradi centigradi per 16 h con 250 rpm in un'incubatrice di agitazione (E.coli ceppi e vettori sono disponibili su richiesta).
    4. Preriscaldare i flaconi della cultura dell'espressione e i supporti LB a 37 gradi durante la notte in modo che siano preparati per il giorno successivo.
  2. Giorno 2: Espressione proteica
    1. Aggiungere 750 mL di mezzo LB a ogni fiaschetta di coltura di espressione, 375 litri di stock di carbenicill (filtro di 1,22 m) (25 mg/mL in EtOH) e 375 L di acqua di autopur
    2. Dopo l'agitazione per distribuire gli antibiotici, prendere 2 mL del supporto come campione di riferimento per la misurazione della densità ottica a 600 nm (OD600).
    3. Aggiungere 7,5 mL della coltura di partenza al pallone di espressione e incubare per 1 h a 37 gradi centigradi con 250 rpm.
    4. Dopo questo passo il pallone OD600 di ogni fiaschetta verrà controllato ogni 20 min.
    5. Quando la densità ottica raggiunge approssimativamente 0,8 riduce la temperatura a 16 gradi centigradi e induce l'espressione dei peptidi aggiungendo 750 L di 1 M di 1 M di 1 M di 1 M di composto redatta a degrado (IPTg) in acqua ultrapura in ogni fiaschetta di espressione.
    6. Incubare il pallone di espressione con i batteri indotti a 16 gradi centigradi per 16 h con 250 giri/min.
  3. Giorno 3: Estrazione del polipeptide espresso
    1. Pre-pesare la fiaschetta di centrifugazione per consentire la determinazione della massa del pellet cellulare dopo la raccolta.
    2. Raccogliere tutti i batteri dall'espressione flacca dalla centrifuga per 20 min utilizzando una centrifuga pre-raffreddata a 4.000 x g e 4 gradi centigradi.
    3. Versare il supernatante e macchiare le bottiglie di centrifuga su un tovagliolo di carta sterile.
    4. Pesare i flaconi di centrifugazione e calcolare la massa di pellet cellulare.
    5. Risospendere le cellule, che vengono espulse da 750 mL di coltura cellulare originale, in 15 mL di salina con buffer fosfato (PBS, pH 7,4) mediante pipettaggio e centrifuga a 4.000 x g per 20 min a 4 gradi centigradi. Versare il supernatante e macchiare le bottiglie di centrifuga su un tovagliolo di carta sterile.
    6. Risospendere il pellet cellulare per il passaggio di lisi in 2 mL di buffer per 1 grammo di pellet cellulare utilizzando PBS (pH 7.4) integrato con lysozyme (1 mg/mL), 1 mM di fluoruro di phenylmethylsulfonyl (PMSF), 1 mM benzamidine e 0,5 di UNas De I.
    7. Sonicare le cellule per un'ulteriore lisi sul ghiaccio con un sonicatore a 8 W per 9 min con alternanza 10 s s s passi di pausa, seguita da una pausa di 9 min durante la quale il campione deve essere raffreddato sul ghiaccio. Ripetere ancora una volta la fase di sonicazione di 9 min.
    8. Aggiungere 2 mL di 10% (w/v) di polietileneimina (PEI) per 1 L di coltura cellulare originale per le precipitazioni dell'acido nucleico.
    9. Distribuire il campione in tubi di centrifuga di 2 mL e incubare a 60 gradi centigradi per 10 min seguito da un'incubazione per 10 min a 4 gradi centigradi.
    10. Centrifugare la soluzione a 16.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi e raccogliere il supernatale contenente l'ELP.
  4. Purificazione delle proteine tramite ciclo di temperatura inversa:
    1. Regolare il supernatante a un pH di 2 per passare la parte idrofila del peptide all'idrofobico e indurre l'aggregazione. Per regolare il pH, vengono utilizzati acido fosforico e idrossido di sodio. le strisce di pH sono sufficienti per determinare il livello di pH.
    2. Per migliorare la resa della purificazione del campione, riscaldare il campione a 60 gradi centigradi e aggiungere cloruro di sodio fino a 2 M.
    3. Successivamente, centrifugare il campione a 16.000 x g per 10 min a temperatura ambiente (RT).
    4. Scartare il supernatante e ri-dissolvere il pellet in PBS (ma solo la metà del volume iniziale viene utilizzato rispetto al passaggio precedente).
    5. Regolare il pH a 7 con acido fosforico e idrossido di sodio. Le strisce di pH sono sufficientemente accurate per determinare il pH.
    6. Centrifugare il campione successivamente a 16.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
    7. Raccogliere il supernatante e ripetere i passaggi da 1.4.1–1.4.6 fino a 3 volte totale, ad eccezione del fatto che nell'ultima ripetizione del passaggio 1.4.4, viene aggiunta solo acqua anziché PBS.
    8. Misurare la concentrazione dei peptidi con uno spettrometro di assorbimento. Utilizzare un coefficiente di estinzione di 5500/M/cm a 280 nm.
    9. Regolare la concentrazione dell'ELP a 700 M.

2. Produzione di vescicle utilizzando il metodo perline di vetro

  1. Concentrare la soluzione ELP a 1,1 mM utilizzando un concentratore di vuoto centrifugo.
  2. Mescolare 200 l della soluzione eLP concentrata con 1.250 - L di una miscela di cloroformio/metanolo 2:1 seguita da vortice.
  3. Aggiungere 1,5 g di perline di vetro sferico (212-300 m di dimensioni) a una fiaschetta rotonda da 10 mL.
  4. Aggiungere la soluzione contenente ELP e la miscela cloroformio/metanolo al flacone inferiore rotondo e mescolare agitando delicatamente.
  5. Collegare il pallone ad un evaporatore rotante. Regolare la velocità a 150 giri/mm e regolare la pressione a -0,2 x 105 Pa (-200 mbar) per circa 4 min fino a quando il liquido non evapora a temperatura ambiente.
  6. Mettere il flacone rotondo inferiore in un desiccatore per almeno 1 h per garantire che il cloroformio rimanente e il metanolo siano evaporati. Per evitare la perdita delle perline di vetro, la lamina di alluminio vagamente attaccata dovrebbe essere avvolta intorno all'apertura rotonda del pallone inferiore.
  7. Per un singolo esperimento, mescolare 100 mg di perline di vetro ricoperte di peptidi con 60 -L della soluzione di gonfiore, come PBS. Incubare questo campione a 25 gradi centigradi per 5 min.
  8. Centrifugare rapidamente il campione con una centrifuga da tavolo per sedimentare le perline di vetro.
  9. Utilizzare una pipetta per raccogliere il supernatante che contiene le vesciche.

3. Trascrizione di RNA Aptamer dBroccoli all'interno delle vescicoli

  1. Pulire il banco di laboratorio con salviette contenenti la soluzione di decontaminazione RNase per creare un ambiente di lavoro privo di RNase.
  2. Mescolare la ssDNA (5 m) che comprende la sequenza T7 promotore e dBroccoli (GAGACGGTCGGCTCTCTCTGAACGGTCTCTTGTGGGGGCTGATGTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCGGGCGGGCGGGCGGGCTC), nonché il filo di filatura non Buffer di reazione RNAPol [40 mM Tris-HCl (pH - 7,9), 6 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol (DTT) e 2 mM spermidine], per preparare il modello di DNA per la reazione di trascrizione.
  3. Incubare la soluzione a 90 gradi centigradi per 5 min seguita da una lenta diminuzione della temperatura a 20 gradi centigradi per 30 min.
  4. Preparare una soluzione da 1 mM (5m)-5-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2,3-dimethyl-3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one (DFHBI) sciogliendo 1,26 mg di DFHBI in 5 mL di DMSO.
  5. Preparare la reazione di trascrizione mescolando buffer di reazione RNAPol [40 mM Tris-HCl (pH - 7,9), 6 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol (DTT) e 2 mM spermidine] con 125 mM KCl, 15 mM MgCl2, 4 mM rNTP, 10 xM DFHBI, modello di DNA 200 nM, 0,5 U/L RNase murino inibitore, e acqua.
  6. Appena prima dell'inizio della reazione, aggiungere 4 polimerasi T7 U/L.
  7. Utilizzare questa miscela di reazione come soluzione di gonfiore nel passaggio 2.7 e incubare a 37 gradi centigradi per la durata dell'esperimento, che in genere è di 1 h.

4. Trascrizione-traduzione (TX-TL) Reazione

NOT: Per la reazione trascrizione-traduzione, è necessario un estratto di cellule grezze, così come buffer di reazione e DNA. L'estratto di cellule grezze è preparato come descritto in Sun et al.18. Per una reazione TX-TL, utilizzare quanto segue: 33% (v/v) dell'estratto di E. coli grezzo, 42% (v/v) e 25% (v/v) di DNA purificato con fenolo-cloro più additivi. Le concentrazioni finali sono di circa 9 mg/mL di proteine, 50 m HEPES (pH - 8), 1,5 mMa ATP, 1,5 m MM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 26 mM coenzima A, 0,33 mM NAD, 0,75 mM cAMP, 68 mM di acido folinico, 1 mM sper , 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000, 13,3 mM di maltosi, 1 U di polimerasi di RNA T7 e 50 nM dna plasmid in acqua ultrapura.

  1. Purificazione del fenolo-cloroformio del modello di DNA
    1. Preparare sei colture notturne con 5 mL di lB medium e 5 L L di soluzione carbenicillina filtrata sterile (filtro 0,22 m) (100 mg/mL nel 50% EtOH e 50% di acqua ultrapura).
    2. Aggiungete una piccola striscia da uno stock batterico prefabbricato contenente DH5- E. coli con il vettore di espressione pET20b () a ogni coltura notturna preriscaldata di 5 mL e incubate a 37 gradi centigradi per 16 h con 250 rpm. A seconda di quale peptide (EF) o proteina (YPet o mVenus) deve essere espresso, viene utilizzato un plasmide di codifica specifico.
    3. Estrarre il plasmide con un mini-prekit come descritto nel manuale dell'utenteo seguendo il protocollo fornito da .
    4. Preparare 100 l del DNA plasmide pre-purificato (la concentrazione può variare da 200-600 ng/L) e mescolare con 100 gradi di alcool Roti-phenol/cloroforma/isoamila (pH - 7,5–8,0) in un tubo di microfusio per consentire una migliore separazione di fase.
    5. Invertire delicatamente il tubo fino a 6x e centrifugare per 5 min a 16.000 x g a RT.
    6. Aggiungere 200 l di cloroformio alla fase superiore del tubo e invertire il tubo fino a 6x.
    7. Centrifugare il campione a 16.000 x g per 5 min a RT.
    8. Convogliare il supernatante in un tubo separato e aggiungere 10-L di 3 M di acetato di sodio per la precipitazione dell'etanolo.
    9. Aggiungete 1 mL di -80 gradi centigradi di etanolo freddo e conservate il campione a -80 gradi per 1 h.
    10. Centrifugare il campione a 16.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi.
    11. Decant il supernatante e aggiungere 1 mL di -20 C freddo 70% (v/v) etanolo.
    12. Centrifuga a 16.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
    13. Rimuovere il liquido pipettando. Fare attenzione a non disturbare il pellet di DNA.
    14. Conservare il campione a RT per circa 15 minuti per far evaporare l'etanolo rimanente.
    15. Aggiungere acqua ultrapura al campione per regolare la concentrazione del campione a circa 300 nM, che viene misurata mediante assorbimento a 260 nm.
  2. Preparazione della reazione TX-TL
    1. Scongelare l'estratto di cellule grezze preparato e il buffer di reazione sul ghiaccio.
    2. Per un mix di reazione a 60 aggiungere il DNA plasmide (fenolo-cloroformato) a 37,5 litri del buffer di reazione [50 mHeE (pH - 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 m CTP, 0,9 m UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 26 mM coenzyme A, 0,33 m NAD , 0,75 mM cAMP, 68 mM di acido folinico, 1 mM di spermide, 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000 e 13,3 mM di maltosio), seguiti dall'aggiunta di 28,7 dollari di estratto di cellule grezze. Riempire fino a raggiungere un volume finale con acqua ultrapura fino a 58,8 l.
    3. Subito prima dell'inizio della reazione, aggiungere 1,2 l della soluzione di polimerasi t7 RNA e mescolare il campione pipetting su e giù.
    4. Utilizzare questa miscela di reazione come soluzione di gonfiore nel passaggio 2.7 e incubare a 29 gradi centigradi per la durata dell'esperimento, che in genere è 4-8 h.

5. Coniugazione di polipeptidi simili a Elastina con fluorofori tramite Rame Catalyzed Azide-alkyne Huisgen Cycloaddition

  1. Preparare una soluzione di collegamento al linker N-idordobutyric da 20 mM (acido azidobutyric N-idrossisuccinimide) in DMSO.
  2. Mescolare 250 l della soluzione ELP (600 m) con PBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,42 g/L Na2HPO4, 0,27 g/LK 2HPO4, pH e 7,2) e NHS-azide (1,2 mM) e incubare per 12 h a RT.
  3. Caricare il campione in una cassetta di dialisi da 10 kDa e conservarlo a 4 gradi centigradi per 12 h in 1 L di acqua ultrapura per rimuovere i sali e l'azide residua NHS.
  4. Mescolare l'ELP attivato (500 m) con la tintura coniugata alkyne (500 m), Cy5-alkyne o Cy3-alkyne.
  5. Mescolare questo esempio con 1 mM TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine), 10 mM TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrocloride e 10 mM CuSO4 e incubare a 4 gradi centigradi per 12 h.
  6. Caricare il campione in una cassetta di dialisi da 10 kDa e conservarlo a 4 gradi centigradi per 12 h in 1 L di acqua ultrapura, per rimuovere i sali e le coloranti residui e riuniti alkyne.
  7. Questi ELP modificati con coloranti sono utilizzati in una miscela 1:1 degli ELP etichettati Cy3 e degli ELP con etichetta Cy5 analoghi ai peptidi nella seconda parte.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Produzione di vescicle
La figura 1 mostra immagini di microscopia elettronica a trasmissione (TEM) di vesciche preparate con diverse soluzioni di gonfiore e il metodo delle perline di vetro (vedi anche Vogele et al.11). Per il campione nella figura 1A,solo PBS è stato utilizzato come soluzione di gonfiore per dimostrare la formazione di vesciche e per determinarne le dimensioni. Quando TX-TL è stato utilizzato come sol...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

La reidratazione delle pellicole è una procedura comune per la creazione di piccole vesciche unilamellar. La principale fonte di guasto è la gestione errata dei materiali utilizzati nella procedura.

Inizialmente, gli ELP sono prodotti dalle cellule E. coli. La resa dopo la purificazione dell'ELP può variare in modo significativo a seconda di quanto attentamente il protocollo viene condotto durante i suoi passi crucial...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario attraverso il DFG TRR 235 (Emergence of Life, progetto P15), il Consiglio europeo della ricerca (accordo di sovvenzione n. 694410 AEDNA) e la TUM International Graduate School for Science and Engineering IGSSE (progetto n. 9.05) . Ringraziamo E. Falgenhauer per il suo aiuto con la preparazione del campione. Ringraziamo A. Dupin e M. Schwarz-Schilling per il loro aiuto con il sistema TX-TL e discussioni utili. Ringraziamo N. B. Holland per discussioni utili.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2xYTMP biomedicals3012-032
3-PGASigma-AldrichP8877
5PRIME Phase Lock GelTM tuboVWR733-2478
Cy3 coniugato con alchiniSigma-Aldrich777331
Cy5 coniugato con alchine777358
ATPSigma-AldrichA8937
BenzamidinCarl RothCN38.2
BL21 Rosetta 2 E. coli ceppoNovagen71402
Bradford BSA Protein Assay KitBio-rad500-0201
cAMPSigma-AldrichA9501
Carbenicillin CarlRoth6344.2
CloramfenicoloSigma-AldrichC1919
CloramfenicoloCarl Roth3886.3
CloroformioCarl Roth4432.1
CoASigma-AldrichC4282
CTPUSB14121
CuSO4Carl RothP024.1
DFHBILucerna Technologies410
DMSOCarl RothA994.1
DNase INEBM0303S
DTTSigma-AldrichD0632
EtanoloCarl Roth9065.2
Acido folinicoSigma-AldrichF7878
Perle di vetro, lavate con acidoSigma-AldrichG1277
GTPUSB16800
HEPESSigma-AldrichH6147
IPTG (β-isopropil tiogalattoside)Sigma-AldrichI6758
KClCarl RothP017.1
K-glutammatoSigma-AldrichG1149
LB BrodoCarl RothX968.2
LisozimaSigma-AldrichL6876
MetanoloCarl Roth82,2
MgCl2Carl RothKK36,3
Mg-glutammatoSigma-Aldrich49605
Colonne per cromatografia Micro Bio-SpinBio-Rad732-6204
NADSigma-AldrichN6522
Linker NHS-azide (estere ossisuccinimide dell'acido y-azidobutirrico)BaseclickBCL-033-5
PEG-8000Carl Roth263.2
Strisce pHCarl Roth549.2
Fenilmetilsulfonile fluoruroCarl Roth6367.2
Soluzione salina tamponata con fosfatoVWR76180-684
AcidofosforicoSigma-AldrichW290017
PolietilenimminaSigma-Aldrich408727
Soluzione bibasica di fosfato di potassioSigma-AldrichP8584
Soluzione monobasica di fosfato di potassioSigma-AldrichP8709
Qiagen Miniprep KitQiagen27106
Tampone di reazione RNAPolNEBB9012
Inibitore della RNasi murinoNEBM0314S
RNaseZap SalvietteThermoFisherAM9788
rNTPNEBN0466S
Roti-fenolo/cloroformio/alcol isoamilicoCarlrothA156.1
RTS Campionatore di aminoacidi 52401530
Slide-A-Lyzer Cassette per dialisi, 10k MWCO (Kit)Thermo-Scientific66382
Cloruro di sodioCarl Roth9265.1
Idrossido di sodioCarl Roth8655.1
SpermidinaSigma-Aldrich85558
Filtrato sterile (0,22 µ CarlRothXH76.1
T7 polimerasiNEBM0251S
TBTA (tris(benziltriazolilmetil)ammina)Sigma-Aldrich678937
TCEP (tris(2-carbossietil)-fosfina cloridrato)Sigma-AldrichC4706
Tris baseFischerBP1521
tRNA (da E. coli)Roche Applicato ScienzaMRE600
UTPUSB23160
Prime

Riferimenti

  1. Chen, I. A., Szostak, J. W. A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles. Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).
  2. Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).
  3. Hardy, M. D., et al. Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).
  4. Scott, A., et al. Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes. PLoS ONE. 11 (10), e0163058(2016).
  5. Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions. Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).
  6. Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells. Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).
  7. Zhu, T. F., Szostak, J. W. Coupled growth and division of model protocell membranes. Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).
  8. Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).
  9. Chu, H. -S., et al. Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system. Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).
  10. Martino, C., et al. Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures. Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).
  11. Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862(2018).
  12. Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
  13. McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).
  14. Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).
  15. Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
  16. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
  17. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).
  18. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).
  19. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  20. Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., Mückl, A., Simmel, F. C. Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets. Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).
  21. Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).
  22. Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).
  23. Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
  24. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247(2007).
  25. Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Vescicole peptidicheespressione di ELPformazione di vescicoledisidratazione-reidratazionemetodo delle sferette di vetroscattering dinamico della lucelettore di piastre a fluorescenzasaggio FRETtrascrizione dell'RNA
In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursori per la crescita autonoma della vescicola
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.