Metodi per il test biomeccanico In Vivo su plexus brachiale in porcellini neoatali

Sommario

Qui sono presentati metodi per eseguire test biomeccanici in vivo su plexus brachiale in un modello di maialino neooatale.

Abstract

La paralisi del plesso brachiale neonatale (NBPP) è una lesione elastica che si verifica durante il processo di nascita nei complessi nervosi situati nelle regioni del collo e della spalla, collettivamente indicata come plesso brachiale (BP). Nonostante i recenti progressi nell'assistenza ostetrica, il problema di NBPP continua ad essere un onere sanitario globale con un'incidenza di 1,5 casi per 1.000 nati vivi. Tipi più gravi di questa lesione possono causare paralisi permanente del braccio dalla spalla in giù. La prevenzione e il trattamento di NBPP garantisce una comprensione delle risposte biomeccaniche e fisiologiche dei nervi BP appena nati quando sottoposti a stiramento. L'attuale conoscenza della BP appena nata viene estrapolata dal tessuto animale adulto o cadaverico BP invece del tessuto BP neonatale in vivo. Questo studio descrive un dispositivo di test meccanico in vivo e una procedura per condurre test biomeccanici in vivo in suinetti neotomotori. Il dispositivo è costituito da un morsetto, un attuatore, una cella di carico e un sistema di telecamere che applicano e monitorano ceppi e carichi in vivo fino al guasto. Il sistema di telecamere consente inoltre il monitoraggio della posizione di guasto durante la rottura. Nel complesso, il metodo presentato consente una caratterizzazione biomeccanica dettagliata della BP neoonale quando sottoposto a allungamento.

Introduzione

Nonostante i recenti progressi nell'ostetricia, il problema della NBPP causato da lesioni stretch al complesso BP continua ad essere un onere sanitario globale, con un'incidenza di 1,5 casi per 1.000 nati vivi^1,2. I fattori di rischio associati possono essere materni (ad esempio, peso eccessivo, diabete materno, anomalie uterine, storia della paralisi della BP), fetali (cioè macrosomia fetale) o legati alla nascita (cioè distocia della spalla, lavoro prolungato, erogazione assistita con pinze o estrattori di aspirazione del vuoto, Mentre queste complicazioni sono inevitabili in determinate circostanze, la prevenzione e il trattamento di NBPP garantisce una comprensione delle risposte biomeccaniche e fisiologiche della BP neoordinata quando sottoposta a stretching.

Studi biomeccanici riportati sul BP hanno utilizzato animali adulti e tessuto cadaverico umano e mostrano discrepanze significative^4,5,6^{,7,8,9,10,11,12,13,14,15}. La rilevanza clinica delle proprietà biomeccaniche del complesso tessuto BP garantisce un modello animale neooo-acqua e un approccio di test biomeccanici in vivo. Inoltre, le limitazioni con lo studio delle lesioni stretch BP in complicati scenari di consegna nel mondo reale aumentano la dipendenza da modelli computerizzati che forniscono metodi che consentono di studiare gli effetti di varie complicazioni e tecniche di consegna. La chiave per la rilevanza clinica di questi modelli è la loro biofedeltà (risposta umana). I modelli computazionali disponibili di Gonik et al.¹⁶ e Grimm et al.¹⁷ si basano sul tessuto nervoso di coniglio e ratto, ma non sul tessuto BP neooatale. L'esecuzione di test biomeccanici in vivo in un modello animale neoooonale clinicamente rilevante può colmare il divario critico di dati BP neoatali non disponibili.

Lo studio attuale descrive un dispositivo di test meccanico in vivo e una procedura per condurre test biomeccanici in maialini neonatale dello Yorkshire di 3-5 giorni. Il dispositivo è costituito da un morsetto, un attuatore, una cella di carico e un sistema di telecamere che applicano e monitorano i ceppi e i carichi in vivo durante il guasto. Il sistema di telecamere consente inoltre il monitoraggio della posizione di guasto durante la rottura. Nel complesso, il sistema consente una caratterizzazione biomeccanica dettagliata della BP neoalatale quando sottoposto a stiramento, fornendo così le sollecitazioni di soglia della BP e le sollecitazioni per guasti meccanici in vivo. I dati ottenuti possono migliorare ulteriormente il comportamento umano (biofedeltà) dei modelli computazionali esistenti che sono progettati per studiare gli effetti delle forze esogene ed endogene sull'estensione BP in scenari di consegna associati a NBPP.

Protocollo

Institutional Animal Care and Use Committee presso Drexel University ha approvato tutte le procedure (#20704).

1. Arrivo e acclimazione degli animali

1. Quarantena 1-2 maialini di giorno per almeno 24 ore dopo l'arrivo.
2. Casa suinetti in gabbie pulite e igienizzate in acciaio inossidabile (36 in x 48 in x 36 in) su biancheria da letto di truciolo di pioppo e mangime ad libitum con sostituto del latte di maiale.
3. Mantenere la temperatura ambiente a 85 gradi centigradi per garantire un ambiente termoneutro.

2. Giorno dell'Esperimento

1. Rimuovere il feed 2 h prima dell'esperimento.
2. Iniettare suinetti con un'iniezione intramuscolare di chetamina (10-40 mg/kg)/xylazina (1,5-3,0 mg/kg Di IM) e il trasporto tramite una gabbia di trasporto nello spazio chirurgico.

3. Induzione e manutenzione dell'anestesia

1. Somministratura 4% aneslazione islurane anestetico mescolato in ossigeno per cono naso e verificare che l'animale è profondamente anestetizzato valutando l'assenza di riflessi palpebrali e di ritiro.
2. Intubare l'animale posizionandolo in posizione supina e utilizzare una laringoscopio (lama dritta) per guidare il tubo di intubazione (diametro 2,5–2 mm) nella trachea.
3. Posizionare l'animale sul ventilatore una volta fissato il tubo di intubazione.
4. Assicurarsi che i suinetti ricevano una miscela di isoflurane (0,25%-3% di manutenzione), ossigeno e protossido di azoto.
5. Fornire una dose di fentanil (10 g/kg) e continuare a somminiferire una dose ogni 1–2 h per garantire una profondità adeguata di analgesia e sedazione ed evitare artefatti di movimento che potrebbero rischiare lo slovacco del tubo endotracheale.
6. Stabilire l'accesso endovenoso (IV) nella vena addominale sottocutanea o in qualsiasi altra vena periferica.
7. Stabilire la linea arteriosa attraverso l'arteria femorale. Questo può essere fatto in modo non invasivo o eseguendo un cut-down.

4. Monitoraggio e cura

1. Monitorare la profondità dell'anestesia confermando l'assenza di riflesso canthal e l'assenza di risposta di ritiro al pizzico dei diici.
2. Eseguire un monitoraggio continuo dei parametri fisiologici durante l'anestesia e durante l'esperimento, che include la pressione sanguigna arteriosa, l'elettrocardiografia (ECG), la CO di marea_{finale 2}, l'ossimetria dell'impulso e la temperatura corporea.
3. Monitora i gas sanguigni e gli zuccheri nel sangue ogni 0,5-1 h e dai fluidi endovenosi (50% di dextrose e 50% salina normale) agli animali anestesizzati più a lungo di 1 h a 100 cc/kg/giorno, se necessario, per garantire l'euglycemia.
4. Monitorare il piano anestetico dell'animale da vicino e frequentemente. Fornire analgesia e/o aumentare l'anestesia inalata.
5. Mantenere l'animale alla normale tensione di ossigeno controllando i parametri del ventilatore e i dosaggi di droga in base alle esigenze per garantire la normossia, quindi posizionare l'animale su una coperta d'acqua circolante regolata a temperatura in modo tale che la temperatura corporea normale sia mantenuta a 39 gradi centigradi per tutta la durata dell'esperimento.

5. Chirurgia del plesso brachiale

1. Posizionare l'animale in posizione supina sul tavolo operatorio dopo un'adeguata anestesia come descritto nella sezione 3, con l'arto superiore nel rapimento, esponendo la regione ascellare.
2. Utilizzare qualsiasi drappo chirurgico per coprire l'animale. Utilizzare tecniche pulite ma non sterili.
3. Esporre il complesso del plesso brachiale su entrambi i lati della colonna vertebrale facendo un'incisione mediana (utilizzando una lama #10) sulla pelle e fascia sovrastante la trachea, fino al terzo superiore dello sterno, corrispondente ai livelli della colonna vertebrale tra C3–T3.
4. Estrapolare l'incisione utilizzando le pinze e l'elocuma orizzontalmente su ciascun lato dalla tacca soprasternale lungo il bordo della clavicola fino al braccio superiore, risparmiando le vene cefaliche e basili.
5. Rilasciare i lembi superiori e inferiori per dissezione smussata utilizzando forbici e pinze, consentendo l'accesso alle regioni cervicali e toraciche del plesso brachiale, rispettivamente.
6. Identificare l'asse (C2) e la prima nervatura in corrispondenza del T1. Utilizzando questi punti di riferimento, identificare i tre cervi inferiori (C6-C8) e il primo forame vertebrale spinale toracico (T1), quindi esaminare attentamente il plesso per individuare le biforcazioni delle divisioni (forma M) per ottenere l'esposizione.
7. Etichettare (utilizzando anelli nervosi) le regioni del plesso brachiale sopra queste biforcazioni più vicine alla colonna vertebrale come radice / tronco ed etichettare quelli sotto queste biforcazioni come accordo seguito dal nervo, che si trovano più vicino al braccio.

6. Test biomeccanici

1. Configurazione del dispositivo di test biomeccanico
   NOT: Un dispositivo di test meccanico personalizzato è stato progettato e fabbricato per eseguire l'estensione in vivo della BP (Figura 1).
   1. Fissare la base del set-up a un carrello.
   2. Attaccare l'attuatore elettromeccanico sulla base utilizzando grandi morsetti a C. L'attuatore è in grado di fornire 150 libbre di forza, 10" corsa e velocità di 15 mm / s. La velocità può essere ridotta a 0,2 mm/s e può comunque funzionare come desiderato.
   3. Collegare la cella di carico 200 N all'attuatore.
   4. Fissare (screw-in) un morsetto alla cella di carico che consiste in plexiglass imbottito, che impedisce la concentrazione di sollecitazione nel sito di serraggio.
   5. Collegare una fotocamera a un treppiede. Assicurarsi che la fotocamera abbia la capacità di registrare fino a 120 f/s con una risoluzione di 658 x 4926 pixel.
   6. Collegare i cavi USB dalla fotocamera, dall'attuatore e dalla cella di carico al computer per integrare e sincronizzare tutti i componenti della configurazione.
   7. Collegare il computer, l'attuatore e la cella di carico in una fonte di alimentazione.
2. Calibrare la cella di carico prima di registrare i carichi applicati. A tale scopo, eseguire la procedura seguente:
   1. Impostare l'attuatore con un angolo di 90 gradi utilizzando la maniglia regolabile e controllando l'angolo con un goniometro.
   2. Aprire il software che funziona con la cella di caricamento (Tabella dei materiali). Premere il pulsante Start per visualizzare una lettura in tempo reale della tensione.
   3. Appendere i pesi dal morsetto che vanno da 0 a 1.000 g in incrementi di 100 g dalla configurazione e registrare le tensioni misurate.
   4. Calcolare l'equazione lineare delle tensioni e dei pesi trovando la pendenza (m) e l'intercetta (b). Questo viene fatto utilizzando un programma di foglio di calcolo e la funzione di pendenza inclusa per calcolare b dall'equazione 1 qui sotto. Inserire l'equazione 2 illustrata di seguito nel codice di impostazione meccanica.
      Equazione 1: b - y - mx
      Dove: y è il peso, x è la tensione, m è la pendenza e b è l'intercetta (costante).
      Equazione 2: y , mx e b
      Dove: y è il peso, x è la tensione, m è la pendenza e b è la costante.
3. Test: il nervo BP viene tagliato e ancorato al set-up di prova con un morsetto personalizzato.
   1. Tagliare il nervo BP con le forbici sottili.
   2. Bloccare il lato tagliato del nervo BP nel morsetto personalizzato, come illustrato nella Figura 1.
   3. Posizionare manualmente vernice acrilica nera o inchiostro indiano sul segmento BP bloccato (Figura 2).
   4. Posizionare una griglia di calibrazione, che è un righello di 1 cm, piatta all'interno dell'animale per impostare la scala per l'analisi dei dati.
   5. Utilizzare il software della fotocamera per visualizzare la posizione della telecamera direttamente sui segmenti testati, consentendo in tal modo il monitoraggio del movimento/spostamento dei marcatori e determinando l'effettivo ceppo tissutale in qualsiasi momento.
   6. Registrare le misure iniziali come l'altezza alla quale il nervo si inserisce nel corpo dal tavolo e l'altezza del morsetto dal tavolo, l'angolo dell'attuatore e l'intera lunghezza del tessuto.
   7. Aprire il software di programmazione (tabella contenente l'interfaccia utente grafica [GUI] come illustrato nella Figura 3).
   8. Eseguire la GUI premendo il pulsante Esegui.
   9. Inizializzare il sistema premendo il pulsante Initialize.
   10. Tare il sistema premendo il tasto Tare.
   11. Estendere il segmento BP premendo il pulsante di avvio del test. Questo tira il tessuto ad una velocità assegnata di 500 mm /min fino a quando non si verifica un guasto completo in qualsiasi segmento della BP. Questa velocità di estensione viene selezionata in base alla letteratura disponibile^4,8,18. Il programma salva anche un file video, il carico di tensile applicato, lo spostamento del tessuto e la durata del test.
   12. Registrare il sito di guasto, che è il punto in cui il tessuto si rompe.
4. Eutanasia: eutanasia suinetti alla fine dell'esperimento con una dose letale di pentobarbital (120 mg/kg i.v.).
5. Analisi dei dati: utilizzare un software di tracciamento del movimento per l'analisi dei video acquisiti durante il test.
   1. Aprire il file video dall'esperimento all'interno del software di tracciamento del movimento selezionando File Apri file video.
   2. Utilizzare la griglia di calibrazione per impostare la scala nel software di rilevamento del movimento utilizzando lo strumento Linea, facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla linea dopo che è stata disegnata, selezionando Calibrate Measure (Misura calibrata)e immettendo un valore noto in centimetri(Figura 4).
   3. Traccia i marcatori sul tessuto all'interno del software di tracciamento del movimento facendo clic con il pulsante destro del mouse sul video e selezionando Traccia traccia e allineando il centro del marcatore con il marcatore sul tessuto e virando fino alla rottura.
   4. Esportare le coordinate x e y dai marcatori selezionando Esporta file in foglio di calcolo in modo che possa essere utilizzato per calcolare i ceppi.
   5. Importare i dati in un software di programmazione per calcolare la distanza tra le coordinate x e y nel tempo per calcolare le sollecitazioni.
   6. Calcolare i valori di deformazione in ogni punto temporale dividendo la variazione di distanza per la distanza originale dopo aver tenuto conto dei cambiamenti di inclinazione durante l'allungamento. I valori di deformazione effettivi vengono determinati tra ogni coppia di marcatori adiacenti in ogni punto temporale. Viene calcolata anche la media di questi ceppi.

Risultati

Un grafico rappresentativo del tempo di carico e i ceppi di quattro segmenti di plexp BP (tra quattro marcatori) sono mostrati rispettivamente nella Figura 5 e nella Figura 6. Il carico di guasto ottenuto di 8,3 N al 35% di deformazione media di guasto riporta le risposte biomeccaniche di BP neooatale quando sottoposto a allungamento. Alcune regioni del nervo subiscono ceppi più elevati rispetto ad altre, indicative di lesioni no...

Discussione

La letteratura disponibile sulle risposte biomeccaniche di stretch sul tessuto BP presentano una vasta gamma di valori soglia così come discrepanze metodologiche^{4,6,8,18,19,20,21,22,23}. Le variazioni nei risultati pubblica...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Omega Subminature Tensione & Cella di carico a compressione	Omega	LCM201-200N	Cella di carico 200N
Telecamera Basler acA640-120uc
Attuatore lineare di feedback	Automazioni progressive	PA-14P	Corsa 10", forza 150 libbre, velocità 15 mm/s
Software di tracciamento del movimento	Kinovea	N/A
Software di programmazione open source - MATLAB	Mathworks	N/A	versione 2018A
Strumenti chirurgici
Pinze	Fine Science Tools Inc	11006-12 e 11027-12 o 11506-12
Emostatici	Fine Science Tools Inc	13009-12
Forbici Fine	Science Tools Inc	14094-11 o 14060-09