Metodo Ex Vivo per valutare la motilità spontanea del tratto riproduttivo del mouse e un algoritmo di tracciamento del movimento uterico basato su MATLAB per l'analisi dei dati

Come un importante organo femminile, l'utero è cruciale per la riproduzione ed essenziale per il nutrimento del feto¹. L'utero è costituito da tre strati: il perimetrio, miometrio ed endometrio. Il miometrio è il principale strato contrattuale dell'utero e svolge un ruolo chiave nella consegna del feto. L'endometrio è lo strato più interno che riveste la cavità uterina ed è essenziale per l'impianto dell'embrione. Nelle femmine non incinte in età riproduttiva, lo strato endometriale viene versato mensilmente all'inizio del ciclo mestruale. Il miometrio aiuta in questo processo di spargimento mantenendo le contrazioni miometriche spontanee necessarie per eliminare il tessuto endometriale necrotico dall'utero¹.

Purtroppo, aumento della contrattilità miometriale può provocare effetti collaterali negativi come dismenorrea, o crampi mestruali dolorosi. Questo è particolarmente visto nelle giovani femmine e nelle donne nullime². Tuttavia, la dismenorrea è diversa per ogni donna e dipende dalla forza delle loro contrazioni miometriche; contrazioni più forti sono spesso associate alla sensazione di gravi crampi³. La contrattilità miometriale può essere visualizzata utilizzando ultrasuoni uterini ed è spesso riconosciuta come onde endometriali. Maggiore rilascio di prostaglandine durante le mestruazioni⁴ in un utero sottoposto a sloughing endometriale è creduto per contribuire ad aumento dell'ipercontrattualità miometria, conseguente ischemia e ipossia del muscolo uterino e quindi aumentato dolore³.

Grave dismenorrea può ostacolare l'attività quotidiana di alcune donne e 3 a 33% delle donne hanno dolore molto grave, che potrebbe causare una donna a letto per 1 a 3 giorni ogni ciclo mestruale⁵. La dismenorrea è la principale causa di morbilità ginecologica nelle donne in età riproduttiva indipendentemente dall'età, dalla nazionalità e dallo status economico⁵. La prevalenza stimata di dismenorrea è alta e variabile, che va dal 45% al 93% nelle donne di età riproduttiva⁵.  Il dolore associato alla dismenorrea ha un effetto sulla vita quotidiana delle donne e può provocare scarse prestazioni accademiche negli adolescenti, minore qualità del sonno, restrizione delle attività quotidiane e cambiamenti di umore⁵.

Molte donne che sperimentano grave dismenorrea ricorrono a farmaci da banco per alleviare il loro dolore. Tali farmaci da banco contengono inibitori cicloossigenasi (COX) che impediscono la formazione di prostaglandine^{6 .} Tuttavia, gli inibitori di COX sono associati a eventi cardiovascolari avversi e circa il 18% delle donne con dismenorrea non risponde a questi inibitori⁷. Pertanto, vi è la necessità di nuovi farmaci per ridurre i crampi mestruali. Poiché oltre la contrattilità dell'utero contribuisce alla patogenesi della dismenorrea, una possibile strategia può essere l'uso di rilassanti uterini.

È utile quantificare gli effetti di potenziali farmaci rilassanti in un modello di contrazioni miometriche miometriche naturali. Tuttavia, finora, non è stato descritto alcun metodo ex vivo efficiente per testare farmaci che rilassano i muscoli nell'utero intatto. Attualmente, le misurazioni della tensione isometrica vengono utilizzate per valutare gli effetti del farmaco rilassante. Durante tali misurazioni, una striscia muscolare uterina viene mantenuta ad una lunghezza costante sotto precarico in un bagno di tessuto mentre la forza delle contrazioni muscolari uterine viene registrata prima e dopo la stimolazione dell'ossitocina in presenza o assenza di un farmaco rilassante. Anche se questo approccio è molto utile, richiede attrezzature costose. Inoltre, le contrazioni isometriche non assomigliano alle contrazioni spontanee simili all'onda del miometrio che si verificano naturalmente nell'utero intatto. In modo univoco, le onde della miometria uterina nei roditori possono essere visualizzate come motilità del corno uterino quando l'intero tratto riproduttivo (ovaie, ovidotti, utero e vagina) viene mantenuto in una soluzione cuscinetto. Qui, presentiamo un metodo ex vivo per monitorare la motilità spontanea dell'utero murino intatto posto in una piastra Petri contenente buffer Krebs ossigenato. Descriviamo anche un algoritmo di quantificazione della motilità che utilizza il motion tracker MATLAB. Questo nuovo approccio fornisce un'alternativa semplice e meno costosa per testare il potenziale rilassante dei rimedi naturali e dei composti sintetici.

Tutte le procedure con animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso la Indiana University School of Medicine (Indianapolis, IN). 2-5 mesi-vecchio F2-129S-C57BL/6 topi femminili sessualmente maturi sono stati utilizzati nello studio.

ATTENZIONE: Garantisci la sicurezza indossando un camice da laboratorio, una maschera e dei guanti quando lavori con animali e materiali biopericolosi.

1. Preparazione della soluzione

1. Preparare il Tamibe Buffer, che contiene: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1,2 mM NaH₂PO₄, 0,56 mM MgCl₂, 25 mM NaHCO₃e 5 mM di glucosio, pH 7.4. Ossigenare continuamente il tamponi Krebs con una miscela di gas compressi contenenti il 5% di CO₂ e 95% O₂ mantenendo la temperatura tampone a 37 gradi utilizzando un bagno d'acqua circolante.
2. Preparare la Salina (DPBS) di Dulbecco, che contiene: 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH₂PO₄, 136,89 mM NaCl e 8,1 mM Na₂HPO₄, pH 7.4.

2. Preparazione degli animali

1. Topi anestesi con inalazione di isoflurane (3%) con lo scavenging del gas di scarico. Garantire un'adeguata anestesia valutando i riflessi di ritiro. Pizzicare la punta posteriore per affermare che non vengono suscitati movimenti, indicando la perdita di risposte riflesse. Dopo aver raggiunto l'anestesia profonda, eutanasia l'animale per decapitazione.
   NOT: Isoflurane può causare dilatazione muscolare liscia. Pertanto, la preparazione del tratto riproduttivo deve essere lavata e incubata in modo estensico nel tampone Krebs per almeno 15-30 min prima di iniziare gli esperimenti ex vivo. Isoflurane può causare irritazione e disagio quando è a contatto con la pelle, quindi procedere con cautela.
2. Posizionare il corpo su una grande barca di pesatura rivestita con un asciugamano di carta.
   NOT: Il personale di laboratorio femminile incinta non dovrebbe essere coinvolto in esperimenti con l'isoflurane perché può diminuire il peso fetale, diminuire l'ossificazione scheletrica fetale e aumentare il rischio di aborto spontaneo^8,9. L'inalazione di CO₂ può essere utilizzata come sostituto dei topi eutanasia.

3. Determinazione della fase del ciclo Estrous

1. Con piccole pinze, sollevare il clitoride per ottenere l'accesso all'ostio vaginale e inserire lentamente una punta di micropipette contenente 10 .L di DPBS nella vagina.
   1. Assicurarsi che la punta della micropipetta sia inserita attraverso l'ostio con un angolo di 10 - 30 per evitare di perforare la parete vaginale. Il liquido dovrebbe essere ancora visibile nella punta dopo l'inserimento. Se il liquido non è visibile, la punta è stata inserita troppo lontano nella vagina e l'area paracervica della vagina potrebbe essere stata perforata.
   2. Tirare leggermente verso il basso i muscoli vaginali ostium con la punta della micropipetta per consentire all'aria di uscire dalla vagina.
2. Sciacquare lentamente la cavità vaginale pipeting su e giù 2-3 volte con 10 -L di DPBS e posizionare la sospensione della cella disegnata su uno scivolo di vetro.
3. Utilizzare un microscopio a contrasto di fase invertito per determinare la fase del ciclo estribuisco attraverso l'analisi citologica. La procedura viene eseguita come descritto altrove^10,11. Assicurarsi che la sospensione cellulare non si asciughi prima di poter eseguire l'analisi citologica. La sospensione può essere diluita con DPBS fresco, se necessario.

4. Tratto riproduttivo del mouse Ddissection

1. Disporre il topo in posizione supina e diffondere le sue estremità per esporre la regione abdominopelvic.
2. Spruzzare con 70% etanolo per inumidire e disinfettare l'area abdominopelvic.
3. Utilizzando pinze, sollevare con attenzione la pelle situata superiore al clitoride. Fare piccole incisioni trasversali sugli aspetti laterali dell'area addominale inferiore, fino agli arti superiori per esporre il peritoneo (Figura 1A). Durante questo processo, si formerà un lembo esterno. Come piccole incisioni sono continuamente fatte, il lembo aumenterà di dimensioni.
4. Tagliare con attenzione il peritoneo per esporre il tratto gastrointestinale (Figura 1B). È importante notare che le corna uterine possono spesso essere localizzate direttamente sotto il peritoneo, quindi fai incisioni con cautela e non toccare le corna in quanto ciò può influenzare la motilità uterina.
5. Utilizzando le pinze, rimuovere la fascia e il tessuto adiposo che copre il tratto gastrointestinale. Rimuovere i seguenti segmenti del tratto gastrointestinale dalla cavità addominale: il duodenum, il jejunum, ileum, il cecum, il colon ascendente e trasversale (Figura 1C).
6. Per individuare gli organi riproduttivi, identificare prima la vescica urinaria (Figura 1C, "4"), che può avere un aspetto sgonfio a causa dell'annullamento dopo l'eutanasia. La vagina sarà proprio sotto la vescica urinaria.
7. Individuare la simfisi pubica alla confluenza delle ossa pubiche (caudally alla vescica).
8. Utilizzando le forbici, rimuovere la simfisi pubica facendo con attenzione incisioni sui suoi lati laterali attraverso il tessuto fibrocartilaginoso interpubico per ottenere l'accesso e fornire un percorso per l'estrazione della vagina (Figura 1D).
9. Tagliare il perineo situato tra l'ano e la parte inferiore della vulva.
10. Usando le pinze, sollevare la vagina e lentamente eccitare il retto.
11. Identificare due corna uterine che biforcano in una forchetta, sontrando verso la vagina. Individuare un ovidotto contorto e ovaio alla fine di ogni corno, che può essere nascosto sotto i restanti segmenti del tratto gastrointestinale. Utilizzare piccole forbici di sedgente per rimuovere eventuali legamenti che si collegano e sostengono le corna, gli ovidotti e le ovaie all'interno della cavità addominale.
12. Rimuovere il tratto riproduttivo, che include la vagina, l'utero, gli ovidotti e le ovaie, dalla cavità addominale.
13. Trasferire il tratto riproduttivo isolato (Figura 1E) in un piatto Petri da 100 mm riempito con 10 mL di DPBS. Non comprimere le corna uterine per evitare di danneggiare il miometrio.
14. Utilizzare pinze e forbici chirurgiche per rimuovere qualsiasi tessuto connettivo e adiposo che circonda le corna uterine e la vagina, nonché qualsiasi pelliccia nella regione pubica che potrebbe ostacolare la qualità dell'immagine. Rimuovere l'ampio legamento per consentire la motilità delle corna uterine.
15. Lavare due volte il tratto riproduttivo isolato con il DPBS fresco e trasferirlo in un piatto Petri da 35 mm riempito con 3 mL di soluzione Krebs ossigenati.

5. Imaging dei tessuti

1. Posizionare la parabola Petri contenente il tratto riproduttivo nel tampone Krebs ossigenato su una superficie nera. Mantenere il piatto a temperatura ambiente.
   NOT: È possibile utilizzare un pad di riscaldamento a infrarossi per mantenere il tessuto a 37 gradi centigradi.
2. Lasciare iniziare 15-30 min per le contrazioni spontanee. Registrare motilità uterina spontanea per 10 min da un aereo assiale utilizzando qualsiasi tipo di apparecchiatura video digitale.
3. Trasferire la preparazione in una piastra Petri contenente il tampone Krebs ossigenato integrato con un composto di prova. Registrare motilità uterina spontanea per circa 10 min da un aereo assiale utilizzando qualsiasi tipo di apparecchiatura video digitale.
4. Lavare l'intero tratto riproduttivo in una piastra Petri da 100 mm con 10 mL di DPBS per valutare la reversibilità del trattamento.
5. Trasferire la preparazione in una piastra Petri con il tamponi Krebs appena ossigenato. Registrare motilità uterina spontanea per circa 10 min da un aereo assiale utilizzando qualsiasi tipo di apparecchiatura video digitale.
6. Trasferire la preparazione in un'altra parabola Petri da 35 mm ripiena di tampone Krebs ossigenato integrato con il veicolo per il composto di prova per garantire che non ci siano cambiamenti indotti meccanicamente nella motilità uterina spontanea. Questo è un controllo importante.
7. Trasferire il filmato video su un disco rigido del computer.

6. Analisi dei dati

1. Crea clip utilizzando qualsiasi software di editing video dal filmato video originale contenente il controllo, il trattamento e gli episodi di lavaggio.
2. Utilizzare il software MATLAB e lo script fornito (vedi materiale supplementare online) per quantificare la motilità uterina spontanea.
   NOT: Per ottenere il funzionamento dello script, è necessario che sia installato il componente aggiuntivo Computer Vision Toolbox per MATLAB.
   1. Aprire lo script MATLAB, passare alla scheda Editor e fare clic su Esegui.
   2. Selezionare il primo file video e fare clic su Apri.
   3. Immettere un'etichetta per il file video nella finestra di dialogo a comparsa e fare clic su OK.
   4. Immettere l'intervallo di tempo necessario per calcolare la velocità di movimento del corno (distanza euclidea/z).
   5. Utilizzare il cursore del mouse per selezionare due punti sul primo fotogramma del video. Una finestra pop-up chiederà di confermare che i punti selezionati devono essere utilizzati per il monitoraggio. Fare clic su Avvia per avviare il processo di monitoraggio in tempo reale che verrà visualizzato nella finestra popup. In alternativa, fate clic su Riseleziona punti per riselezionare i due punti.
   6. Monitorare l'accuratezza del processo di tracciamento nella finestra pop-up.
   7. Osservare un grafico a dispersione temporale e a velocità rispetto a un grafico a dispersione temporale in una nuova finestra popup. Salvare le due figure selezionando File Salva con nome nella stessa finestra per documentare i dati.
   8. Trovare una cartella denominata PointTrackerData, creata automaticamente da MATLAB, nella stessa directory in cui si trova lo script MATLAB. Identificare un file di Excel denominato label_Data contenente i punti dati raccolti dal video in due schede separate del foglio di lavoro.
      NOTA: Qualsiasi software di tracciamento del movimento alternativo può essere utilizzato per quantificare la motilità spontanea dell'utero.
3. Utilizzare un software appropriato (ad esempio, Excel o SigmaPlot 13) per eseguire l'analisi statistica.

La figura 1 mostra le immagini rappresentative scattate durante l'intera procedura di isolamento del tratto riproduttivo descritta in questo protocollo. Per evitare di contaminare il buffer con la pelliccia, che diminuirebbe la qualità video, abbiamo inumidito il corpo del topo con il 70% di etanolo. Il principale punto di riferimento per la sezione di dissezione del protocollo è quello di trovare la vescica urinaria. L'utero e la vagina saranno situati inferiori alla vescica urinaria.

Per testare il protocollo, abbiamo trattato l'intero tratto riproduttivo con epinefrina. L'epinefrina è ben nota per causare il rilassamento muscolare liscio uterino. Questo ormone è endogenamente prodotto nella medulla surrena e serve come un ormone dello stress nei mammiferi. Nei nostri esperimenti abbiamo usato 1 epinefrina M. Si tratta di una concentrazione saturante nota per causare la risposta massima12. Sono stati eseguiti una serie di quattro esperimenti. In tutte le prove, 1 epinefrina m reversibilmente inibito spontaneamente motilità uterina (Figura 2).

Per quantificare la motilità spontanea del tratto riproduttivo, abbiamo progettato un algoritmo che ci permette di valutare il tasso medio di variazione della distanza euclidea tra due punti selezionati sul tratto riproduttivo del mouse. Le posizioni dei punti vengono tracciate utilizzando il modulo di tracciamento del movimento del software MATLAB. Lo script corrispondente per MATLAB, che abbiamo usato per calcolare le distanze euclidee, è fornito nel materiale supplementare online. La posizione dei punti è fondamentale per una procedura di tracciamento del movimento di successo. Occorre prestare attenzione alla qualità dei video perché i riflessi di luce dalla parete del piatto Petri possono distrarre il tracker di movimento e potrebbe smettere di tracciare il movimento del corno mentre riassegna il punto a una delle luci Riflessioni. Abbiamo scelto di posizionare uno dei punti al centro di un corno per garantire che fosse abbastanza lontano dai riflessi della parete del piatto Petri. Il secondo punto è stato di solito selezionato sulla vagina poiché non mostrava motilità spontanea. Figura 3 fornisce un esempio di analisi dei dati e la figura supplementare 1 mostra le immagini rappresentative acquisite durante il rilevamento del movimento.

Figura 1 : passi dell'isolamento dell'intero tratto riproduttivo. (A) È stata fatta un'incisione nella pelle e la regione abdominopelvic è stata esposta sopra il peritoneo (1). (B) La membrana sirea è stata lentamente aperta per esporre il tratto gastrointestinale (2). (C) Il tratto gastrointestinale è stato spostato per esporre le corna uterine (3). La vescica urinaria (4) può essere visualizzata vicino alla congiunzione delle corna. (D) Le corna uterine sono state liberate e tagli sono stati fatti sui lati laterali della sinfisi pubica (5) per esporre la vagina (6). (E) Rimozione del tratto riproduttivo isolato e posizionamento nella soluzione DPBS. Qualsiasi pelliccia in eccesso o tessuto connettivo è stato rimosso. (F) Un'indentazione profonda può essere vista sulla vagina (a destra) dopo la rimozione del retto (a sinistra, 7). (G) Il tessuto connettivo circostante viene rimosso. Una fotocamera digitale e un software Application Suite (versione 3.7.0) è stato utilizzato per acquisire immagini in tempo reale durante la dissezione (impostazione della fotocamera: tonalità 20/saturazione 80). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : viene mostrato un esperimento rappresentativo con l'intero tratto riproduttivo isolato. Le immagini sono state scattate a 15 s di distanza prima (A), durante (B) e dopo (C) l'applicazione di 1 epinefrina M. La preparazione del tratto riproduttivo ha mostrato un'elevata motilità nei pannelli A e C in assenza di epinefrina, ma è quiescente nel pannello B con la presenza di 1 epinefrina M. Il filmato video non modificato viene fornito come video supplementari 1-3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Analisi dei dati nell'esperimento ex vivo descritto in Figura 2. (A) Viene mostrato un corso temporale del tasso di variazione della distanza euclidea. I punti di riferimento tra i quali la distanza è stata determinata durante la motilità uterina spontanea sono indicati come punti verdi nell'insetto. I punti sono stati selezionati nella parte prossimale della vagina e nel segmento centrale di un corno uterino come raffigurato. I cerchi blu riempiti mostrano i valori spontanei del tasso di motilità prima di aggiungere epinefrina, i cerchi rossi mostrano i tassi spontanei di motilità in presenza di 1 epinefrina m e i cerchi verdi riempiti mostrano i tassi di motilità spontanei dopo un lavaggio. (B) Un confronto dei tassi di variazione della distanza euclidea media (pixel/s) prima dell'aggiunta di epinefrina (barra blu), in presenza di 1 M di epinefrina (barra rossa) e dopo un lavaggio (barra verde). Il software MATLAB è stato utilizzato per quantificare la motilità uterina. L'intervallo z è stato impostato su 5 s. "Distanzaz" viene calcolato come differenza tra la distanza iniziale del fotogramma e la distanza del fotogramma 5 s più tardi. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando Kruskal-Wallis One Way Analysis of Variance on Ranks seguito da tutte le procedure di confronto multiple a coppie secondo il Metodo del Dunn utilizzando SigmaPlot 13. L'asterisco indica il set di dati che era significativamente diverso dagli altri set di dati sperimentali (P & <0.001). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Filmsupplementare 1 : Video clip time-lapse che mostra la motilità uterina spontanea prima di aggiungere 1 - M di epinefrina. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)

Filmatosupplementare 2 : Video clip time-lapse che mostra la motilità uterina spontanea quando il buffer Krebs è stato integrato con 1 epinefrina M. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)

Filmsupplementare 3 : Video clip time-lapse che mostra la motilità uterina spontanea dopo il lavaggio. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)

Figurasupplementare 1 : Immagini rappresentative scattate ogni 15 s durante il tracciamento del movimento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Materiale supplementare: lo script dell'algoritmo di tracciamento basato su MATLAB. Fare clic qui per scaricare questo file.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.