Method Article

Visualizzazione delle dinamiche del recettore a cellule T di superficie in modo quad-dimensionale utilizzando la microscopia A fogli di luce a reticolo

DOI:

10.3791/59914

⸱

January 30th, 2020

 , 
1Committee on Cancer Biology, The University of Chicago, 2Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago

In This Article

Summary

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L'obiettivo di questo protocollo è quello di mostrare come utilizzare la microscopia Lattice Light-Sheet per visualizzare in modo quadridimensionale le dinamiche del recettore superficiale nelle cellule vive. Qui vengono mostrati i recettori delle cellule T su CD4- cellule T primarie.

Abstract

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La segnalazione e la funzione di una cellula sono dettate dalle strutture dinamiche e dalle interazioni dei suoi recettori superficiali. Per comprendere veramente la relazione struttura-funzione di questi recettori in situ, dobbiamo visualizzarli e tracciarli sulla superficie della cellula viva con una risoluzione spatiotemporale sufficiente. Qui mostriamo come utilizzare la microscopia Lattice Light-Sheet (LLSM) recentemente sviluppata per immagini di recettori delle cellule T (TCR) in quarta dimensione (4D, spazio e tempo) alla membrana cellulare attiva. Le cellule T sono una delle principali cellule efcomeotrici del sistema immunitario adattivo, e qui abbiamo usato le cellule T come esempio per dimostrare che la segnalazione e la funzione di queste cellule sono guidate dalle dinamiche e dalle interazioni dei TCR. LLSM consente l'imaging 4D con una risoluzione spatiotemporale senza precedenti. Questa tecnica di microscopia può quindi essere generalmente applicata a una vasta gamma di molecole superficiali o intracellulari di cellule diverse in biologia.

Introduction

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La dinamica precisa del traffico e della diffazione delle molecole sulla superficie cellulare tridimensionale in tempo reale è stata un enigma da risolvere. La microscopia è sempre stata un equilibrio di velocità, sensibilità e risoluzione; se uno o due sono ingranditi, il terzo viene ridotto a icona. Pertanto, a causa delle piccole dimensioni e dell'immensa velocità con cui i recettori di superficie si muovono, il monitoraggio delle loro dinamiche è rimasto una grande sfida tecnologica per il campo della biologia cellulare. Ad esempio, molti studi sono stati condotti utilizzando la microscopia a fluorescenza interna totale (TIRF)1,<....

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Protocol

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5C. C7-transgenico TOpo rag2 knockout in B10. Uno sfondo è stato utilizzato in questo studio secondo un protocollo approvato dal Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università di Chicago.

1. Raccogliere e attivare le cellule T

NOTA: questa parte del protocollo si basa su protocolli precedenti. Vedere citazioni per ulteriori dettagli20,21.

  1. Eutanasia un 5C di 10-12 settimane. C7 topo transgenico di entrambi i sessi (20-25 g) secondo il protocollo Approvato IACUC (cioè la camera CO2 seguita dalla lussazione cervicale).
    2. ....

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Results

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Qui, descriviamo l'isolamento, la preparazione e l'imaging del mouse primario 5C. C7 cellule T utilizzando un microscopio a fogli di luce reticolo. Durante la sezione 3, è imperativo allineare correttamente il microscopio e raccogliere PSF ogni giorno con cui deconvolve i dati dopo la raccolta. Nella Figura 2, vengono mostrate le immagini di allineamento corrette che verranno visualizzate durante l'allineamento del microscopio. Figura 2A e

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Discussion

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Il protocollo presentato è stato ottimizzato per l'utilizzo di cellule CD4- T isolate da 5C. I topi transgenici C7 sullo strumento LLSM utilizzati, e quindi altri sistemi cellulari e LLSM potrebbero dover essere ottimizzati in modo diverso. Tuttavia, questo protocollo mostra la potenza dell'imaging 4D, in quanto può essere utilizzato per quantificare la dinamica di un recettore superficiale su un'intera cellula con la minima distorsione in condizioni fisiologiche. Pertanto, ci sono molte possibili applicazioni.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Vorremmo riconoscere i consigli e la guida del Dr. Vytas Bindokas presso l'Università di Chicago. Ringraziamo l'Integrated Light Microscopy Core Facility dell'Università di Chicago per aver sostenuto e mantenuto il microscopio a fogli luminosi a reticolo. Questo lavoro è stato sostenuto dal NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 e dal NSF Career Award 1653782 (A J.H.). J.R. è supportato dal NSF Graduate Research Fellowships Program.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Siringa da 1 mLBD309659Per la raccolta di cellule T
2-MercaptoetanoloSigma-AldrichM3148-25MLPer la coltura di cellule T
Vetrini coprioggetto rotondi da 5 mm WorldPrecision Instruments502040Per l'imaging
Filtro cellulare sterile da 70 umCorning7201431Per la raccolta di cellule T
Alexa Fluor 488 anti-topo TCR e beta; anticorpo a catenaBioLegend109215 per l'imaging
del siero fetale bovino (FBS)X& Coltura cellulare YFBS-500Per la coltura di cellule T
FicollGE Healthcare17-1440-02Reagente a gradiente Denisty per la raccolta di cellule T
Sale sodico di fluoresceinaSigma-AldrichF6377Per l'allineamento al microscopio
FluoSpheres Microsfere modificate con carbossilatoThermo Fisher ScientificF8810Per l'allineamento al microscopio
ImarisBitplane/ASoftware di tracciamento; Altre opzioni per il software di tracciamento includono Amira o Trackmate (Fiji).
Microscopio a foglio luminoso a reticolo3iN/AMicroscopio utilizzato
Leibovitz's L-15 Medium, senza rosso fenoloThermo Fisher Scientific21083027per l'imaging
L-glutamminaThermo Fisher Scientific25030-081per coltura di cellule T
LLSpyJanelia Research CampusN/ALLSpy è stato utilizzato su licenza dell'Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contatta innovation@janelia.hhmi.org per l'accesso. Altri metodi di deconvoluzione e deksewing sono disponibili in software di elaborazione delle immagini come Fiji, Slidebook, Amira e altri. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
Moth Cytochrome C (MCC), sequenza ANERADLIAYLKQATKElimbioSintesi personalizzataper la raccolta di cellule T
Penacillina/StreptamicinaLife Technologies15140122_3683884612Per la coltura di cellule T
Poli-L-lisinaPhenix Research ProductsP8920-100MLPer l'imaging
Tampone di lisi dei globuli rossieBioscience00-4300-54Per la raccolta di cellule T
Topo ricombinante IL-2Sigma-AldrichI0523Per la coltura di cellule T
RPMI 1640 MediumCorningMT10040CVPer la coltura di cellule T
Slidebook3iN/ALLSM software di imaging
Strumentidi dissezione chirurgicaNova-Tech InternationalDSET10Per la raccolta di cellule T
Fiasche T-25Eppendorf2231710126Per la coltura di cellule T
Thermo Scientific Pierce Fab Micro Kit di preparazioneThermo Fisher Scientific44685Per la preparazione di Fab
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References

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  1. Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, Clifton, N.J. 1-23 (2015).
  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z.

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Lattice Light Sheet MicroscopyT Cell Receptor DynamicsFour Dimensional ImagingLive Cell ImagingSpatiotemporal ResolutionCell Surface ReceptorsFluorescent LabelingDensity Gradient CentrifugationBeam Alignment ProtocolPSF Collection

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