In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursori per la crescita autonoma della vescicola

Sommario

Qui sono presentati protocolli per la creazione di piccole vescibole unilamellar a base di peptidi in grado di crescere. Per facilitare la produzione vesiculo del peptide della membrana, queste vesciche sono dotate di un sistema di traduzione della trascrizione e del plasmide di codifica dei peptidi.

Abstract

La compartimentazione delle reazioni biochimiche è un aspetto centrale delle cellule sintetiche. A questo scopo, i compartimenti di reazione basati su peptidi servono come alternativa attraente ai liposomi o alle vesciche a base di acidi grassi. Esternamente o all'interno delle vesciche, i peptidi possono essere facilmente espressi e semplificare la sintesi dei precursori della membrana. Fornito qui è un protocollo per la creazione di vesciche con diametri di 200 nm sulla base dei polipeptidi elastina-come anfilici (ELP) utilizzando la disidratazione-reidratazione da perline di vetro. Sono inoltre presentati protocolli per l'espressione e la purificazione batterica degli ELP attraverso il ciclo della temperatura inversa, nonché la loro funzionalizzazione covalente con coloranti fluorescenti. Inoltre, questo rapporto descrive un protocollo per consentire la trascrizione dell'RNA aptamer dBroccoli all'interno delle vescicle ELP come esempio meno complesso per una reazione biochimica. Infine, viene fornito un protocollo, che consente in vesiculo espressione delle proteine fluorescenti e del peptide della membrana, mentre la sintesi di quest'ultimo si traduce nella crescita vescicale.

Introduzione

La creazione di sistemi cellulari viventi sintetici è di solito avvicinata da due direzioni diverse. Nel metodo top-down, il genoma di un batterio è ridotto ai suoi componenti essenziali, portando in ultima analisi ad una cellula minima. Nell'approccio bottom-up, le cellule artificiali sono assemblate de novo da componenti molecolari o sottosistemi cellulari, che devono essere integrati funzionalmente in un sistema coerente simile a una cellula.

Nell'approccio de novo, la compartimentazione dei componenti biochimici necessari è solitamente ottenuta utilizzando membrane a base di fosfolipidi o acidi grassi^1,

Protocollo

1. Espressione di Polipeptidi simili a Elastin

1. Giorno 1: Preparazione di una coltura di avviamento e forniture per l'espressione peptide
   1. Preparare e autoclave espressione coltura flaastri (4 x 2.5 L) e 3 L di lB medio. Per 1 L di LB medio, aggiungere 25 g di LB in polvere a 1 L di acqua ultrapura.
   2. Preparare una coltura di avviamento con una soluzione di clorramphenico di 100 mL di un lB medio, 50 -L di filtro sterile (filtro 0,22 m) (25 mg/mL in EtOH) e 50 lun di filtro sterile (filtro da 0,22 m) soluzione di carcillina (100 mg/mL in 50% EtOH e 50% di acqua ultrapura).
   3. Aggiungere una piccola striscia da un sto....

Risultati

Produzione di vescicle
La figura 1 mostra immagini di microscopia elettronica a trasmissione (TEM) di vesciche preparate con diverse soluzioni di gonfiore e il metodo delle perline di vetro (vedi anche Vogele et al.^11). Per il campione nella figura 1A,solo PBS è stato utilizzato come soluzione di gonfiore per dimostrare la formazione di vesciche e per determinarne le dimensioni. Quando TX-TL è stato utilizzato come sol.......

Discussione

La reidratazione delle pellicole è una procedura comune per la creazione di piccole vesciche unilamellar. La principale fonte di guasto è la gestione errata dei materiali utilizzati nella procedura.

Inizialmente, gli ELP sono prodotti dalle cellule E. coli. La resa dopo la purificazione dell'ELP può variare in modo significativo a seconda di quanto attentamente il protocollo viene condotto durante i suoi passi crucial.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2xYT	MP biomedicals	3012-032
3-PGA	Sigma-Aldrich	P8877
5PRIME Phase Lock GelTM tubo	VWR	733-2478
Cy3 coniugato con alchini	Sigma-Aldrich	777331
Cy5 coniugato con alchine		777358
ATP	Sigma-Aldrich	A8937
Benzamidin	Carl Roth	CN38.2
BL21 Rosetta 2 E. coli ceppo	Novagen	71402
Bradford BSA Protein Assay Kit	Bio-rad	500-0201
cAMP	Sigma-Aldrich	A9501
Carbenicillin Carl	Roth	6344.2
Cloramfenicolo	Sigma-Aldrich	C1919
Cloramfenicolo	Carl Roth	3886.3
Cloroformio	Carl Roth	4432.1
CoA	Sigma-Aldrich	C4282
CTP	USB	14121
CuSO4	Carl Roth	P024.1
DFHBI	Lucerna Technologies	410
DMSO	Carl Roth	A994.1
DNase I	NEB	M0303S
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
Etanolo	Carl Roth	9065.2
Acido folinico	Sigma-Aldrich	F7878
Perle di vetro, lavate con acido	Sigma-Aldrich	G1277
GTP	USB	16800
HEPES	Sigma-Aldrich	H6147
IPTG (β-isopropil tiogalattoside)	Sigma-Aldrich	I6758
KCl	Carl Roth	P017.1
K-glutammato	Sigma-Aldrich	G1149
LB Brodo	Carl Roth	X968.2
Lisozima	Sigma-Aldrich	L6876
Metanolo	Carl Roth	82,2
MgCl2	Carl Roth	KK36,3
Mg-glutammato	Sigma-Aldrich	49605
Colonne per cromatografia Micro Bio-Spin	Bio-Rad	732-6204
NAD	Sigma-Aldrich	N6522
Linker NHS-azide (estere ossisuccinimide dell'acido y-azidobutirrico)	Baseclick	BCL-033-5
PEG-8000	Carl Roth	263.2
Strisce pH	Carl Roth	549.2
Fenilmetilsulfonile fluoruro	Carl Roth	6367.2
Soluzione salina tamponata con fosfato	VWR	76180-684
Acido	fosforicoSigma-Aldrich	W290017
Polietilenimmina	Sigma-Aldrich	408727
Soluzione bibasica di fosfato di potassio	Sigma-Aldrich	P8584
Soluzione monobasica di fosfato di potassio	Sigma-Aldrich	P8709
Qiagen Miniprep Kit	Qiagen	27106
Tampone di reazione RNAPol	NEB	B9012
Inibitore della RNasi murino	NEB	M0314S
RNaseZap Salviette	ThermoFisher	AM9788
rNTP	NEB	N0466S
Roti-fenolo/cloroformio/alcol isoamilico	Carlroth	A156.1
RTS Campionatore di aminoacidi 5		2401530
Slide-A-Lyzer Cassette per dialisi, 10k MWCO (Kit)	Thermo-Scientific	66382
Cloruro di sodio	Carl Roth	9265.1
Idrossido di sodio	Carl Roth	8655.1
Spermidina	Sigma-Aldrich	85558
Filtrato sterile (0,22 µ Carl	Roth	XH76.1
T7 polimerasi	NEB	M0251S
TBTA (tris(benziltriazolilmetil)ammina)	Sigma-Aldrich	678937
TCEP (tris(2-carbossietil)-fosfina cloridrato)	Sigma-Aldrich	C4706
Tris base	Fischer	BP1521
tRNA (da E. coli)	Roche Applicato Scienza	MRE600
UTP	USB	23160

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