Questo articolo rappresenta un utile saggio in vitro per valutare la capacità del mezzo condizionato dalle cellule tumorali per attirare i macrofagi.
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Articolo metodologico
In Vitro Analisi per studiare l'interazione tumora-macrophage
In questo articolo
Sommario
Abstract
I macrofagi associati al tumore (TAM) rappresentano una grande percentuale di cellule nella massa tumorale per diversi tipi di cancro. Glioblastoma (GBM), un tumore maligno al cervello senza cura, ha fino a metà dei ARM di massa tumorale. I TAM possono essere pro-tumorale o anti-tumorale, a seconda dell'attivazione di geni specifici nelle cellule. Le mutazioni genetiche nei tumori, attraverso la regolazione dell'espressione della citochina, possono influenzare il reclutamento di TAM nel microambiente tumorale. Qui, descriviamo un saggio quantitativo basato sulle cellule per valutare il reclutamento di macrofaci da parte del mezzo condizionato dalle cellule tumorali. Questo analisi utilizza la linea cellulare del macrofago umano MV-4-11 per studiare l'attrazione dei macrofazaggi da parte del mezzo condizionato dal glioblastoma, consentendo un'elevata riproducibilità e bassa variabilità. I dati generati con questo saggio possono contribuire a una migliore comprensione dell'interazione tra il tumore e il microambiente tumorale. Un saggio simile può essere usato per valutare l'interazione tra le cellule tumorali e altre cellule immunitarie, comprese le cellule T e le cellule killer naturali (NK).
Introduzione
I macrofagi sono cellule immunitarie con un'elevata eterogeneità fenotipica e funzionale1. Essi svolgono ruoli importanti nei sistemi di difesa ospite, riparazione dei tessuti, sviluppo e progressione del tumore1. I TAM sono macrofagi nel microambiente dei tumori solidi. Alcuni TAM possono promuovere la crescita tumorale inibendo l'attività citotossica mediata dalle cellule T, modulando il microambiente tumorale (TME), promuovendo l'angiogenesi, l'invasione e la metastasi2,3,4, 5. I TAM sono tr....
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Protocollo
1. Preparazione media
-
Preparazione del mezzo di cellule staminali senza siero
- Scongelare il supplemento 50x B27, il fattore di crescita epidermico (EGF, 20 g/mL in acido acetico 10 mM con 0,1% BSA) e il fattore di crescita del fibroblasto (FGF, 20g/mL in 10 m di acido acetico con 0,1% BSA).
- Aggiungere 500 l di EGF (concentrazione finale 20 ng/mL), 500 lof di FGF (concentrazione finale 20 ng/mL), 10 mL da 50x B27 a 500 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) e 5 mL di 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strepp). Invertire la bottiglia 4-6 volte per mescolare, filtrare sterilizzare attraverso....
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Risultati
I risultati sono di solito mostrati tramite grafici a barre (esempio mostrato Figura 1). I campioni con valori elevati di 480/520 indicano che il supporto condizionato ha un'elevata capacità di reclutare macrofagi. A seconda delle esigenze sperimentali, possono essere inclusi controlli aggiuntivi. Ad esempio, si possono usare anticorpi neutralizzanti per trattare i media condizionati per abolire il macrofalo chemiotassi, ed eseguire lo stesso saggio. Si posso.......
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Discussione
In questo protocollo, ci sono diversi passaggi chiave: 1) selezione dell'inserto Transwell. Per la linea cellulare MV-4-11, 5 inserti Transwell m funzionano bene. Tuttavia, per altre linee cellulari come la linea cellulare monocito comunemente usata THP-1, una dimensione diversa dei pori potrebbe funzionare meglio. 2) Man mano che linee cellulari diverse crescono a velocità diverse, è importante regolare il volume dei supporti condizionati in base ai numeri di cellulare. A tale scopo, i supporti privi di cellule incubati.......
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Dichiarazioni
William A. Weiss è co-fondatore di StemSynergy Therapeutics. Non c'è niente da rivelare.
Ringraziamenti
Grant Support: Un ha ricevuto il sostegno di Alex's Lemonade Stand Foundation, American Brain Tumor Association, NIH T32CA108462 e Program for Breakthrough Biomedical Research, che è parzialmente finanziato dalla Sandler Foundation. W. Weiss è stato supportato da sovvenzioni NIH R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103; la Samuel G. Waxman Cancer Research Foundation; e la sedia Evelyn e Mattie Anderson.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,1 μ m tazza di filtrazione | Thermo fisher | 566-0010 | |
| 0.45 μ m unità filtrante | Millipore | SLHA033SS | |
| pipette sierologiche da 10 mL | Olympus plastics | 12-104 | |
| provette da centrifuga sterili da 15 mL | Olympus plastics | 28-103 | |
| puntale per pipetta da 1 mL | ART molecular bioproducts | 2779-RI | |
| pipetta aspirante da 2 mL | Falcon | 357558 | |
| piastra a 24 pozzetti | Millipore | ECM507 | Fa parte di ECM507, o può essere acquistato separatamente |
| 4x tampone di lisi | Millipore | ECM507 | Parte di ECM507, o può essere acquistato separatamente |
| 5 μ m Inserto Transwell | Millipore | ECM507 | Parte di ECM507, oppure può essere acquistato separatamente |
| Pallone da 75 cm2 | Corning | 430641U | |
| Accutase | Tecnologie cellulari innovative | AT-104 | |
| B27 | Gibco | 12587-010 | |
| CyQuant Dye | Millipore | ECM507 | Parte di ECM507, oppure può essere acquistato separatamente |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 10565-018 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| FGF | Peprotech | 100-18B | |
| IMDM | Gibco | 12440-053 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Penna Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypan blu | Biorad | 1450021 |
Riferimenti
- Liu, Y., Cao, X. The origin and function of tumor-associated macrophages. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 1-4 (2015).
- Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Front....
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Ristampe e permessi
