Questo articolo descrive un metodo per identificare le alterazioni clonali e subclonali tra campioni diversi di un determinato paziente. Anche se gli esperimenti qui descritti si concentrano su un tipo di tumore specifico, l'approccio è ampiamente applicabile ad altri tumori solidi.
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Articolo metodologico
Analisi comparativa delle lesioni attraverso un approccio di sequenziamento mirato
In questo articolo
Sommario
Abstract
Valutare l'eterogeneità intra-tumorale (ITH) è di fondamentale importanza per anticipare il fallimento delle terapie mirate e progettare strategie antitumorali di conseguenza efficaci. Anche se le preoccupazioni sono spesso sollevate a causa delle differenze nell'elaborazione del campione e nella profondità della copertura, il sequenziamento di prossima generazione dei tumori solidi ha svelato un grado altamente variabile di ITH in tutti i tipi di tumore. Catturare la correlazione genetica tra le lesioni primarie e metastatiche attraverso l'identificazione delle popolazioni clonali e subclonali è fondamentale per la progettazione di terapie per le malattie in fase avanzata. Qui, riportiamo un metodo per l'analisi delle lesioni comparative che consente l'identificazione delle popolazioni clonali e subclonali tra campioni diversi dello stesso paziente. L'approccio sperimentale qui descritto integra tre approcci consolidati: analisi istologica, sequenziamento multi-lesiona ad alta copertura e analisi immunofenotipiche. Al fine di ridurre al minimo gli effetti sulla rilevazione di eventi subclonali mediante un'elaborazione inappropriata dei campioni, abbiamo sottoposto i tessuti a un attento esame patologico e all'arricchimento delle cellule neoplastiche. Il DNA controllato dalla qualità delle lesioni neoplastiche e dei tessuti normali è stato poi sottoposto a sequenziamento ad alta copertura, mirando alle regioni di codifica di 409 geni tumorali rilevanti. Sebbene solo guardando uno spazio genomico limitato, il nostro approccio consente di valutare l'entità dell'eterogeneità tra alterazioni somatiche (mutazioni a singolo nucleotide e variazioni del numero di copie) in lesioni distinte da un determinato paziente. Attraverso un'analisi comparativa dei dati di sequenziamento, siamo stati in grado di distinguere le alterazioni clonale e subclonali. La maggior parte dell'ITH è spesso attribuita alle mutazioni dei passeggeri; pertanto, abbiamo anche usato l'immunoistochimica per prevedere le conseguenze funzionali delle mutazioni. Mentre questo protocollo è stato applicato a un tipo di tumore specifico, prevediamo che la metodologia qui descritta è ampiamente applicabile ad altri tipi di tumore solido.
Introduzione
L'avvento del sequenziamento di nuova generazione (NGS) ha rivoluzionato il modo in cui i tumori vengono diagnosticati e trattati1. NGS accoppiato al sequenziamento multiregionale hanno esposto un alto grado di eterogeneità intra-tumorale (ITH) in tumori solidi2, che spiega in parte il fallimento della terapia mirata a causa della presenza di subcloni con diversa sensibilità farmacologica2 . Una sfida importante posta dagli studi di sequenziamento a livello di genoma è la necessità di distinguere tra mutazioni passeggeri (cioè neutre) e del conducente nei singoli tumori
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Protocollo
Il materiale utilizzato nello studio è stato raccolto nell'ambito di un protocollo specifico, che è stato approvato dal comitato etico locale. Era disponibile il consenso informato scritto da parte di tutti i pazienti.
1. Revisione istologica e immunofenotipica dei campioni di tessuto
NOTA: Un patologo esperto è responsabile delle attività descritte di seguito.
- Revisione istopatologica dei casi selezionati secondo criteri diagnostici ben consolidati.
- Utilizzare il microtoma per tagliare sezioni di tessuto spesso 4x5 m da blocchi di tessuto FFPE rappresentativi e montare le sezioni su vetrini di ....
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Risultati
Il flusso di lavoro di studio è illustrato nella Figura 1. Il sequenziamento di 5 casi SPN mirati alle sequenze di codifica di 409 geni correlati al cancro ha identificato un totale di 27 mutazioni somatiche in 8 geni (CTNNB1, KDM6A, BA1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1e FGFR3). Le mutazioni sono state definite come fondatore/clonale quando condivise tra tutte le lesioni di un determinato paziente e progressor/subclonali quando .......
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Discussione
Il nostro metodo consente l'identificazione delle alterazioni molecolari coinvolte nella progressione dei tumori solidi attraverso l'integrazione di dati verticali (ad esempio, morfologia, sequenziamento del DNA e immunosofologia) da lesioni distinte di un determinato paziente. Abbiamo dimostrato la capacità del nostro metodo di rilevare eventi clonali e subclonali in un tipo di tumore silenzioso mutazionale (cioè SPN, neopolismo pseudoppillare del pancreas) interrogando le sequenze di codifica di 409 geni rilevanti per .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Lo studio è stato sostenuto dal Progetto Italiano Cancro Genoma (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Ricerca Italiana Cancro (AIRC; Sovvenzione da 12182 a AS e 18178 a VC), FP7 European Community Grant (Cam-Pac N. 602783 ad AS). Le agenzie di finanziamento non hanno avuto alcun ruolo nella raccolta, nell'analisi e nell'interpretazione dei dati o nella stesura del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Strumento bioanalizzatore 2100 | Tecnologie Agilent | G2939BA | Strumento automatizzato per elettroforesi |
| Agencourt AMPure XP Kit | Fisher Scientifico | NC9959336 | Tecnologia delle perline per la purificazione dei prodotti PCR; reagente di purificazione a base di microsfere |
| Kit DNA ad alta sensibilità Agilent | Tecnologie Agilent | 5067-4627 | Quantificazione della libreria |
| Anti-BAP1 | Santa Cruz Biotecnologia | SC-28383 | Anticorpo |
| Anti-GLUT1 | Termo Scientifico | RB-9052 | Anticorpo |
| Anti-KDM6A | Segnalazione cellulare | #33510 | Anticorpo |
| Anti-p53 | Novocastra | NCL-L-p53-DO7 | Anticorpo |
| Anti-β catenina | Sigma-Aldrich | Visualizzazione del materiale C7207 | Anticorpo |
| Soluzione di blocco | fatto in casa | - | 5 % di albumina sierica bovina (BSA) in TBST |
| Soluzione di inattivazione delle perossidasi endogene | fatto in casa | - | 3% H2O2 in soluzione salina tamponata Tris (TBS) 1x |
| Leica CV ultra | Leica | 70937891 | Entellan mountin media |
| Soluzione per il recupero degli epitopi 1 | Leica Biosystems | AR9961 | Soluzione per il recupero dell'epitopo a base di citrato pH 6.0 |
| Soluzione per il recupero degli epitopi 2 | Leica Biosystems | AR9640 | Soluzione per il recupero dell'epitopo a base di EDTA a pH 9,0 |
| Eppendorf Provette PCR da 0,2 ml, trasparenti | Eppendorf | 951010006 | Tubi |
| Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1,5 mL | Eppendorf | 22431021 | Tubi |
| Etanolo | DIAPATH | Codice A0123 | Reagente di deparaffinazione IHC |
| Penna ImmEdge Idrofobico Barriera Penna | Laboratori Vector | H&timido; 4000 | Penna idrofobica |
| ImmPACT DAB Perossidasi | Laboratori Vector | SK&timido; 4105 | Substrato HRP |
| ImmPRESS Anti Coniglio Ig Reagente Perossidasi | Laboratori Vector | MP&timido; 7401&timido; 50 | Anticorpo secondario |
| ImmPRESS Anti Topo Ig Reagente Perossidasi | Laboratori Vector | MP&timido; 7402&timido; 50 | Anticorpo secondario |
| Visualizzatore di genomica integrativa (IGV) | Istituto Broad | - | https://software.broadinstitute.org/software/igv/home |
| Ion AmpliSeq Pannello completo sul cancro | Thermofisher Scientifico | 4477685 | Selezione multipla del bersaglio di 409 geni correlati al cancro. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf |
| Kit libreria Ion AmpliSeq 2.0 | Thermofisher Scientifico | 4480441 | Preparazione di librerie di ampliconi utilizzando pannelli Ion AmpliSeq |
| Ion Chef Strumento | Thermofisher Scientifico | 4484177 | Preparazione automatizzata della libreria, preparazione dei modelli e caricamento dei chip |
| Kit chip Ion PI v3 o chip Ion 540 | Thermofisher Scientifico | A26771 o A27766 | Chip con codice a barre per il sequenziamento |
| Ion PI Hi-Q Chef Kit o Ion 540 Kit-Chef | Thermofisher Scientifico | A27198 o A30011 | Preparazione del modello |
| Kit di sequenziamento Ion PI Hi-Q 200 o kit di sequenziamento Ion S5 | Thermofisher Scientifico | A26433 o A30011 | Sequenziamento |
| Sistema Ion Proton o Ion GeneStudio S5 | Thermofisher Scientifico | 4476610 o A38196 | Sistema di sequenziamento |
| Ion Reporter Software - AmpliSeq Pannello Completo Tumori Coppia tumore-normale | Thermofisher Scientifico | 4487118 | Flusso di lavoro |
| Ion Reporter Software - plugin per l'uploader | Thermofisher Scientifico | 4487118 | Strumento di analisi dei dati |
| Software Ion Torrent Suite - Plugin per l'analisi di Coverege | Thermofisher Scientifico | 4483643 | Plugin che descrivono il livello di copertura di sequanza prodotto |
| Ion Torrent Suite Software - Plugin Variant Caller | Thermofisher Scientifico | 4483643 | Plugin in grado di identificare polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), inserzioni e delezioni in un campione attraverso un riferimento |
| Kit adattatori per codici a barre Ion Xpress 1-96 | Thermofisher Scientifico | 4474517 | Adattatori per codici a barre univoci |
| Spettrofotometri NanoDrop 2000/2000c | Thermofisher Scientifico | ND-2000 | Rilevamento della purezza del DNA |
| Database delle sequenze di riferimento NCBI (RefSeq) | NCBI | - | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/ |
| Platinum PCR SuperMix Alta Fedeltà | Fisher Scientifico | 12532-016 o 12532-024 | SuperMix per l'amplificazione PCR; Miscela PCR ad alta fedeltà |
| Mini kit di sangue QIAamp DNA | Quiagen | Codice: 51106 0r 51104 | Kit per estrazione di sangue di DNA |
| QIAamp DNA FFPE Tessuto | Quiagen | 56404 | Kit per estrazione tissutale di DNA FFPE |
| Fluorimetro Qubit 2.0 | Thermofisher Scientifico | Domanda 32866 | Quantificazione del DNA |
| Kit di test Qubit dsDNA BR | Thermofisher Scientifico | Domanda 32850 | Kit per la quantificazione del DNA su fluorimetro Qubit 2.0 |
| TBST | fatto in casa | - | Soluzione salina tamponata Tris (TBS) e 0,1% di Tween 20 |
| Tissue-Tek Prisma Plus & Pellicola Tissue-Tek | Sakura Europa | 6172 | Strumento automatizzato per la colorazione dei vetrini dei tessuti |
| Software per predittori di effetti varianti (VEP) | EMBI-EBI | - | http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Strumenti/VEP |
| Xilene, miscela di isomeri | Carlo Erba | 492306 | Reagente di deparaffinazione IHC |
Riferimenti
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Ce....
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Ristampe e permessi
