In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursori per la crescita autonoma della vescicola

La creazione di sistemi cellulari viventi sintetici è di solito avvicinata da due direzioni diverse. Nel metodo top-down, il genoma di un batterio è ridotto ai suoi componenti essenziali, portando in ultima analisi ad una cellula minima. Nell'approccio bottom-up, le cellule artificiali sono assemblate de novo da componenti molecolari o sottosistemi cellulari, che devono essere integrati funzionalmente in un sistema coerente simile a una cellula.

Nell'approccio de novo, la compartimentazione dei componenti biochimici necessari è solitamente ottenuta utilizzando membrane a base di fosfolipidi o acidi grassi^1,2,3^,4. Questo perché le membrane cellulari "moderne" sono costituite principalmente da fosfolipidi, mentre gli acidi grassi sono considerati candidati plausibili di recinti di membrana prebiotica^5,6. Per la formazione di nuove membrane o per facilitare la crescita della membrana, gli elementi costitutivi anfilici devono essere forniti dall'esterno⁷ o idealmente attraverso la produzione all'interno di un vano membranoutilizzando utilizzando i corrispondenti processi anabolizzanti^{4 ,8}.

Mentre la sintesi dei lipidi è un processo metabolico relativamente complesso, i peptidi possono essere prodotti abbastanza facilmente utilizzando reazioni di espressione genica prive di cellule^9,10. Quindi, le membrane peptidiche formate da peptidi anfifile rappresentano un'interessante alternativa alle membrane lipidiche come recinti per imitazioni cellulari artificiali che sono in grado di crescere¹¹.

I copolimeri anfifici simili all'elastina (ELP) sono una classe attraente di peptidi, che può fungere da elemento costitutivo per tali membrane¹². Il motivo di base della sequenza di amminoacidi di ELPs è (GaGVP)_n, dove "a" può essere qualsiasi aminoacido ad eccezione della prolina e "n" è il numero di ripetizioni motif^{13,14,15,16,17} . ELP sono stati creati con un blocco idrofobico contenente principalmente fenilalanina per un e un blocco idrofilo composto principalmente da acido glutammico¹¹. A seconda dei parametri di una e soluzione, come la concentrazione di pH e sale, gli ELP presentano una cosiddetta transizione di temperatura inversa alla temperatura T_t, dove i peptidi subiscono una transizione di fase completamente reversibile da un idrofilo all'idrofobico stato. La sintesi dei peptidi può essere facilmente implementata all'interno di vesciche utilizzando l'estratto di cellule batteriche "TX-TL"^{11,18,19,20,21}, che fornisce tutti i componenti necessari per le reazioni di trascrizione e traduzione accoppiate.

Il sistema TX-TL è stato incapsulato insieme, con il modello di DNA che codifica gli ELP nelle vescicoli ELP utilizzando la reidratazione-reidratazione dalle perline di vetro come supporto solido. La formazione di vescicle avviene attraverso la reidratazione dei peptidi secchi dalla superficie del tallone¹¹. Possono essere utilizzati altri metodi²² per la formazione di vescicoli, che potenzialmente mostrano una minore polidispersione e dimensioni vesciche più grandi (ad esempio, elettro-formazione, trasferimento di fase di emulsione o metodi basati sulla microfluidica). Per testare la fattibilità del metodo di incapsulamento, la trascrizione dell'aptamer fluorogenico dBroccoli²³ può essere utilizzata in alternativa¹¹, che è meno complessa dell'espressione genica con il sistema TX-TL.

A causa dell'espressione dei mattoni della membrana in vesiculo e la loro successiva incorporazione nella membrana, le vesciche iniziano a crescere¹¹. L'incorporazione di membrane degli ELP può essere dimostrata attraverso un saggio FRET. A tal fine, gli ELP utilizzati per la formazione della popolazione vescicana iniziale sono coniugati con coloranti fluorescenti in parti uguali che costizzano una coppia FRET. Dopo l'espressione di ELP non etichettati in vesiculo e la loro incorporazione nella membrana, gli ELP etichettati nella membrana vengono diluiti e di conseguenza il segnale FRET diminuisce^{di 11}. Come metodo versatile e comune per la coniugazione, viene utilizzato la cicloaddition azide-alkyne catalizzata in rame. Con l'uso di un legamento stabilizzante come tris(benzyltriazolylmethyl)-ammine, la reazione può essere effettuata in una soluzione acquosa a un pH fisiologico senza l'idrolisi dei reanti¹¹, che è appropriato per le reazioni di coniugazione peptidi.

Il seguente protocollo presenta una descrizione dettagliata della preparazione per i peptidosos a base di ELP. Viene descritta l'espressione dei peptidi e della formazione di velecle utilizzando il metodo delle perline di vetro. Inoltre, viene descritto come implementare la trascrizione dell'aptamer fluorogenico dBroccoli e la reazione trascrizione-traduzione per l'espressione proteica all'interno delle vesciche ELP. Infine, è fornita una procedura per la coniugazione di ELP con fluorofori, che può essere utilizzato per dimostrare la crescita vescicale attraverso un analisi FRET¹¹.

1. Espressione di Polipeptidi simili a Elastin

1. Giorno 1: Preparazione di una coltura di avviamento e forniture per l'espressione peptide
   1. Preparare e autoclave espressione coltura flaastri (4 x 2.5 L) e 3 L di lB medio. Per 1 L di LB medio, aggiungere 25 g di LB in polvere a 1 L di acqua ultrapura.
   2. Preparare una coltura di avviamento con una soluzione di clorramphenico di 100 mL di un lB medio, 50 -L di filtro sterile (filtro 0,22 m) (25 mg/mL in EtOH) e 50 lun di filtro sterile (filtro da 0,22 m) soluzione di carcillina (100 mg/mL in 50% EtOH e 50% di acqua ultrapura).
   3. Aggiungere una piccola striscia da un stock batterico pre-fatto contenente ceppo E. coli BL21(DE3)pLysS con il vettore di espressione pET20b() codificando la sequenza polipeptide MGHGVGVP((GEGVP)₄(GVGVP))₄((GFGVP)₄(GVGVP))₃ (GFGVP)₄GWP (abbreviato come EF) a una coltura di avviamento preriscaldata di 100 mL e incubare a 37 gradi centigradi per 16 h con 250 rpm in un'incubatrice di agitazione (E.coli ceppi e vettori sono disponibili su richiesta).
   4. Preriscaldare i flaconi della cultura dell'espressione e i supporti LB a 37 gradi durante la notte in modo che siano preparati per il giorno successivo.
2. Giorno 2: Espressione proteica
   1. Aggiungere 750 mL di mezzo LB a ogni fiaschetta di coltura di espressione, 375 litri di stock di carbenicill (filtro di 1,22 m) (25 mg/mL in EtOH) e 375 L di acqua di autopur
   2. Dopo l'agitazione per distribuire gli antibiotici, prendere 2 mL del supporto come campione di riferimento per la misurazione della densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀).
   3. Aggiungere 7,5 mL della coltura di partenza al pallone di espressione e incubare per 1 h a 37 gradi centigradi con 250 rpm.
   4. Dopo questo passo il pallone OD₆₀₀ di ogni fiaschetta verrà controllato ogni 20 min.
   5. Quando la densità ottica raggiunge approssimativamente 0,8 riduce la temperatura a 16 gradi centigradi e induce l'espressione dei peptidi aggiungendo 750 L di 1 M di 1 M di 1 M di 1 M di composto redatta a degrado (IPTg) in acqua ultrapura in ogni fiaschetta di espressione.
   6. Incubare il pallone di espressione con i batteri indotti a 16 gradi centigradi per 16 h con 250 giri/min.
3. Giorno 3: Estrazione del polipeptide espresso
   1. Pre-pesare la fiaschetta di centrifugazione per consentire la determinazione della massa del pellet cellulare dopo la raccolta.
   2. Raccogliere tutti i batteri dall'espressione flacca dalla centrifuga per 20 min utilizzando una centrifuga pre-raffreddata a 4.000 x g e 4 gradi centigradi.
   3. Versare il supernatante e macchiare le bottiglie di centrifuga su un tovagliolo di carta sterile.
   4. Pesare i flaconi di centrifugazione e calcolare la massa di pellet cellulare.
   5. Risospendere le cellule, che vengono espulse da 750 mL di coltura cellulare originale, in 15 mL di salina con buffer fosfato (PBS, pH 7,4) mediante pipettaggio e centrifuga a 4.000 x g per 20 min a 4 gradi centigradi. Versare il supernatante e macchiare le bottiglie di centrifuga su un tovagliolo di carta sterile.
   6. Risospendere il pellet cellulare per il passaggio di lisi in 2 mL di buffer per 1 grammo di pellet cellulare utilizzando PBS (pH 7.4) integrato con lysozyme (1 mg/mL), 1 mM di fluoruro di phenylmethylsulfonyl (PMSF), 1 mM benzamidine e 0,5 di UNas De I.
   7. Sonicare le cellule per un'ulteriore lisi sul ghiaccio con un sonicatore a 8 W per 9 min con alternanza 10 s s s passi di pausa, seguita da una pausa di 9 min durante la quale il campione deve essere raffreddato sul ghiaccio. Ripetere ancora una volta la fase di sonicazione di 9 min.
   8. Aggiungere 2 mL di 10% (w/v) di polietileneimina (PEI) per 1 L di coltura cellulare originale per le precipitazioni dell'acido nucleico.
   9. Distribuire il campione in tubi di centrifuga di 2 mL e incubare a 60 gradi centigradi per 10 min seguito da un'incubazione per 10 min a 4 gradi centigradi.
   10. Centrifugare la soluzione a 16.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi e raccogliere il supernatale contenente l'ELP.
4. Purificazione delle proteine tramite ciclo di temperatura inversa:
   1. Regolare il supernatante a un pH di 2 per passare la parte idrofila del peptide all'idrofobico e indurre l'aggregazione. Per regolare il pH, vengono utilizzati acido fosforico e idrossido di sodio. le strisce di pH sono sufficienti per determinare il livello di pH.
   2. Per migliorare la resa della purificazione del campione, riscaldare il campione a 60 gradi centigradi e aggiungere cloruro di sodio fino a 2 M.
   3. Successivamente, centrifugare il campione a 16.000 x g per 10 min a temperatura ambiente (RT).
   4. Scartare il supernatante e ri-dissolvere il pellet in PBS (ma solo la metà del volume iniziale viene utilizzato rispetto al passaggio precedente).
   5. Regolare il pH a 7 con acido fosforico e idrossido di sodio. Le strisce di pH sono sufficientemente accurate per determinare il pH.
   6. Centrifugare il campione successivamente a 16.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
   7. Raccogliere il supernatante e ripetere i passaggi da 1.4.1–1.4.6 fino a 3 volte totale, ad eccezione del fatto che nell'ultima ripetizione del passaggio 1.4.4, viene aggiunta solo acqua anziché PBS.
   8. Misurare la concentrazione dei peptidi con uno spettrometro di assorbimento. Utilizzare un coefficiente di estinzione di 5500/M/cm a 280 nm.
   9. Regolare la concentrazione dell'ELP a 700 M.

2. Produzione di vescicle utilizzando il metodo perline di vetro

1. Concentrare la soluzione ELP a 1,1 mM utilizzando un concentratore di vuoto centrifugo.
2. Mescolare 200 l della soluzione eLP concentrata con 1.250 - L di una miscela di cloroformio/metanolo 2:1 seguita da vortice.
3. Aggiungere 1,5 g di perline di vetro sferico (212-300 m di dimensioni) a una fiaschetta rotonda da 10 mL.
4. Aggiungere la soluzione contenente ELP e la miscela cloroformio/metanolo al flacone inferiore rotondo e mescolare agitando delicatamente.
5. Collegare il pallone ad un evaporatore rotante. Regolare la velocità a 150 giri/mm e regolare la pressione a -0,2 x 10⁵ Pa (-200 mbar) per circa 4 min fino a quando il liquido non evapora a temperatura ambiente.
6. Mettere il flacone rotondo inferiore in un desiccatore per almeno 1 h per garantire che il cloroformio rimanente e il metanolo siano evaporati. Per evitare la perdita delle perline di vetro, la lamina di alluminio vagamente attaccata dovrebbe essere avvolta intorno all'apertura rotonda del pallone inferiore.
7. Per un singolo esperimento, mescolare 100 mg di perline di vetro ricoperte di peptidi con 60 -L della soluzione di gonfiore, come PBS. Incubare questo campione a 25 gradi centigradi per 5 min.
8. Centrifugare rapidamente il campione con una centrifuga da tavolo per sedimentare le perline di vetro.
9. Utilizzare una pipetta per raccogliere il supernatante che contiene le vesciche.

3. Trascrizione di RNA Aptamer dBroccoli all'interno delle vescicoli

1. Pulire il banco di laboratorio con salviette contenenti la soluzione di decontaminazione RNase per creare un ambiente di lavoro privo di RNase.
2. Mescolare la ssDNA (5 m) che comprende la sequenza T7 promotore e dBroccoli (GAGACGGTCGGCTCTCTCTGAACGGTCTCTTGTGGGGGCTGATGTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCGGGCGGGCGGGCGGGCTC), nonché il filo di filatura non Buffer di reazione RNAPol [40 mM Tris-HCl (pH - 7,9), 6 mM MgCl₂, 1 mM dithiothreitol (DTT) e 2 mM spermidine], per preparare il modello di DNA per la reazione di trascrizione.
3. Incubare la soluzione a 90 gradi centigradi per 5 min seguita da una lenta diminuzione della temperatura a 20 gradi centigradi per 30 min.
4. Preparare una soluzione da 1 mM (5m)-5-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2,3-dimethyl-3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one (DFHBI) sciogliendo 1,26 mg di DFHBI in 5 mL di DMSO.
5. Preparare la reazione di trascrizione mescolando buffer di reazione RNAPol [40 mM Tris-HCl (pH - 7,9), 6 mM MgCl₂, 1 mM dithiothreitol (DTT) e 2 mM spermidine] con 125 mM KCl, 15 mM MgCl₂, 4 mM rNTP, 10 xM DFHBI, modello di DNA 200 nM, 0,5 U/L RNase murino inibitore, e acqua.
6. Appena prima dell'inizio della reazione, aggiungere 4 polimerasi T7 U/L.
7. Utilizzare questa miscela di reazione come soluzione di gonfiore nel passaggio 2.7 e incubare a 37 gradi centigradi per la durata dell'esperimento, che in genere è di 1 h.

4. Trascrizione-traduzione (TX-TL) Reazione

NOT: Per la reazione trascrizione-traduzione, è necessario un estratto di cellule grezze, così come buffer di reazione e DNA. L'estratto di cellule grezze è preparato come descritto in Sun et al.¹⁸. Per una reazione TX-TL, utilizzare quanto segue: 33% (v/v) dell'estratto di E. coli grezzo, 42% (v/v) e 25% (v/v) di DNA purificato con fenolo-cloro più additivi. Le concentrazioni finali sono di circa 9 mg/mL di proteine, 50 m HEPES (pH - 8), 1,5 mMa ATP, 1,5 m MM GTP, 0,9 mM CTP, 0,9 mM UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 26 mM coenzima A, 0,33 mM NAD, 0,75 mM cAMP, 68 mM di acido folinico, 1 mM sper , 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000, 13,3 mM di maltosi, 1 U di polimerasi di RNA T7 e 50 nM dna plasmid in acqua ultrapura.

1. Purificazione del fenolo-cloroformio del modello di DNA
   1. Preparare sei colture notturne con 5 mL di lB medium e 5 L L di soluzione carbenicillina filtrata sterile (filtro 0,22 m) (100 mg/mL nel 50% EtOH e 50% di acqua ultrapura).
   2. Aggiungete una piccola striscia da uno stock batterico prefabbricato contenente DH5- E. coli con il vettore di espressione pET20b () a ogni coltura notturna preriscaldata di 5 mL e incubate a 37 gradi centigradi per 16 h con 250 rpm. A seconda di quale peptide (EF) o proteina (YPet o mVenus) deve essere espresso, viene utilizzato un plasmide di codifica specifico.
   3. Estrarre il plasmide con un mini-prekit come descritto nel manuale dell'utenteo seguendo il protocollo fornito da .
   4. Preparare 100 l del DNA plasmide pre-purificato (la concentrazione può variare da 200-600 ng/L) e mescolare con 100 gradi di alcool Roti-phenol/cloroforma/isoamila (pH - 7,5–8,0) in un tubo di microfusio per consentire una migliore separazione di fase.
   5. Invertire delicatamente il tubo fino a 6x e centrifugare per 5 min a 16.000 x g a RT.
   6. Aggiungere 200 l di cloroformio alla fase superiore del tubo e invertire il tubo fino a 6x.
   7. Centrifugare il campione a 16.000 x g per 5 min a RT.
   8. Convogliare il supernatante in un tubo separato e aggiungere 10-L di 3 M di acetato di sodio per la precipitazione dell'etanolo.
   9. Aggiungete 1 mL di -80 gradi centigradi di etanolo freddo e conservate il campione a -80 gradi per 1 h.
   10. Centrifugare il campione a 16.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi.
   11. Decant il supernatante e aggiungere 1 mL di -20 C freddo 70% (v/v) etanolo.
   12. Centrifuga a 16.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
   13. Rimuovere il liquido pipettando. Fare attenzione a non disturbare il pellet di DNA.
   14. Conservare il campione a RT per circa 15 minuti per far evaporare l'etanolo rimanente.
   15. Aggiungere acqua ultrapura al campione per regolare la concentrazione del campione a circa 300 nM, che viene misurata mediante assorbimento a 260 nm.
2. Preparazione della reazione TX-TL
   1. Scongelare l'estratto di cellule grezze preparato e il buffer di reazione sul ghiaccio.
   2. Per un mix di reazione a 60 aggiungere il DNA plasmide (fenolo-cloroformato) a 37,5 litri del buffer di reazione [50 mHeE (pH - 8), 1,5 mM ATP, 1,5 mM GTP, 0,9 m CTP, 0,9 m UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 26 mM coenzyme A, 0,33 m NAD , 0,75 mM cAMP, 68 mM di acido folinico, 1 mM di spermide, 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000 e 13,3 mM di maltosio), seguiti dall'aggiunta di 28,7 dollari di estratto di cellule grezze. Riempire fino a raggiungere un volume finale con acqua ultrapura fino a 58,8 l.
   3. Subito prima dell'inizio della reazione, aggiungere 1,2 l della soluzione di polimerasi t7 RNA e mescolare il campione pipetting su e giù.
   4. Utilizzare questa miscela di reazione come soluzione di gonfiore nel passaggio 2.7 e incubare a 29 gradi centigradi per la durata dell'esperimento, che in genere è 4-8 h.

5. Coniugazione di polipeptidi simili a Elastina con fluorofori tramite Rame Catalyzed Azide-alkyne Huisgen Cycloaddition

1. Preparare una soluzione di collegamento al linker N-idordobutyric da 20 mM (acido azidobutyric N-idrossisuccinimide) in DMSO.
2. Mescolare 250 l della soluzione ELP (600 m) con PBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,42 g/L Na₂HPO₄, 0,27 g/L_{K 2}HPO₄, pH e 7,2) e NHS-azide (1,2 mM) e incubare per 12 h a RT.
3. Caricare il campione in una cassetta di dialisi da 10 kDa e conservarlo a 4 gradi centigradi per 12 h in 1 L di acqua ultrapura per rimuovere i sali e l'azide residua NHS.
4. Mescolare l'ELP attivato (500 m) con la tintura coniugata alkyne (500 m), Cy5-alkyne o Cy3-alkyne.
5. Mescolare questo esempio con 1 mM TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine), 10 mM TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrocloride e 10 mM CuSO₄ e incubare a 4 gradi centigradi per 12 h.
6. Caricare il campione in una cassetta di dialisi da 10 kDa e conservarlo a 4 gradi centigradi per 12 h in 1 L di acqua ultrapura, per rimuovere i sali e le coloranti residui e riuniti alkyne.
7. Questi ELP modificati con coloranti sono utilizzati in una miscela 1:1 degli ELP etichettati Cy3 e degli ELP con etichetta Cy5 analoghi ai peptidi nella seconda parte.

Produzione di vescicle
La figura 1 mostra immagini di microscopia elettronica a trasmissione (TEM) di vesciche preparate con diverse soluzioni di gonfiore e il metodo delle perline di vetro (vedi anche Vogele et al.11). Per il campione nella figura 1A,solo PBS è stato utilizzato come soluzione di gonfiore per dimostrare la formazione di vesciche e per determinarne le dimensioni. Quando TX-TL è stato utilizzato come soluzione di gonfiore (Figura 1B), si sono formate anche le vesciche. Sono state eseguite misurazioni dLS (Dynamic Light Scattering) per dimostrare che il metodo delle perline di vetro ha un effetto sulla formazione delle vesciche. Figura 2 illustra le curve di autocorrelazione di intensità misurata di un campione eF preparato senza perline di vetro in PBS (blu) e un campione EF preparato con il metodo perline di vetro con PBS come soluzione di gonfiore (rosso). Le dimensioni sono state calcolate da un cumulante fit25 e hanno portato ad un diametro di 134 nm con una polidispersità del 25% quando le vesciche sono state preparate senza il metodo delle perline di vetro. Quando sono state utilizzate le perle di vetro, l'adattamento cumulante ha provocato un diametro di 168 nm con una polidispersità del 21%.

In trascrizione vesiculo 11 Del sistema di
La figura 3 mostra il profilo di intensità di fluorescenza nel tempo per la trascrizione dell'aptamero dBroccoli all'interno delle vescibole EF (verde). Come controllo negativo, DNase Sono stato aggiunto alla soluzione di gonfiore e quindi incorporato anche durante la formazione di vescicoli (blu). Le misurazioni sono state eseguite in lettore di lastre di fluorescenza con eccitazione a 480 nm ed emissione a 520 nm.

Nell'espressione delle proteine vesiculo 11 Del sistema di
La figura 4 mostra l'intensità di fluorescenza di due proteine fluorescenti che sono state espresse all'interno delle vesciche ELP utilizzando un lettore di piastra di fluorescenza. L'eccitazione è stata effettuata 500 nm ed emissione a 520 nm. La trascrizione-traduzione di mVenus (Figura 4A) è stata eseguita per studiare la dinamica di espressione e il livello di espressione delle proteine nella vescica ELP. È importante notare che dopo la formazione delle vesciche, il contenuto delle vesciche e la soluzione esterna sono gli stessi. Quindi, per sopprimere l'espressione proteica al di fuori della vescica, la kanamicicina antibiotica è stata aggiunta alla soluzione esterna. Come controllo, la kanamicicina è stata aggiunta anche alla soluzione di gonfiore, nel qual caso l'espressione della proteina all'interno della vescica è stata soppressa. Questo indica inoltre che la piccola molecola kanamicia rimane all'interno della vescica e suggerisce che la membrana non è permeabile per questa molecola nella scala temporale di questi esperimenti. Se la kanamicicina si diffondesse attraverso la membrana, l'espressione mVenus non sarebbe stata soppressa e a 5 h, la fluorescenza sarebbe più alta. Nel secondo esperimento è stata eseguita l'espressione di YPet (Figura 4B). Entrambe le proteine sono state scelte perché presentano un tempo di maturazione più veloce rispetto, ad esempio, alla GFP. Inoltre, il promotore T7 è stato utilizzato per la trascrizione mVenus e un promotore di proprietà utilizzato per la trascrizione YPet per dimostrare che sia l'espressione inducibile che continua sono possibili.

Assay FRET 11 Del sistema di
La figura 5A mostra i risultati del test FRET eseguito per dimostrare l'incorporazione dell'ELP nella membrana. Pertanto, le vesciche sono state prodotte utilizzando una miscela di due costrutti fluoroforo-peptide ugualmente concentrati. Si trattava di Cy3-EF (donatore) e Cy5-EF (accettatore). Al momento del tempo t - 0, è stato misurato il livello FRET iniziale. I segnali del donatore e del segnale FRET dipendono dalla distanza media tra i coloranti nella membrana. Dopo l'espressione degli ELP della membrana, i peptidi aggiuntivi incorporano nella membrana, il che aumenta la distanza media tra le coppie FRET. Quest'ultimo è stato misurato attraverso l'aumento della fluorescenza del donatore e una diminuzione del segnale FRET al momento t - 2,5 h. Figura 5B mostra il controllo negativo. Qui, la kanamycin è stata aggiunta alla soluzione di gonfiore prima della formazione di vescicoli. La kanamicinea sopprime l'espressione proteica; pertanto, nessun cambiamento in FRET era visibile. È importante notare che questo saggio mostra solo l'incorporazione di EF.

Figura 1: Rappresentativo delle immagini TEM. (A) Vescicle EF formate nella soluzione di gonfiore PBS. (B) Vesciche EF formate nella soluzione di gonfiore TX-TL. Barre della scala 200 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Dati DLS rappresentativi. Curve di autocorrelazione di intensità misurate da DLS. La curva blu raffigura peptidi EF in PBS preparati senza il metodo perline di vetro. La curva rossa raffigura una soluzione EF prodotta con il metodo di perline di vetro e PBS come soluzione di gonfiore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: trascrizione dBroccoli. Dati rappresentativi della trascrizione dell'aptamer dBroccoli all'interno delle vesciche EF. La curva verde raffigura il segnale di fluorescenza e la curva blu la misura di controllo con incapsulato DNase I. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Espressione proteica all'interno delle vesciche dei peptidi. (A) Un plasmide di codifica mVenus e il mix di espressioni TX-TL sono stati incapsulati nelle vesciche ELP. Dopo circa 5 h, la fluorescenza si saturò. Quando è stata incapsulata anche la kanamicinecina antibiotica, non è stata osservata fluorescenza. (B) Risultati analoghi sono stati ottenuti dopo l'incapsulamento di un plasmide YPet. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard dei valori misurati nel tempo indicato durante un intervallo di tempo di 15 min. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figura 5: esempio FRET. (A) Avvio dei livelli di fluorescenza al momento t - 0 per le emissioni dei donatori e il segnale FRET (emissione di accettazione). A 2,5 h, il donatore ha mostrato un aumento delle emissioni e il segnale FRET è diminuito. (B) Quando solo l'ELP idrofilo erano espressi all'interno delle vesciche, il segnale FRET e l'emissione del donatore rimanevano costanti. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard dei valori misurati nel tempo indicato durante un intervallo di tempo di 15 min. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

File supplementare: Contiene tutte le sequenze di plasmide sequenze geniche resp. Fare clic qui per scaricare questo file.

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.