Qui, presentiamo un protocollo per la caratterizzazione immunofenotipica e la differenziazione citochina indotta del sangue cordonale derivato CD34- cellule staminali ematopoietiche e progenitrici ai quattro lignaggi mieloidi. Le applicazioni di questo protocollo includono indagini sull'effetto delle mutazioni della malattia mieloide o di piccole molecole sulla differenziazione mieloide del CD34- cellule.
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Articolo metodologico
Differenziazione pan-mieloide del sangue di cordone umano Derivato CD34- Cellule staminali eseminazioni e progenitrici
In questo articolo
Sommario
Abstract
La differenziazione ex vivo delle cellule staminali ematopoietiche umane è un modello ampiamente utilizzato per studiare l'ematopoiesi. Il protocollo qui descritto è per la differenziazione indotta da citochine di CD34- cellule staminali ematopoietiche e progenitrici alle quattro cellule di lignaggio mieloidi. CD34- Le cellule sono isolate dal sangue del cordone ombelicale umano e co-coltivate con cellule stromali MS-5 in presenza di citochine. La caratterizzazione immunofenotipica delle cellule staminali e progenitrici e le cellule di lignaggio mieloide differenziate sono descritte. Utilizzando questo protocollo, CD34- Le cellule possono essere incubate con piccole molecole o trasdotte con lentivirus per esprimere mutazioni della malattia mieloide per studiare il loro impatto sulla differenziazione mieloide.
Introduzione
La normale differenziazione delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) è fondamentale per il mantenimento dei livelli fisiologici di tutte le linee delle cellule del sangue. Durante la differenziazione, in una risposta coordinata a segnali extracellulari, compresi fattori di crescita e citochine, gli HSC danno prima origine a cellule progenitrici multipotenti (MPP) che hanno un potenziale linfo-mieloide1,2,3 ,4 (Figura 1). I PMP danno origine a progenitori mieloidi comuni (CMP) e a progenitori linfoidi comuni....
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Protocollo
Il sangue del cordone ombelicale umano per la sperimentazione è stato donato da individui sani dopo il consenso informato a Maricopa Integrated Health Systems (MIHS), Phoenix. Le unità identificate sono state ottenute attraverso un accordo di trasferimento di materiale tra MIHS e l'Università dell'Arizona.
1. Reagenti e buffer
NOT: Preparare tutti i reagenti e le tamponamenti in condizioni sterili in un armadietto di sicurezza biologica.
- Preparare il buffer sterile PBS-BSA-EDTA (PBE) aggiungendo 7,2 mL di albumina sterile 35% di siero bovino (BSA; utilizzare la coltura dei tessu....
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Risultati
L'applicazione dei protocolli di cui sopra produce 5,6 (z 0,5) x 108 MNC e 1 (0,3) x 106 CD34, cellule da un'unità di sangue cordonale di 100 mL. La percentuale del totale di CD34- celle varia tra 80-90% (Figura2A,B). L'analisi immunofenotipica da parte dello schema descritto da Manz et al.5 dimostra che le cellule CD34sono in genere costituite da HSC del 20% e da MMP che sono Lin-/CD34.......
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Discussione
Il protocollo qui descritto è adatto per la differenziazione ex vivo di CD34 derivati dall'UCBe hSPC ai quattro lignaggi mieloidi. L'incubazione iniziale con un mix di citochine composto da SCF, TPO, Flt3L e IL3 stimola lecellule CD34. Successivamente, la differenziazione si ottiene con un cocktail di SCF, IL3, Flt3L, EPO e TPO. In questo mix, SCF, IL3 e Flt3L sono importanti per la sopravvivenza e la proliferazione di CD34- HSCs. EPO e TPO promuovono la differenziazione verso gli eritroc.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Wendy Barrett, Rachel Caballero e Gabriella Ruiz di Maricopa Integrated Health Systems per le unità di sangue cordonale de-identificate e donate, Mrinalini Kala per l'assistenza con la citometria di flusso, e Gay Crooks e Christopher Seet per consigli sulla differenziazione dei mieloidi ex vivo. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi per S.S. dal National Institutes of Health (R21CA170786 e R01GM127464) e dall'American Cancer Society (il Institutional Research Grant 74-001-34-IRG). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dei National Institutes of Health.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione di blu di tripano allo 0,4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | Diluire il materiale di lavoro allo 0,2% in acido tetraacetico sterile 1x PBS |
| 0,5 M UltraPure Etilene diammina tetraacetico, pH 8,0 | Gibco | 15575-038 | |
| 10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14185052 | Diluire a 1x con acqua distillata sterile e pH a 7,2 |
| 2,5% di tripsina, senza rosso fenolo | Thermo Fisher Scientific | 15090046 | Diluire il working stock a 1x con 1x PBS |
| 30 sterile &; m Filtri di pre-separazione | Miltenyi biotech | 130-041-407 | |
| 35% sterile Albumina sierica bovina | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | Utilizzato come colorante vivo/morto per eliminare le cellule morte dall'analisi FACS |
| Anticorpo CD10-FITC umano (clone HI10a) | Biolegend | 312207 | Utilizzare diluizione |
| 1:20Anticorpo anti-umano CD11b-FITC (attivato) (Clone CBRM1/5) | Biolegend | 301403 | Utilizzare una diluizione 1:5 |
| Anticorpo anti-umano CD123-APC (Clone 6H6) | Biolegend | 306012 | Utilizzare una diluizione 1:20 |
| Anticorpo anti-umano CD14-PE (Clone M5E2) | Biolegend | 301806 | Utilizzare una diluizione 1:20 |
| Anticorpo anti-umano CD19-FITC (Clone 4G7) | BD Biosciences | 347543 | Utilizzare una diluizione 1:5 |
| Anticorpo anti-umano CD235a-APC (Clone GA-R2 (HIR2)) | BD Biosciences | 551336 | Utilizzare una diluizione 1:20 |
| Anticorpo anti-umano CD235a-FITC (Clone HIR2) | Biolegend | 306609 | Utilizzare una diluizione 1:50 Anticorpo |
| anti-umano CD34-APC-Cy7 (Clone 581) | Biolegend | 343514 | Utilizzare una diluizione 1:20 |
| Anticorpo anti-umano CD38-PE (Clone HIT2) | Biolegend | 303506 | Utilizzare la diluizione 1:20 |
| Anticorpo anti-umano CD3-FITC (Clone UCHT1) | Biolegend | 300405 | Use Diluizione 1:20 |
| Anticorpo anti-umano CD41a-PerCP-Cy5.5 (Clone HIP8) | Biolegend | 303720 | Use 1:20 diluizione |
| Anti-umano CD45Ra-PE-Cy7 (Clone HI100) | Biolegend | 304126 | Use Diluizione 1:20 |
| Anticorpo anti-umano CD66b-PE-Cy7 (Clone G10F5) | Biolegend | 305116 | Use Diluizione 1:20 |
| Anticorpo CD7-FITC umano (Clone CD7-6B7) | Biolegend | 343103 | Utilizzare diluizione 1:20 |
| Dimetilsolfossido (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Filtro sterilizzare prima dell'uso |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) in polvere con L-glutammina | Gibco | 12100046 | Ricostituire 1 bustina per ottenere 1 litro di terreno DMEM con bicarbonato di sodio, 10% FBS e 1% penicillina e streptomicina |
| Siero fetale bovino, fonte australiana, inattivato a caldo | Omega Scientific | FB-22 Lotto #609716 | |
| Kit di microsfere CD34 umane. | Miltenyi biotech | 130-046-702 | |
| Trombopoietina umana (TPO), grado di ricerca | Miltenyi biotech | 130-094-011 | Fare una scorta di 100 µ g/mL in 1x PBS + 0,1% BSA. Utilizzare 50 ng/mL sia per la differenziazione mieloide che per mezzo di stimolazione |
| L-Glutammina | Omega Scientific | GS-60 | 2 mM concentrazione nel mezzo di stimolazione |
| LS Colonne | Miltenyi biotech | 130-042-401 | |
| MACS Multi stand | Miltenyi biotech | 130-042-303 | |
| Separatore magnetico MidiMACS | Miltenyi biotech | 130-042-302 | |
| Terreno di frazionamento MNC (Ficol-Paque PLUS) | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-03 | |
| MS-5 | Dono dal laboratorio di Gay Crooks, UCLA | ||
| Paraformaldeide | Sigma-Aldrich | P6148 | Riscaldare 800 mL di 1x PBS in un becher di vetro su una piastra di agitazione in una cappa chimica a ~65 °C. Aggiungere 10 g di polvere di paraformaldeide. Per sciogliere completamente la paraformaldeide, aumentare il pH aggiungendo 1 N NaOH. Raffreddare e filtrare la soluzione e portare il volume a 1 L con 1x PBS. Regolare il pH a 7,2. |
| Penicillina & Streptomicina | Sigma-Aldrich | P4458-100ml | |
| Poli-L lisina | Sigma-Aldrich | P2636 | Produce un stock di 10 mg/mL in 1x |
| PBS Eritropoietina-alfa umana ricombinante (rHu EPO-&alfa;) | BioBasic | RC213-15 | Produce uno stock di 2.000 unità/mL in 1x PBS + 0,1% BSA. Utilizzare 4 unità/mL per la differenziazione mieloide |
| Frammento di fibronectina umana ricombinante (RetroNectina) | Takara | T100B | Uso 20 µ g/mL diluito in 1x PBS sterile per rivestire i pozzetti prima della stimolazione delle HSC CD34+. |
| Ligando umano ricombinante Flt-3 (rHu Flt-3L) | BioBasic | RC214-16 | Fare uno stock di 100 µ g/mL in 1x PBS + 0,1% BSA. Utilizzare 5 ng/mL per la differenziazione mieloide e 50 ng/mL in mezzo di stimolazione |
| Interleuchina-3 umana ricombinante (rHu IL-3) | BioBasic | RC212-14 | Fare uno stock di 100 µ g/mL in 1x PBS + 0,1% BSA. Utilizzare 5 ng/mL per la differenziazione mieloide e 20 ng/mL in terreno di stimolazione |
| Fattore di cellule staminali umane ricombinanti (rHu SCF) | BioBasic | RC213-12 | Fare uno stock di 100 µ g/mL in 1x PBS + 0,1% BSA. Utilizzare 5 ng/mL per la differenziazione mieloide e 50 ng/mL in terreno di stimolazione |
| Terreno privo di siero (X-Vivo-15) | Lonza | 04-418Q | |
| Bicarbonato di sodio | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Colorazione Wright-Giemsa, | Sigma-Aldrich | WG16-500 | modificata Utilizzare secondo le istruzioni del produttore |
| Equipment | |||
| BD LSR II citometro a flusso | BD Biosciences | ||
| Centrifuga | Sorvall Legend RT | ||
| Microscopio ottico | Olympus |
Riferimenti
- Hao, Q. L., Shah, A. J., Thiemann, F. T., Smogorzewska, E. M., Crooks, G. M. A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow. Blood. 86 (10), 3745-3753 (1995).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L.
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Ristampe e permessi
