La fusione biologica della membrana è catalizzata da proteine di fusione specializzate. Misurare le proprietà fusogene delle proteine può essere ottenuto mescolando saggi. Vi presentiamo un metodo per purificare la Drosophila ricombinante atlastina, una proteina che media la fusione omotipica del ER, riconformandola in liposomi preformati e testando la capacità di fusione.
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Articolo metodologico
Ricostituzione assistita da detergenti della Drosophila ricombinante Atlastin in Liposomi per i saggi che mescolano i lipidi
In questo articolo
Sommario
Abstract
La fusione a membrana è un processo cruciale nella cellula eucarica. Proteine specializzate sono necessarie per catalizzare la fusione. Le atlastine sono proteine residenti nell'endoplasmico (ER) implicate nella fusione omotipica del ER. Abbiamo descritto qui un metodo per purificare un glutathione S-transferase (GST) e poli-istidina etichettato Drosophila atlastina da due cicli di cromatografia di affinità. Lo studio delle reazioni di fusione in vitro richiede l'inserimento di proteine di fusione purificate in un bistrato lipidico. I liposomi sono membrane modello ideale, come la composizione e le dimensioni dei lipidi possono essere regolati. A tal fine, descriviamo un metodo di ricostituzione mediante rimozione del detergente per la Drosophila atlastin a liposomi preformati. Sebbene siano disponibili diversi metodi di ricostituzione, la ricostituzione mediante rimozione del detergente presenta diversi vantaggi che lo rendono adatto per atlastini e altre proteine simili. Il vantaggio di questo metodo include un'elevata resa di ricostituzione e un corretto orientamento della proteina ricostituita. Questo metodo può essere esteso ad altre proteine della membrana e per altre applicazioni che richiedono proteoliposomi. Inoltre, descriviamo un saggio di miscelazione dei lipidi a base di FRET di proteoliposomi utilizzati come misura della fusione della membrana.
Introduzione
La fusione a membrana è un processo critico in molte reazioni biologiche. In condizioni biologiche, la fusione della membrana non è spontanea e richiede proteine di fusione specializzate per catalizzare tali reazioni1. Er fusione della membrana otipipica è mediata negli animali dal dinamino correlato GTPase atlastin2. Il ruolo di Atlastin nella fusione omotipica è fondamentale per le giunzioni a tre vie nel ER periferico, che costituisce una grande rete interconnessa di tubuli che si estendono in tutta la cellula. Atlastins hanno una morfologia di dominio conservato costituito da una grande GTPase, un dominio intermedio ....
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Protocollo
1. Purificazione di GST-DAtl-His8
-
Espressione proteica e preparazione del liscia
- Trasformare BL21 (DE3) E. coli con il costrutto GST-DAtl-His8 in pGEX4-T32 e selezionare su una piastra di ampicillina.
- Selezionare un singolo trasformativo e inoculato di 5 mL di LB - ampicillina (5 -L di 100 mg/mL di ampicillina) in un tubo di coltura da 14 mL e incubare a 25 mL con agitazione a 200 rpm per 6-8 h.
NOT: A causa dell'espressione che perde, non è consigliabile incubare a temperature più elevate. La crescita a 25 gradi centigradi riduce l'aggregazione di proteine durante questo periodo di cresc....
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Risultati
L'efficienza della ricostituzione atlastin è presentata nella Figura 2. I proteoliposomi ricostituiti sono stati galleggianti in un gradiente discontinuo iohexol. La proteina non incorporata è stata sedimentata nello strato inferiore (B) o nello strato intermedio (M). La proteina ricostituita fluttuerebbe verso lo strato superiore (T). I campioni del gradiente sono stati raccolti e analizzati da SDS-PAGE e Coomassie colorazione. La quantificazione del gel mediante densitometria mostra un'eff.......
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Discussione
I metodi qui delineano un metodo efficiente per purificare, riclassificare e misurare l'attività di fusione dell'atlastina ricombinante. Per garantire alte rese di atlastina funzionale alcuni passaggi critici devono essere considerati. L'espressione di atlastin deve essere fatta a basse temperature (16 ) per evitare l'aggregazione e si dovrebbe puntare a una concentrazione finale tra 0,4-1,5 mg/mL. Le proteine molto diluite non saranno ricostituite in modo ottimale a un rapporto tra 1:400 proteine e lipidi. L'efficienza .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Michael Stern e il suo laboratorio per le loro intuizioni e feedback su atlastin progetti correlati. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of General Medical Sciences [R01GM101377] e dall'Istituto Nazionale di Disturbi Neurologici e Ictus [R01NS102676].
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Colonne per cromatografia poly-prep da 10 mL | Biored | 731-1550 | |
| 10 mm x 75 mm Provette in vetro Flint | VWR | 608225-402 | |
| diametro 47 mm, 0,45 &; m pore whatman filtri a membrana sterile | Whatman | 7141 104 | |
| 96 pozzetti piastra bianca | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Disgregatore cellulare | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sale sodico)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Research organics inc. | 6381-92-6 | dell'acido etilendiamminotetraacetico |
| Roche | 11873580001 | Inibitore completo della proteasi | |
| Estrusore | Sigma Aldrich | Z373400 | Estrusore di base Liposofast |
| Sistema di cromatografia liquida GE Akta Prime | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Perle di agarosio | Glutatione Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glicerolo | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosina 5' trifosfato sale sodico idrato |
| HEPES, privo di acidi | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Colonna in resina per cromatografia di affinità con metalli immobilizzati (IMAC) | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP Colonne per cromatografia di affinità con metalli immobilizzati |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, senza diossano |
| L-Glutatione ridotto | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Cloruro di magnesio | Fisher | 7791-18-6 | |
| Metanolo | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-(7-nitro-2-1,3-benzossadiazol-4-il) (sale di ammonio)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecil β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Perle adsorbenti in polistirene non polare | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch policarbonato 19 mm 0.1 μ membrana a poro | m Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifuga | Beckman Coulter | ||
| Fosfatidilcolina, L-&alfa;-dipalmitoil [colina metil-3H] | ARC | ART0284 | Lipidi titolati |
| Lettore di piastre | TECAN | TECAN infinite Lettore | |
| POPC (1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Cloruro di potassio | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-(lissammina rodamina B sulfonil) (sale di ammonio)) | Avanti | 236495 | Rh-DPPE |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Soluzione di scintillazione per campioni acquosi o non acquosi |
| Scintillazione fiale | Beckman | 592928 | Tappo a rotazione rapida Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Trombina da plasma umano |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Provette da centrifuga ultra trasparenti 5 mm x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex da 9 a 13 mm Supporto per provette | VWR | 58816-138 | Inserto per vortice di tubi |
| di vetro flintFermo dell'inserto Vortex | VWR | 58816-132 | Fermo necessario per il supporto del tubo Vortex |
| VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 modello G560 | |
| β-mercaptoetanolo grado di biologia molecolare | Calbiochem | 444203 |
Riferimenti
- Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. Mechanics of membrane fusion. Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).
- Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin. Nature. 460, 978-983 (2009).
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Ristampe e permessi
