Identificazione delle proteine che interagiscono con fosfato inositolo o fosfonositide mediante matricografia affinità accoppiata a Blot occidentale o spettrometria di massa

Sommario

Questo protocollo si concentra sull'identificazione delle proteine che si legano ai fosfati inositoli o fosforoparassiti. Utilizza la cromatografia di affinità con fosfati inositoli biotinylati o fosforostostodi che vengono immobilizzati tramite streptavidin a agarose o perline magnetiche. Le proteine leganti al fosfato o fosfoinosazione sono identificate da gonfiore occidentale o spettrometria di massa.

Abstract

Fosfati inositoli e fosfoinossidi regolano diversi processi cellulari negli eucarioti, tra cui l'espressione genica, il traffico di vescicle, la trasduzione del segnale, il metabolismo e lo sviluppo. Questi metaboliti svolgono questa attività regolatrice legandosi alle proteine, cambiando così la conformazione proteica, l'attività catalitica e/o le interazioni. Il metodo qui descritto utilizza la cromatografia di affinità accoppiata alla spettrometria di massa o al gonfiore occidentale per identificare le proteine che interagiscono con fosfati inositoli o fosfoinossidi. I fosfati inositoli o fosforosati sono etichettati chimicamente con biotina, che viene poi catturata tramite streptavidina coniugata ad agarose o perline magnetiche. Le proteine sono isolate dalla loro affinità di legame con il metabolita, poi eluite e identificate da spettrometria di massa o gonfiore occidentale. Il metodo ha un flusso di lavoro semplice, non radioattivo, privo di liposomi e personalizzabile, che supporta con precisione l'analisi dell'interazione tra proteine e metaboliti. Questo approccio può essere utilizzato in metodi di spettrometria di massa quantitativa senza etichetta o con elementi aminoacidi per identificare le interazioni proteina-metabolita in campioni biologici complessi o utilizzando proteine purificate. Questo protocollo è ottimizzato per l'analisi delle proteine di Trypanosoma brucei, ma può essere adattato ai relativi parassiti protozoi, lieviti o cellule mammiferi.

Introduzione

I fosfati inositoli (IP) e le fosfoinosti (PI) svolgono un ruolo centrale nella biologia degli eucarioti attraverso la regolazione dei processi cellulari come il controllo dell'espressione genica^1,2,3, il traffico di vescicocchi ⁴, trasduzione del segnale^5,6, metabolismo^7,8,9, e lo sviluppo^8,10. La funzione regolatoria di questi metaboliti deri....

Protocollo

1. Analisi delle proteine che legano IP o PI mediante cromatografia di affinità e gonfiore occidentale

1. Crescita cellulare, lisi e cromatografia di affinità
   1. Coltivano le cellule T. brucei fino alla fase intermedia del log e monitorano la vitalità e la densità delle cellule. Un totale di 5,0 x 10⁷ celle è sufficiente per un saggio vincolante.
      1. Per le forme del flusso sanguigno, far crescere le cellule nei media HMI-9 integrati con 10% siero bovino fetale (FBS) a 37 e 5% di CO₂. Mantenere la densità delle celle tra 8,0 x 10^{da 5} a 1,6 x 10⁶ celle/mL.
         NOTA: la densità superio....

Risultati

Analisi dell'interazione RAP1 e PI(3,4,5)P3 mediante cromatografia di affinità e gonfiore occidentale
In questo esempio viene illustrata l'applicazione di questo metodo per analizzare l'associazione di PI da RAP1 da T. brucei lysate o dalla proteina ricombinante T. brucei RAP1. Lysates di T. brucei forme di flusso sanguigno che esprimono emagglutinina (HA) taggato RAP1 sono stati utilizzati nei saggi vincolanti. RAP1 è una proteina coinvolta nel controllo trascrizionale dei .......

Discussione

L'identificazione di proteine che si legano a IP o PI è fondamentale per comprendere la funzione cellulare di questi metaboliti. La cromatografia di affinità abbinata alla spettrometria di massa o macchia occidentale offre l'opportunità di identificare le proteine interagenti IP o PI e quindi di ottenere informazioni sulla loro funzione regolatoria. IP o PI etichettati chimicamente [ad esempio, Ins(1,4,5)P3 chimicamente collegati alla biotina] e incrociati alle perline di agarose tramite streptavidina o catturati da perl.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acetone	Sigma-Aldrich 650501		Chetone
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	271004	Solvente
Bicarbonato di ammonio	Sigma-Aldrich	A6141	a sali inorganici
Avanti J6-MI	Beckman Coulter	Avanti J6-MI	Centrifuga per grandi volumi (ad es. 1L)
Bottiglie per centrifuga	Sigma-Aldrich	B1408	Bottiglie per centrifugazione di 1L di perle di controllo della coltura
	Echelon	P-B000-1ml	Reagente per cromatografia di affinità - controllo
D-(+)-glucosio	Sigma-Aldrich	G8270	zucchero, aggiunto in PBS per mantenere vitali le cellule
ditiotreitolo (DTT)	Bio-Rad	1610610	Agente riducente
Dynabeads M-270 Streptavidin	ThermoFisher Scientific	65305	Perle di streptavidina per il legame ai ligandi della biotina
Inibitore della proteasi senza EDTA Cocktail	Roche	11836170001	Inibitori della proteasi Tampone
di corsa per elettroforesi	Bio-Rad	1610732	25 mM Tris, 192 mM glicina, 0,1% SDS, pH 8,3
Provette da centrifuga coniche Falcon 15 mL	Corning Life Sciences	430052	Per centrifugare colture da 10 mL Acido
formico Acido formico	Sigma-Aldrich	106526
Acid Glycine	Sigma-Aldrich	G7126	Terreno
coltura cellulare con aminoacidi HMI-9	ThermoFisher Scientific	ME110145P1	Terreno di coltura cellulare per T. brucei forme
del flusso sanguignoImperial Protein Stain	ThermoFisher Scientific	24615	Colorazione Coomassie per la rilevazione di proteine in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 Beads	Echelon	Q-B0145-1ml	Reagente per cromatografia di affinità
Istantaneo  Senza grassi Asciutto  Latte	Thomas Scientific	C837M64	Reagente bloccante per Western blotting
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I6125	Reagente alchilante per proteine o peptidi
di cisteina Lab  Rotatore	Thomas Scientific	1159Z92	Per saggi di legame
Provette per microcentrifuga LoBind	ThermoFisher Scientific	13-698-793	Provette a basso legame proteico per spettrometria di massa
Nonidet  P-40 (Igepal CA-630)	Sigma-Aldrich	21-3277	Detergente
PBS, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	10010031	Substrato fisiologico della
perossidasi per la chemiluminescenza	ThermoFisher Scientific	32106	Substrato per il rilevamento del Western bloting delle proteine
Compresse cocktail di inibitori della fosfatasi	Roche	Roche 4906845001	Phosphatase inibitori
PI(3)P PIP Beads	Echelon	P-B003a-1ml	Reagente per cromatografia di affinità
PI(3,4)P2 PIP Beads	Echelon	P-B034a-1ml	Reagente per cromatografia di affinità
PI(3,4,5)P3 diC8	Echelon	P-3908-1mg	Reagente per cromatografia di affinità
PI(3,4,5)P3 PIP Beads	Echelon	P-B345a-1ml	Reagente per cromatografia di affinità
PI(3,5)P2 PIP Beads	Echelon	P-B035a-1ml	Reagente per cromatografia di affinità
PI(4)P PIP Beads	Echelon	P-B004a-1ml	Reagente per cromatografia di affinità
PI(4,5)P2 diC8	Echelon	P-4508-1mg	Reagente per cromatografia di affinità
PI(4,5)P2 PIP Beads	Echelon	P-B045a-1ml	Reagente per cromatografia di affinità
PI(5)P PIP Beads	Echelon	P-B005a-1ml	Reagente per cromatografia di affinità
Soluzione di Ponceau S	Sigma-Aldrich	P7170	Colorazione delle proteine (0,1% [p/v] in acido acetico al 5%)
Esacianoferrato di potassio (III)	Sigma-Aldrich	702587	Sale di potassio
PtdIns PIP Beads	Echelon	P-B001-1ml	Reagente per cromatografia di affinità
Membrana in PVDF	Bio-Rad	1620177	per Western blotting
Centrifuga refrigerata	Eppendorf	5910 R	Microcentrifuga per piccoli volumi (ad esempio, 1,5 mL)
Sodio dodecil solfato	Sigma-Aldrich	862010	Detergente
Sodio tiosolfato	Sigma-Aldrich	72049	Chimico
Concentratori sottovuoto SpeedVac	ThermoFisher Scientific	SPD120-115	Concentrazione del campione (ad esempio, per spettrometria di massa)
Palloni T175 per colture cellulari	ThermoFisher Scientific	159910	Per coltivare 50 mL T. brucei coltura
Tripsina, spettrometria di massa Grado	Promega	V5280	Tripsina per la digestione delle proteine
Urea	Sigma-Aldrich	U5128	Reagente denaturante
Vortex	Fisher Scientific	02-215-418	Per reazioni di miscelazione
Western blotting tampone di trasferimento	Bio-Rad	1610734	25 mM di Tris, 192 mM di glicina, pH 8,3 con 20% di metanolo
Whatman  Carta da 3 mm	Sigma-Aldrich	WHA3030861	Carta per trasferimento Wester
2-mercaptoetanolo (14,2 M)	Bio-Rad	1610710	Agente riducente
2x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	161-0737	Tampone di caricamento delle proteine
4– 20% Mini-PROTEIFORME  Gel proteici prefabbricati TGX	Bio-Rad	4561094	Gel per elettroforesi proteica
4x tampone campione Laemmli	Bio-Rad	161-0747	Tampone di caricamento proteico

Centrifuga di