L'analisi di tick emolinfa rappresenta un'importante fonte di informazioni su come alcuni patogeni causano malattie e come le zecche rispondono immunologicamente a questa infezione. Il presente studio dimostra come inoculare propagule fungine e raccogliere emolinfa da Rhipicephalus MicroPlus femmine gonfio.
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Articolo metodologico
Rivelare la raccolta di hemolymph e l'inoculo di Metarhizium blastospores in Rhipicephalus MicroPlus zecche verso gli studi di patologia degli invertebrati
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le zecche sono ectoparassiti ematophagous obbligate e Rhipicephalus MicroPlus ha grande importanza nella medicina veterinaria perché provoca anemia, perdita di peso, deprezzamento della pelle degli animali e può anche fungere da vettore di diversi agenti patogeni. A causa dei costi esorbitanti per controllare questi parassiti, danni all'ambiente causati dall'uso improprio di acaricidi chimici, e la maggiore resistenza contro i parassiticidi tradizionali, il controllo alternativo delle zecche, con l'uso di funghi entomopatogeni, ad esempio, è stato considerato un approccio interessante. Tuttavia, pochi studi hanno dimostrato come il sistema immunitario del tick agisce per combattere questi entomopatogeni. Pertanto, questo protocollo dimostra due metodi utilizzati per l'inoculo entomopatogeno in femmine gonfio e due tecniche utilizzate per la raccolta di emolinfa e emociti raccolta. L'inoculo degli agenti patogeni all'inserimento delle gambe nel corpo della femmina di zecca consente la valutazione dei parametri biologici delle femmine a differenza dell'inoculo tra lo scutum e il capitulum, che danneggia frequentemente l'organo di Gené. La collezione di emolinfa dorsali ha prodotto un recupero di volume superiore rispetto alla raccolta attraverso le gambe. Alcune limitazioni di tick emolinfa raccolta ed elaborazione includono i) alti tassi di perturbazione degli emociti, II) contaminazione emolitiche con midgut interrotto, e III) recupero di volume di emolymph basso. Quando l'emolitia viene raccolta attraverso il taglio delle gambe, l'emolitico richiede tempo per accumularsi all'apertura della gamba, favorendo il processo di coagulazione. Inoltre, un minor numero di emociti si ottiene nella raccolta attraverso la gamba rispetto alla raccolta dorsale, anche se il primo metodo è considerato più facile da eseguire. Comprendere la risposta immunitaria nelle zecche mediate da agenti entomopatogeni aiuta a svelare la loro patogenesi e a sviluppare nuovi bersagli per il controllo delle zecche. I processi di inoculo qui descritti richiedono risorse tecnologiche molto basse e possono essere utilizzati non solo per esporre le zecche a microrganismi patogeni. Analogamente, la raccolta di tick emolinfa può rappresentare il primo passo per molti studi fisiologici.
Introduzione
La zecca del bestiame, Rhipicephalus MicroPlus, è un ematofago ectoparassite con un enorme impatto negativo sul bestiame nelle zone tropicali. Questo tick è il vettore di agenti patogeni come Babesia bovis, Babesia bigemina, e Anaplasma marginale che, combinato con il danno emofeeding diretto, può ridurre il latte e la produzione di carne, causare anemia e, infine, la morte. Le perdite causate da questo ectoparassite sono state stimate in 3,24 miliardi dollari all'anno in Brasile1. Sono richiesti metodi sostenibili e l'uso di agenti entomopatogeni è considerato un'alternativa promettente per ridurre l'uso di acaricidi chimici2,3,4.
I funghi entomopatogeni, come il Metarhizium spp., sono nemici naturali di artropodi tra cui zecche, e alcuni isolati possono essere utilizzati come biocontrollori. Questi patogeni infettano attivamente l'ospite attraverso la cuticola e colonizzano il loro corpo2,5,6. Come si sviluppa l'infezione, risposte cellulari e umorali sono mediate dal sistema immunitario tick. L'analisi del tick emolinfa è segnalata come uno strumento utile per valutare le risposte immunitarie dopo la sfida con i patogeni7,8.
La risposta immunitaria degli artropodi è divisa in risposte umorali e cellulari. La risposta umorale coinvolge i processi di emoagglutinazione e la produzione di proteine/peptidi antimicrobici, mentre la risposta immunitaria cellulare viene eseguita attraverso gli emociti. Queste cellule sono presenti nell'emolymph da tutti gli artropodi e sono segnalate per sviluppare un ruolo espressivo in studi che coinvolgono la risposta immunitaria innata9, in quanto è direttamente correlata alla fagocitosi e processi di incapsulamento. Di conseguenza, gli studi sugli emociti possono aiutare a indagare sulla via della morte e comprendere i processi come l'autofagia, l'apoptosi e la necrosi. In alcuni invertebrati come bivalvi, la raccolta degli emociti affronta limitazioni come la rottura delle cellule, il volume di emolymph basso ottenuto e la bassa concentrazione di cellule recuperate10. Molto frequentemente, a seconda della metodologia applicata, si ottiene una riduzione della concentrazione delle cellule, influenzando direttamente la quantificazione e l'analisi delle cellule.
Il numero di emociti circolanti nell'emolymph è variabile tra diversi artropodi e può cambiare nella stessa specie a causa di diversi stadi fisiologici come il sesso, l'età e la fase evolutiva dell'artropodi11. Gli emociti possono anche essere trovati aderiti ad alcuni organi ed essere rilasciati in circolazione subito dopo il processo di infezione11. Tuttavia, la maggior parte degli studi segnalati usano insetti, mentre le zecche rimangono meno esplorate per quanto riguarda la loro fisiologia e patologia. Nonostante l'inoculo patogeno e la raccolta di emolinfa nelle zecche sono tecniche meno utilizzate, stabilire metodi standard aiuta lo sviluppo di studi più accurati.
Lo scopo del presente studio è stato quello di confrontare i metodi più utilizzati per la raccolta di emolimph e l'inoculo di agenti patogeni nelle zecche R. MicroPlus , valutando l'efficacia nell'acquisizione di emolitiche e nella concentrazione di emociti.
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Protocollo
Le zecche utilizzate nel presente studio sono state ottenute da una colonia artificiale, mantenuto presso l'Università rurale federale di Rio de Janeiro, quali metodi sono stati approvati dalla Commissione per l'etica per l'uso di animali vertebrati (CEUA-IV/UFRRJ #037/2014).
1. Tick femmine inghiottite
- Dopo la raccolta di tick, lavare le femmine inghiottite utilizzando acqua di rubinetto e immergerli in 0,5% (v/v) soluzione di ipoclorito di sodio per 3 minuti in un 500 mL bicchiere di vetro ricevente, per l'igiene cuticola (Figura 1), quindi asciugare tutte le femmine utilizzando asciugamani di carta sterile (Figura 2).
- Dividere le femmine in gruppi ponderati omogenei (con 20 femmine ciascuna): un gruppo senza alcun trattamento, un gruppo di controllo inoculato con 5 μL di 0,1% di soluzione acquosa monooleata di poliossietilene sorbitano (v/v), e un gruppo infetto inoculate con 5 μL a 1,0 x 10 7 blastospores ml-1.
Nota: solo le zecche non trattate sono state utilizzate per il volume e la concentrazione di emociti. Sono stati eseguiti tre replicati di ogni gruppo.
2. l'inoculo dei patogeni tra lo scutum e il Capitulum
Nota: nel presente studio sono state utilizzate come esempio le sospensioni fungine entomopatogene.
- Sospendere le blastospores fungine in 1 mL di 0,1% di soluzione acquosa monooleata di poliossietilene sorbitano (v/v) e regolare ad una concentrazione finale di 1,0 x 107 blastospores ml-1. Aggiungere un'aliquota di 5 μL di Metarhizium blastospores (Figura 3) sospensione alla superficie di una pellicola di paraffina di plastica.
Nota: la sospensione di Metarhizium blastospores è stata regolata utilizzando una camera di Neubauer. Per accelerare il processo di inoculo, è possibile aggiungere più bolle alla superficie della pellicola di paraffina in plastica, ciascuna bolla corrispondente a 5 μL. - Utilizzare una siringa da 1 mL di insulina ultrafine e un ago da 0,3 mm per tirare la sospensione e inoculare nel segno di spunta. Ricordarsi di togliere tutta l'aria dalla siringa prima di utilizzarlo.
- Inoculare 5 μL di sospensione fungina nella femmina di zecca tra lo scutum e il Capitulum. Inoculare le femmine dal gruppo di controllo con 5 μL di 0,1% di soluzione acquosa monooleata di poliossietilene sorbitano (v/v) senza funghi.
Nota: un piccolo volume di emolymph può essere presente sul Foramen dopo l'inserimento dell'ago. Fare attenzione a non inoculare l'aria.
3. inoculazione di funghi entomopatogeni tra la coscia della gamba e il corpo della femmina di zecca
- Inoculare le femmine con sospensione fungina (5 μL a 1,0 x 107 blastospores ml-1) tra il Tigh della gamba e il corpo della femmina, utilizzando una siringa da 1 ml di insulina ultrafine accoppiata ad un ago da 0,3 mm. Inoculare le femmine dal gruppo di controllo con 5 μL di soluzione acquosa monooleata di poliossietilene sorbitano 0,1% (v/v).
Nota: quando l'inoculo di Metarhizium blastospores viene eseguito tra il Tigh della gamba e il corpo della femmina di zecca, un piccolo volume di emolymph può essere presente sulla Tigh dopo l'inserimento dell'ago. Fare attenzione a non inoculare l'aria.
4. collezione di emolinfa dorsal
- Utilizzare la parte in gomma di un set di infusione alato, un tubo capillare da 0,3 mm, e una punta filtrata per eseguire la raccolta di emolymph.
- Interrompere la cuticola dorsale femmina con un ago da 0,3 mm.
- Dopo la rottura, applicare una leggera pressione sulla parte anteriore del corpo della zecca. Osservare un liquido quasi trasparente tirando fuori dal sito di rottura. Raccogliere l'emolymph succhiando il liquido attraverso la punta del filtro accoppiato alla parte in gomma di un set di infusione alato, e un tubo capillare 0,3 mm.
Nota: non premere il corpo del tick difficilmente durante la sua immobilizzazione perché questo può disturbare il midgut e contaminare l'emolymph. Attendere che la pressione delicata possa espellere il fluido senza contaminazione.
5. collezione di hemolymph dalla gamba del tick
- Immobilizzare il segno di spunta, tagliare un pezzo di una gamba anteriore con un paio di forbici.
Nota: una o più gambe possono essere tagliate, così come, la stessa gamba può essere tagliata più di una volta. - Applicare una leggera pressione sulla parte posteriore del corpo del tick. Osservare una bolla liquida trasparente che si presenta sul sito di taglio e raccoglierlo con il tubo capillare, come descritto al passo 4,3.
Nota: non premere il corpo del tick difficilmente durante la sua immobilizzazione perché questo può disturbare il midgut e contaminare l'emolymph. Attendere che la pressione delicata possa espellere il fluido senza contaminazione.
6. elaborazione di hemolymph
- Dopo la raccolta di emolinfa, Depositalo in microprovette da 1,5 ml precedentemente riempite con 30 μl di cocktail proteasi e 82 μl di tampone salino. Tenere le microprovette su ghiaccio in tutta la collezione di emolitiche.
- Campioni centrifughe (500 x g per 3 min a 4 ° c). Dopo la centrifugazione dell'emolymph si formerà un soffice pellet di emociti.
Nota: per la quantificazione dell'emolitina, quantificare il volume emolitico ottenuto contando il volume totale all'interno del microtubo e conteggiando il volume di cocktail proteasi e tampone salino. - Rimuovere con cautela il surnatante (emolymph priva di cellule). Risospendere delicatamente le cellule, ad esempio, la coltura L-15 di Leibovitz è stata adattata a pH 7.0-7.2. Quantificano gli emociti posizionando 10 μL di emociti risospesi in una camera Neubauer.
7. preparazione del vetrino di campionamento degli emociti
- Taglia la gamba anteriore del tick con un paio di forbici.
- Applicare una leggera pressione sulla parte posteriore del corpo del tick. Osservare una bolla liquida trasparente che compare sul sito di taglio.
- Applicare le gocce di emolinfa direttamente su vetrini microscopio puliti, dopo di che, utilizzare metodi appropriati per macchiare le cellule.
- Per macchiare gli emociti usando Giemsa, asciugare l'emolitina sul vetrino per 30 minuti, fissarla a temperatura ambiente con metanolo per 3 minuti e macchiare in soluzione Giemsa (1:9 rapporto di soluzione tampone di Sorensen, pH 7,2) per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetrini con acqua corrente per rimuovere l'eccesso di colorante, asciugare l'aria e valutare le celle a 400x in un microscopio ottico.
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Risultati
Questo articolo si avvicina metodi di raccolta di inoculo e emolinfa applicati alle zecche. Dopo l'inoculo tra la coscia della gamba e il corpo della femmina di zecca, alcuni fluidi (emolymph) possono essere seccato durante il processo; Tuttavia, è importante notare che quando l'inoculo è terminato, non sono stati presenti liquidi o tessuti nella punta dell'ago o nel sito di inoculo, assicurando che la sospensione fungina sia stata completamente inoculata. Quando il processo di inoculo è ...
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Discussione
L'inoculo dei patogeni è utile quando lo studio mira a indagare l'azione in vivo dei microrganismi nei modelli sperimentali di artropodi perché assicura che l'agente patogeno sia all'interno dell'ospite. La tecnica può essere applicata anche a molecole inoculare come l'interferenza dell'RNA (RNAi). L'inoculo tra lo scutum e il Capitulum è considerato più facile da eseguire ma spesso danneggia l'organo di Gené, compromettendo la vitalità delle uova12,13. Organo di...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato finanziato in parte dal Coordenacão de aperfeiçoamento de pessoal de nível Superior (CAPES) dal Brasile, finanza Codice 001. CAPES ha fornito il dottorato di studio per A.F. Marciano. Ringraziamo il Consiglio nazionale per lo sviluppo scientifico e tecnologico (CNPq) del Brasile per aver fornito il dottorato di ricerca per J. Fiorotti. Questa ricerca è stata sostenuta anche da sovvenzioni della Fondazione Carlos Chagas Filho per la ricerca dello stato di Rio de Janeiro (FAPERJ) e CNPq. V.R.E.P. Bittencourt è un ricercatore CNPq.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione alcalina di ipoclorito | Sigma-Aldrich | A1727 | |
| D-(+)-Glucosio | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| EDTA | Synth | 2706 | |
| Siero fetale bovino | Gibco | 16000036 | |
| Gomma flessibile | BD | ||
| Giemsa colorante | Sigma-Aldrich | 48900-500ML-F | |
| Capillare in vetro | CTechGlass | CT95-02 | |
| Siringa da insulina (ago) | BD | SKU: 324910 | |
| KH2PO4 | Vetec | 60REAVET014512 | |
| Terreno di coltura L-15 di Leibovitz | Gibco | 11415-064 | |
| Metanolo | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Vetrini per microscopio | Kasvi | K5-7105 | |
| Microprovette | MARCA | Z336769-1PAK | |
| Na2HPO4 | Vetec | 60REAVET014593 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Camera di Neubauer | Kasvi | K5-0111 | |
| Penicillina | Gibco | 15140163 | |
| Cocktail di inibitori della proteasi | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 |
Riferimenti
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