Articolo metodologico

Una pipeline completa per l'isolamento e la sequenza dei microRNA e la loro analisi tramite gli strumenti open source

DOI:

10.3791/59901

⸱

21 agosto 2019

 ,  , 
1Division of Medical Genetics, University of Washington School of Medicine

In questo articolo

Sommario

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In questo articolo viene descritta una strategia dettagliata per l'isolamento di piccoli RNA, l'arricchimento dei microRNA e la preparazione di campioni per il sequenziamento ad alto valore di velocità effettiva. Viene quindi descritto come elaborare le letture di sequenza e allinearle ai microRNA, utilizzando strumenti open source.

Abstract

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La metà di tutte le trascrizioni umane sono pensati per essere regolati da microRNA. Pertanto, la quantificazione dell'espressione di microRNA può rivelare i meccanismi sottostanti negli stati della malattia e fornire obiettivi terapeutici e biomarcatori. Qui, dettagliamo come quantificare con precisione i microRNA. In breve, questo metodo descrive i microRNA isolanti, legandoli agli adattatori adatti per il sequenziamento ad alta velocità, amplificando i prodotti finali e preparando una libreria di esempio. Quindi, spieghiamo come allineare le letture di sequenziamento ottenute alle forcine a microRNA e quantificare, normalizzare e calcolare la loro espressione differenziale. Versatile e robusto, questo flusso di lavoro sperimentale combinato e analisi bioinformatica consente agli utenti di iniziare con l'estrazione dei tessuti e finire con la quantificazione dei microRNA.

Introduzione

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Scoperto per la prima volta nel 19931, si stima che quasi 2000 microRNA siano presenti nel genoma umano2. I microRNA sono piccoli RNA non codificanti che sono in genere lunghi 21-24 nucleotidi. Sono regolatori post-trascrizione dell'espressione genica, spesso legandosi a siti complementari nella regione 3-non tradotta (3-UTR) di geni bersaglio per reprimere l'espressione proteica e degradare l'mRNA. La quantificazione dei microRNA può fornire informazioni preziose sull'espressione genica e sono stati sviluppati diversi protocolli a questo scopo3.

Abbiamo sviluppato un p....

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Protocollo

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Gli esperimenti sugli animali sono stati autorizzati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Washington.

Preparazione della libreria di RNA piccolo

1. Isolamento dell'RNA

  1. Isolare l'RNA da una fonte biologica utilizzando un reagente di isolamento dell'RNA standard, o un kit che arricchisce per i microRNA. Per i tessuti, è meglio iniziare con campioni snap-congelati in azoto liquido e macinato in polvere utilizzando un mortaio pre-freddo e pestello.
  2. Misurare l'integrità dell'RNA di ogni campione su uno strumento in grado di ....

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Risultati

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Schemadei passaggi coinvolti nella preparazione della libreria
Uno schema generale di piccola estrazione dell'RNA, sequenziamento e allineamento è delineato nella figura 2.
Campioni di fegato da un maschio e un topo femmina sono stati raccolti e scattare congelati in azoto liquido. L'RNA totale è stato estratto e valutato per qualità e concentrazione.

Il sequenziamento.......

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Discussione

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Nonostante l'identificazione di microRNA oltre 20 anni fa13, il processo di sequenziamento dei microRNA rimane laborioso e richiede attrezzature specializzate, impedendo ai laboratori di adottare regolarmente protocolli interni14. Altre tecniche possono valutare simultaneamente microRNA, come microarray di microRNA e pannelli di espressione multiplexed; tuttavia, questi approcci sono limitati in quanto quantificano solo i microRNA presenti nel loro set di sonde. Per questo .......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo i membri dei laboratori di Andrew Fire e Mark Kay per la guida e i suggerimenti.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Scala DNA 100 bpNEBN3231
19:1 bis-acrilammideMillipore SigmaA9926
Scala a pioli DNA 25 bpPromegaG4511
Fenolo/cloroformio acidoThermoFisherAM9720
Colorante di caricamento RNA acrilammideThermoFisherR0641
Persolfato di ammonio (APS)Biorad161-0700
Strumento bioanalizzatoreAgilentG2991AAPer la valutazione della qualità e della concentrazione dell'RNA
CloroformioFisher ScientificC298-500
Etanolo (100%)SigmaE7023
Gel Loading Buffer IIThermoFisherAM8547
GlycoBlueThermoFisherAM9516Il colore blu aiuta a visualizzare il pellet
HClSigma320331
KOHSigmaP5958
Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cmGenesee45-109
miRVanaSistema ThermoFisherAM1560
miSeqIlluminaSY-410-1003Per generare piccoli dati
NaClFisher ScientificS271-500
Nusieve agarosio a basso punto di fusioneLonza50081
Parafilm (pellicola sigillante da laboratorio)Millipore SigmaP7793
Polietilenglicole 8000NEBincluso con M0204
ProtoScript II Kit di sintesi di cDNA a primo filamentoNEBE6560S
QIAquick Gel Kit di estrazioneQiagen28704
Qubit FluorimetroThermoFisherQ33226Per quantificare la concentrazione di DNA
Qubit RNA HS Kit di analisiThermoFisherQ32855
Lamette da barbaFisher Scientific12640
Siliconato a bassa ritenzione Provette da 1,5 mlFisher Scientific02-681-331
T4 RNA ligasi 1NEBM0204
T4 RNA Ligasi 2, troncato K227QNEBM0351S
TapeStationAgilentG2939BAPer valutare la qualità e la concentrazione dell'RNA
Taq DNA polimerasiNEBM0273X
TEMEDBiorad161-0800
Tris Base pH 7,5Sigma10708976001
EDTA Tris-bufferedSigmaT9285
TrizolThermoFisher15596026
UltraPure Ethidium bromuro (10 mg/ml)Invitrogen15585-011
Linker clonante universale di miRNANEBS1315S
UreaSigmaU5378
Kit di isolamento per microRNA di sequenziamento dell'RNA

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
  2. Bartel, D. P. Metazoan MicroRNAs. Cell. 173 (1), 20-51 (2018).
  3. Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., B....

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Isolamento del microRNAsequenziamento dell RNApurificazione su gelligazione degli adattatoritrascrizione inversaamplificazione PCRpurificazione su gel di agarosioanalisi bioinformaticaallineamento delle sequenzeespressione differenziale

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